重楼属植物分子生物学研究进展

重楼属植物是重要的药用类群,其分子生物学领域的研究受到了广泛关注.开展重楼属植物研究,不仅具有重大科学意义,而且具有重要的经济和生态价值.从分子标记、分子鉴定、系统进化与谱系地理学、转录组学、蛋白质组学、基因克隆与功能研究等方面对重楼属植物的分子生物学研究进展进行综述,并就当前亟需解决的问题进行了探讨,以期为加快分子生...     

基于叶绿体matK基因序列探讨10种石杉科石杉属植物的系统关系及分子鉴定

目的:利用叶绿体matK基因序列探讨10种石杉属植物的系统发育及分子鉴定.方法:分别从9种石杉属植物中提取总DNA,经扩增纯化后,用PCR产物直接测序.结果:对石杉属Huperzia Bernh.9个种的叶绿体matK基因进行了测序,序列长度为1 589 bp,并对10个种(亮叶石杉H.lucidula的matK基因序列从GenBank中下载)的matK序列进行比对,其中有35个系统发育信息位点及35个变异位点,以垂穗石松Lycopodiella cernua为外类群,利用MEGA 3.1软件计算种与种之间的遗传距离在1.59%～0.25%,并构建系统树,获得最简约树和邻接树.结论:小杉兰组和蛇足石杉组植物分别聚成一枝,构成姊妹群,其靴带支持率分别为98%和99%.长柄石杉与蛇足石杉分别聚在2个不同进化枝,二者间有19个碱基差异,遗传距离为1.21%.建议应将长柄石杉单独列为一个种.     

重楼属植物遗传多样性的RSAP标记

目的:研究重楼属植物DNA指纹图谱,初步探讨RSAP分子标记技术在重楼属植物遗传多样性研究上的应用.方法:采用限制性位点扩增多态性(restriction site amplification polymorphism,RSAP)技术对重楼属8个种进行基因组DNA多态性分析.结果:用10条RSAP引物即选出18对引物组合构建了8个种的DNA指纹图谱.通过遗传距离构建系统进化树,重楼属8个种的进化关系得到了很好的分辨.结论:RSAP标记能够对重楼属植物进行准确的分子鉴定,为重楼属中药材的种类鉴定和种间的分类地位提供分子生物学依据.     

几种重楼属植物的POD同工酶分析

目的通过对几种重楼属植物间同工酶的分析,了解不同种重楼在分子生化水平上的差异。方法采用垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳技术,对野外收集回的六种重楼的叶片进行过氧化物酶（POD）同工酶的测定比较。结果POD同工酶在不同种、变种或变型间存在差异。通过对差异的表现分析,用以进行比较的六种重楼间的亲缘关系与李恒先生在《重楼属植物》一书中对重楼属植物的分类相一致。结论重楼属内不同的类群常有很大的变异,利用同工酶分析技术,可以区分类群间及类群内不同种之间的内在差异大小,从而为重楼的鉴定、分类以及重楼的野生驯化提供一定的理论参考依据。     

基于CDDP标记的重楼属种质资源鉴定及遗传多样性分析

目的研究重楼属植物遗传多样性,并为其种质资源的快速鉴定提供有效方法。方法采用CDDP分子标记方法对13份不同的重楼种质资源的遗传多样性进行分析,并按照CODE128条形码编码规则为重楼属植物进行编码。结果 11条引物共扩增了80个条带,其中多态性条带73个,多态性比率91.25%,等位基因数(Na)为1.912 5,有效等位基因数(Ne)为1.589 6,Nei’s遗传多样性指数(H)为0.342 3,Shannon信息指数(I)为0.507 0。UPGMA聚类分析表明,重楼属植物遗传多样性丰富。在CDDP分子标记的基础上依据CODE128条形码编码规则为重楼属植物构建了条形码分子身份证。结论重楼属资源遗传多样性丰富,CDDP分子标记可用于重楼属种质资源的鉴定及遗传多样性分析,且构建的条形码分子身份证检测灵敏、快捷,可用于相关科研工作和工业生产中重楼属植物的鉴定。     

陕西产重楼属种质资源的SCoT遗传多样性分析

目的对陕西产重楼属6个类群的遗传多样性和亲缘关系进行分析。方法采用SCoT分子标记技术和非加权平均距离法(UPGMA)对陕西产重楼属6个类群48份样品进行遗传多样性和聚类分析。结果从82条SCoT引物中共筛选出12条多态性稳定、清晰的引物,48份重楼样品共扩增出152个DNA片段,多态性片段数为135,平均每个引物扩增出12.67个DNA片段,其多态性为88.82%;重楼属植物在物种水平上具有较高的遗传多样性,Nei’s基因多样性指数(H)为0.267 4,Shannon指数(I)平均值为0.404 1,居群间遗传分化系数(Gst)为0.517 9,种群间基因流(Nm)为0.465 4;6个类群重楼按遗传多样性水平排序为七叶一枝花宽叶重楼具柄重楼狭叶重楼宽瓣重楼北重楼,聚类分析可将北重楼组和其他重楼组区分开来,当遗传距离一定时,重楼属6个类群被完全区分开来。结论 SCoT分子标记可获得多态性丰富、清晰的条带扩增图谱,表明该技术可用于陕西产重楼属主要类群物种分子鉴定和亲缘关系研究,为筛选与药典收载种类近缘的可替代资源种类、指导合理利用地方种类自然资源提供了科学依据。     

武当山区重楼属植物基于ITS2的种内鉴别研究

目的对武当山区重楼属植物进行种内分子鉴定研究,以DNA条形码技术解决重楼因种内形态差异小而难以鉴别的问题,规范重楼的正品来源,确保本地药材的质量以及临床用药的有效性。方法对ITS(internal transcribed spacers)序列进行克隆测序,以核基因ITS2片段作为DNA条形码,对研究材料进行PCR(polymerase chain reaction)扩增并双向测序,所得序列经Codon Code Aligner拼接后,用软件MEGA6.0(Molecular Evolutionary Genetics Analysis 6.0)进行相关数据分析,并构建NJ邻接树(neighbor-joining tree),利用Keller等建立的ITS2数据库及其网站预测ITS2的二级结构。结果经BLAST鉴定,采集的武当山区重楼样本来源准确;武当山区重楼属植物ITS2序列长度均为232 bp,与七叶一枝花的基因序列相比,球药隔重楼有16个变异位点,华重楼只有1个变异位点;武当山区重楼的ITS2序列种内K2P(Kimura-2-parameter)距离为0~0.073 6,种内平均K2P距离为0.027 2;由所构建的系统聚类树可以看出,本地区重楼主要分为七叶一枝花和球药隔重楼2大类,华重楼为七叶一枝花的变种,宽叶重楼、狭叶重楼与七叶一枝花为一支,不支持宽叶重楼、狭叶重楼成为独立的变种;比较ITS2二级结构发现,武当山区重楼属植物螺旋区的茎环数目、大小、位置有明显差异。结论 DNA条形码为重楼属药用植物鉴别开辟一条新途径,不论是相似性搜索法、最近距离法还是NJ系统发育树等方法,其分析结果均充分表明,ITS2序列可将不同品种重楼药材很好地区分开;七叶一枝花、狭叶重楼、宽叶重楼的ITS2基因232个碱基序列完全相同,MEGA 6.0的分析结果也表明宽叶重楼、狭叶重楼与七叶一枝花属于一支,不支持宽叶重楼、狭叶重楼成为独立的变种,建议作为七叶一枝花的变型处理;ITS2作为DNA条形码序列能够有效地区别重楼属植物,在中药材的鉴定中具有重要的应用前景,在实现规范化种植规程中可用于种质种源的正确鉴定。     

石斛属几种植物遗传关系的SRAP和RAPD比较分析

目的 利用SRAP和RAPD两种分子标记技术对9份石斛种质进行遗传多样性研究.方法 用40对SRAP引物组合和36个RAPD引物分别对供试石斛的基因组DNA进行扩增.结果 SRAP引物组合共扩增条带1 977条,多态性比率为90.2%,遗传相似系数GS值变化范围为0.330 2～0.789 2.RAPD引物共扩增出281条带,多态性比率为87.1%,GS值变化范围为0.494 2～0.773 1.利用两种标记得到的聚类结果存在一定的差异,SRAP聚类结果与传统的基于形态特征建立的分类结果比较一致,较好地体现了供试品种的亲缘关系、地域特性.在9个石斛供试种间,SRAP的标记指数MI值(16.46)是RAPD标记MI值(3.67)的4.5倍,表明SRAP具有更大的标记效率.结论 两种标记皆可有效应用于该属植物种质资源的遗传多样性分析.而SRAP标记在石斛的遗传多样性与亲缘关系的研究中,则表现出了极大的优越性.     

雷公藤属3种植物遗传关系与遗传多样性的BAPD分析

目的：阐明雷公藤属植物的遗传关系和遗传多样性。方法：用RAPD分子标记方法研究来自雷公藤属植物3个种4个类型24个居群的110个样本。结果和讨论：从100个随机引物中筛选出10个引物,得到128条带,其中多样性条带123个,占96%。通过聚类分析可以看出,东北雷公藤明显与其他种有显著的遗传差异;中间类型和雷公藤的关系较与昆明山海棠的关系更密切,但中间类型和雷公藤之间也有明显的遗传分化,且中间类型呈现较雷公藤复杂的遗传多样性,不同的中间类型居群与雷公藤的关系远近不同。大量的中间类型的存在,连接了昆明山海棠与雷公藤这2个种,从分类上建议将2个种合并。将除去东北雷公藤的其他居群作为一个整体分析,居群间分化明显,遗传多样性主要存在于居群间,因此应当收集不同来源的种质以保存尽可能多的遗传多样性。     

基于叶绿体matK基因序列探讨10种石杉科石杉属植物的系统关系及分子鉴定

目的：利用叶绿体matK基因序列探讨10种石杉属植物的系统发育及分子鉴定。方法：分别从9种石杉属植物中提取总DNA,经扩增纯化后,用PCR产物直接测序。结果：对石杉属Huperzia Bernh. 9个种的叶绿体matK基因进行了测序,序列长度为1 589 bp,并对10个种(亮叶石杉H. lucidula的matK基因序列从GenBank中下载)的matK序列进行比对,其中有35个系统发育信息位点及35个变异位点,以垂穗石松Lycopodiella cernua为外类群,利用MEGA 3.1软件计算种与种之间的遗传距离在1.59%～0.25%,并构建系统树,获得最简约树和邻接树。结论：小杉兰组和蛇足石杉组植物分别聚成一枝,构成姊妹群,其靴带支持率分别为98%和99%。长柄石杉与蛇足石杉分别聚在2个不同进化枝,二者间有19个碱基差异,遗传距离为1.21%。建议应将长柄石杉单独列为一个种。     

重楼属药用植物的数量分类学研究

目的:运用数量分类学对重楼属的分类进行研究。方法:选取18个性状应用数量分类学原理与方法对重楼属Paris17种代表植物进行研究,选取欧式距离系数和非加权平均数法(UPGMA)进行聚类。结果和结论:聚类分析结果将重楼属17个种分为2个组群和7个组,并与传统分类学相比较讨论,2个组群的划分与李恒分类系统中侧膜胎座亚属和中轴胎座亚属不同,但其中第5,6,7组分别与李恒分类系统中的海南组、五指莲组、北重楼组的划分基本一致,而传统分类中根据特殊性状建立的球药隔组、花叶组和黑籽组被归入第2,3,4组。     

西双版纳野生重楼资源的分布概况

目的:摸清西双版纳野生重楼资源的种类、分布区域及资源现状等,为开展重楼人工种植,进行合理保护和开发研究提供依据。方法:通过走访调查、实地调查和样本采集鉴定相结合的方法,对全州26个乡镇的野生重楼资源进行了调查。结果:所调查的26个乡镇全部有野生重楼分布,但居群内个体多在20株以下。主要分布于海拔1 000～1 500 m的南亚热带季风常绿阔叶林下和竹林下,喜生长于箐沟、山谷等小环境中。分布的种类有滇重楼、七叶一枝花、南重楼3种,其中以滇重楼数量最多。结论:西双版纳地区海拔800 m以上、水源丰富的地域均适宜重楼生长,但野生重楼资源正在急剧减少,迫切需要开展重楼人工种植,并对野生资源进行合理保护和利用。     

毛重楼的化学成分研究

采用硅胶柱色谱,Sephadex LH-20和ODS等色谱技术对毛重楼根茎进行化学成分研究,得到12个化合物。通过理化数据和波谱分析鉴定其结构分别为羽扇豆醇（1）,羽扇豆醇二十八烷酸酯（2）,棕榈酸（3）,α-棕搁酸单甘油酯（4）,α-菠甾醇（5）,薯蓣皂苷元（6）,（25R）diosgenin-3-O-α-L-rhamnopyranosyl（1→4）-α-L-rhamnopyranosyl（1→4）-[α-L-rhamnopyranosyl（1→2）]-β-D-glucopyranoside（7）,偏诺皂苷元（8）,（25R）pennogenin-3-O-β-D-glucopyranosyl（1→3）-[α-L-rhamnopyranosyl（1→2）]-β-D-glucopyranoside（9）,flazin（10）,calonysterone（11）,异鼠李素-3-O-β-龙胆二糖苷（12）。其中化合物 1~5,10~11 为首次从该属植物中分离得到,所有化合物为首次从该植物中分离得到。     

Correlation among cytotoxicity,hemolytic activity and the composition of steroidal saponins from Paris L.

Ethnopharmacological relevance: Cytotoxicity and hemolysis of saponins were the characteristic activities. Many researches have been devoted to the synthesis of saponins devoid of the hemolysis by structure-activity relationship studies. However, saponins contained in the plants were not fully researched on the two activities such as Parissteroidal saponins. Paris steroidal saponins as the active compounds of Paris plants have multiple effects.Materials and Methods: In the present study, we investigated the cytotoxicity and hemolytic activity of Paris plants collected from twelve places in China. The contents of nine known steroidal saponins in the plants were determined simultaneously using HPLC-ELSD method. The two activities are not related to the contents of saponins.Results: As the results of hemolysis of saponins shown, the hemolysis was positive related to the sugar chain. The membrane toxicity suggested that the integration of saponins with the membrane in erythrocyte was correlated to the kinds of saponins and the hemolysis of disosgenyl saponins were stronger than that of pennogenyl glycosides.Conclusions: These results provided information about the hemolysis and cytotoxicity of Paris steroidal saponins, which may be useful for their synthesis devoid of hemolysis toxicity.     

数种蜥蜴亚目药用动物DNA条形码分类探讨

该研究选取数种蜥蜴亚目药用动物为研究对象,应用DNA条形码通用引物扩增测序,并与GenBank收录的共3科7属12种59个体的同源序列(564 bp)进行比对分析,采用邻接法、最大简约法和贝叶斯推断法分别构建分子系统发育树.结果表明,该片段的G+C平均量为46.5％,低于A+T平均量(53.5％).基于Kimura双参数模型计算,所有个体的种内遗传距离平均值为1.7％,种间遗传距离平均值为35.5％,种间平均遗传距离是种内的21倍.无疣壁虎、疣尾蜥虎和大壁虎的种内平均遗传距离均大于2％,进一步分析表明这些种的地理群体间的遗传分化可能均已达到亚种甚至种的水平,当然还需要结合形态、更多分子标记等分析才能定论.基于COI基因片段序列构建的系统发育树表明,DNA条形码在科、属和种水平的分类鉴定与传统方法所得结果一致.因此,DNA条形码用于蜥蜴亚目药用动物物种间的鉴定是可行的,特别是对于非专业人员鉴定相关类群药材真伪具有一定应用价值.     

北柴胡糖基转移酶基因BcUGT3,BcUGT6的表达分析及其原核表达

该研究测定了北柴胡中2个糖基转移酶基因BcUGT3和BcUGT6在不同组织中的转录水平及MeJA处理后不定根中的转录水平。BcUGT3在根、叶、花和果中的转录水平无明显差异,但均高于茎中的转录水平。BcUGT6在叶中转录水平最高,在花中最低。以未处理的为对照,BcUGT6在MeJA处理后2 h,8 h,24 h,2 d,4 d的北柴胡不定根中,转录水平均提高近2倍,表明BcUGT6的转录受MeJA影响较小。BcUGT3转录水平随处理时间的延长不断增加,4 d时,达7倍左右。利用载体pET-28a（+）,进行了2个基因的原核表达。IPTG诱导后,宿主菌表达出了目的蛋白,并获得了纯化蛋白。为后续开展这2个基因的功能研究奠定了基础。     

五指莲重楼的黄酮和甾体类化学成分研究

目的:研究五指莲重楼根茎中的化学成分。方法:采用溶剂法提取,利用正相硅胶色谱、葡聚糖凝胶SephadexLH-20、反相制备色谱等手段进行分离纯化,并通过现代波谱技术进行结构鉴定。结果:从乙酸乙酯层和正丁醇层中分离得到14个化合物,分别鉴定为胡萝卜苷(1),豆甾醇-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(2),β-蜕皮激素(3),偏诺皂苷元-3-O-α-L-呋喃阿拉伯糖基(1→4)-[α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)]-β-D-吡喃葡萄糖苷(4),薯蓣皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基(1→4)-α-L-吡喃鼠李糖基(1→4)-[α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)]-β-D-吡喃葡萄糖苷(5),山柰酚(6),芦丁(7),杨梅素(8),4,2′,4′-trihydroxychalcone(9),异鼠李素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(10),异鼠李素-3-O-芸香糖苷(11),异鼠李素-3-O-龙胆双糖苷(12),5,5′,7-三羟基-4′,4,7″-三甲氧基-[3′-8″]双黄酮(13),5,5′,7,4′,4,7″-六羟基-[3′-8″]双黄酮(14)。结论:化合物1~3,6~14为首次从该种植物中分离得到,其中化合物7~9,13和14为首次从该属植物中分离得到。     

地黄Aux/IAA家族基因RgIAA1的克隆和表达分析

为了克隆地黄Aux/IAA家族基因RgIAA1,分析地黄RgIAA1的时空表达特性及对逆境胁迫的响应。以拟南芥AtIAA14的cDNA序列为探针在地黄转录组数据库中进行比对,应用生物信息学方法分析RgIAA1的序列特征及进化关系,以实时荧光定量PCR技术检测RgIAA1在地黄不同组织以及逆境胁迫下的表达量。结果表明,获得1条903 bp的cDNA序列,包含一个681 bp完整的开放阅读框（ORF）,编码226个氨基酸,具有Aux/IAA家族蛋白的典型结构域和特征序列。RgIAA1在地黄不同组织中的表达呈差异表达,其中在地黄幼嫩叶片里表达强度最大,其次为茎,且随着叶片的伸展,RgIAA1表达强度不断降低。在连作时RgIAA1的表达量升高,NaCl和渍水胁迫下RgIAA1的表达量降低。实验首次克隆了地黄Aux/IAA家族基因RgIAA1,为阐明其在地黄生长发育和逆境胁迫中的分子功能奠定基础。     

根癌农杆菌介导sHSP基因对半夏的遗传转化

目的:建立高效的半夏遗传转化体系.方法:以半夏试管苗的叶柄为外植体,采用根癌农杆菌介导法,探索了酚类物质、农杆菌菌液浓度、侵染时间、预培养时间及共培养时间等对半夏遗传转化效率的影响.结果与结论:不经过预培养阶段,用含AS 40 mg·L-1的根癌农杆菌菌液侵染15 min后共培养3d时可有效提高遗传转化效率.将转化后的叶柄接到含有100 mg·L-1 Kan和350 mg·L-1Carb的分化培养基上进行筛选培养,30 d左右在叶柄的两端分化出抗性的试管小块茎.对抗性转化植株进行Gus染色和PCR检测,结果表明外源基因sHSP已经整合到半夏基因组中.