重组人Cu,Zn-SOD包含体的复性、纯化及复性蛋白稳定性研究

 目的通过体外复性和纯化技术获得具有高纯度、高生物活性的重组人铜锌超氧化物歧化酶(rhCu,Zn-SOD),并研究复性蛋白的稳定性。方法以透析法对在大肠杆菌中以包含体形式表达的rhCu,Zn-SOD进行复性,采用金属螯合亲和层析对复性样品进行纯化,通过酶活性测定考查复性和纯化的rhCu,Zn-SOD的热稳定性、pH稳定性和对变性剂的稳定性。结果建立了体外透析复性的基本条件,其比活可达2 380 U·mg^-1。该复性样品经金属螯合亲和层析纯化后,结果得到纯度大于95%、比活5 000 U·mg^-1、活性回收率大于100%的目的蛋白。复性和纯化蛋白在温度25～70℃和pH 5.0～10.5内活性稳定,并可耐受2～10 mol·L^-1的尿素和2%～8%的十二烷基硫酸钠(SDS),对更强烈的变性剂盐酸胍稳定性较弱。结论确定了重组人Cu,Zn-SOD包含体的体外复性条件和复性蛋白纯化方法,且复性蛋白表现出很好的稳定性,为重组人Cu,Zn-SOD的生产奠定了良好基础。     

人参铜锌超氧化物歧化酶原核表达载体的构建、表达及纯化

研究提取人参叶中的总RNA,采用RT-PCR扩增人参叶Cu/Zn-SOD基因,构建pET-28（a）-Cu/Zn-SOD原核表达载体。使用Escherichia coli BL21（DE3）感受态细胞进行IPTG诱导表达。利用镍离子亲和层析进行纯化,并采用黄嘌呤氧化酶法测定目的蛋白的酶活。经RT-PCR扩增的人参Cu/Zn-SOD基因序列与GenBank数据库中公布的高丽参Cu/Zn-SOD基因序列同源性为99.00%。经IPTG诱导,目的蛋白的表达量约为44.42%,相对分子质量为16.30 kDa。纯化后的蛋白酶活可达到10 596.69 U·mg^-1。通过分子生物学方法,成功构建了人参pET-28（a）-Cu/Zn-SOD原核表达载体,为进一步研究人参Cu/Zn-SOD生物学功能奠定了基础。     

v-Src蛋白在大肠杆菌中的高效表达、纯化及其活性分析

 目的表达高纯度具有激酶活性的Src蛋白,为抗肿瘤药物研究提供蛋白质靶标。方法利用高效表达质粒pGEX-KT克隆v-src全基因,诱导表达得到的GST-Src融合蛋白经GlutationeSepharose4B亲和层析柱纯化后,采用Westernblotting和以polyGlu:Try(4:1)为底物的ELISA法鉴定其免疫原性和酪氨酸激酶活性。结果GST-Src蛋白表达量约占菌体总蛋白的30%,其中包涵体与可溶性蛋白的表达量分别约13.5和2mg·L^-1,纯度分别约98%和85%,比活约1.13和0.62nmol·min^-1·mg^-1。结论本法表达的GST-Src融合蛋白表达量高、纯化效果好,且具有较高的激酶比活。     

重组 L-天冬酰胺酶Ⅱ的中试工艺及其性质的研究

 目的：通过重组L-天冬酰胺酶Ⅱ中试工艺及其性质的研究,旨在获得大量的高纯度产品。方法：采用500 L发酵罐发酵,对所获得菌体进一步提取纯化,产品用还原SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠-聚丙酰胺凝胶电泳法),HPLC测定纯度,质谱和等电聚焦电泳分别测相对分子质量、等电点,并进行了紫外扫描。结果：发酵液产酶活力达到200U·mg,提取回收率为80%,纯化总回收率为57%,产品比活为220U·mg,电泳30 μg上样量显示一条带,HPLC测纯度大于95%。该酶Mr为138356,pI为4.85,紫外最大吸收值在278 nm处。结论：本研究对实现重组L子力学-天冬院胺酶n的工业化生产有重要意义。     

重组人组织型纤溶酶原激活剂改构体的表达、复性与分离纯化

 目的 获得具有高纯度、高生物活性的重组人组织型纤溶酶原激活剂改构体(瑞替普酶,reteplase,r-PA)。方法 reteplase基因克隆到表达质粒pJZ"-100中,转化Escherkhia coli BL21(DE3),在0.05mmol·L^-1异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG)诱导下获得高效表达,表达产物通过脉沖稀释法复性,复性后的蛋白质用ETI-Sepharose4B亲和色谱纯化。结果 表达产物占菌体总蛋白质的20%,脉冲稀释法复性后复性收率为28%,经纯化后纯度达96%以上,比活为580 000 IU·mg^-1。结论 建立了reteplase表达、复性与纯化工艺,以此工艺可获得高活性高纯度的reteplase。     

大肠杆菌T蛋白PDH结构域的高效表达纯化与活性测定

 目的构建高效表达菌株,以大量表达大肠杆菌T蛋白的预苯酸脱氢酶(PDH),为研究T蛋白双功能结构域CM和PDH的相互协同作用以及T蛋白抑制剂对其影响提供活性蛋白材料。方法利用pGEX高效融合表达系统将PDH与谷光甘肽疏基转移酶(GST)编码序列在表达宿主BL21实现高效表达,并利用对GST具有亲和作用的GlutathioneSepharose4B琼脂糖珠进行亲和层析以对其分离纯化。结果表达产物达菌体总蛋白的40%,可溶性目的产物得量为240mg·L^-1,利用亲和层析法纯化后纯度达92.5%,GSTPDH融合蛋白的PDH的比活为38U·mg^-1。结论本法成功构建高效表达PDH菌株,表达量高,纯化度高,GST-PDH酶活性正常,为进一步研究奠定基础。     

重组人成骨蛋白-1在大肠杆菌中的高效表达及复性

 目的研究重组人成骨蛋白-1(rhOP-1)的发酵、纯化和复性。方法将构建好的重组质粒pBV221转化Escherichia coliBL21,迅速升温至42℃诱导rhOP-1以包涵体的形式高效表达。裂菌后利用6mol·L^-1尿素溶解目的蛋白,经SP-FastFlow离子交换色谱纯化后,利用cysteine/cystine对单体rhOP-1透析复性。结果rhOP-1的表达量占菌体总蛋白质量的33%,纯化后纯度可达98%,活性得到有效恢复。结论建立了rhOP-1发酵、纯化与复性的方法,获得高表达、高纯度、有活性的rhOP-1。     

人细胞色素P450 2B6的异源表达及活性分析

 目的获得有活性的人CYP2B6重组酶,用于进一步药物代谢研究。方法采用Bac-to-Bac杆状病毒介导的昆虫细胞表达系统进行人CYP2B6重组酶的表达,采用His抗体进行蛋白质印迹分析。安非他酮作为底物进行重组酶活性测定,高效液相色谱法测定其含量。结果蛋白质印迹分析检测到带有His标签的CYP2B6重组酶的表达,重组酶对安非他酮的Km值为(138±42)μmol·L^-1,V_max值为(676±21)pmol·min^-1·mg^-1蛋白。结论杆状病毒表达系统能成功表达有活性的CYP2B6重组酶,可用来进一步研究在药物代谢中的作用。     

不同分子量硫酸皮肤素的抗血栓活性

 目的 研究不同相对分子质量硫酸皮肤素（DS)的抗血栓活性。方法 采用美国药典的羊血浆法测定不同相对分子质量的DS的抗凝血活性，电刺激大鼠动脉血栓形成法测定其体内抗血栓活性，以及生色底物法测定其激活肝素辅因子Ⅱ(HCⅡ)抗凝血酶活性。结果相对分子质量分别为27.5×10³,8.0×10³,5.3×10³和4.0×10³的DS和低分子硫酸皮肤素(LMWDS₁，LMWDS₂和LMWDS₃)的抗凝效价分别为4.00，2.25，0.94和0.54 u·mg^-1；体内抗血栓活性的血栓堵塞时间（OT)值分别为58.12,50.58,123.90和133.53 min，均较生理盐水组19.79 min显著延长；体外激活HCⅡ抗凝血酶活性分别为223.23,123.71,89.29和58.00u·mg^-1。结论 随着LMWDS相对分子质量的降低，其抗凝血活性降低,体外激活HCII抗凝血酶活性也降低，但体内抗血栓活性增强。     

中西医结合治疗子宫肌瘤

目的 :比较离舌橐吾( Ligularia veitchiana (Hemsl.) Greenm)的两种苯并呋喃衍生物5, 6-二甲氧基-2-异丙基-苯并呋喃(5,6-dimethoxy-2-isopropenyl-benzofuran)( 1 ),5-乙酰基-6-甲氧基-2-异丙基-苯并呋喃(5-acetyl-6-methoxy-2-isopropenyl-benzofuran)( 2 )对人肝癌细胞HepG2和正常肝细胞L02的毒性,并分析其可能机制。 方法 :用台盼蓝排染法检测化合物细胞毒性、用DCFH-DA荧光分光光度计法检测细胞活性氧含量、用钼酸铵比色法检测过氧化氢酶活性。 结果 :化合物 1和2 对L02的IC₅₀值分别为(171.2 ± 3.3) μg · mL^-1和(79.0 ± 4.1) μg · mL^-1,高于对HepG2的IC₅₀值(84.2±6.5)μg · mL^-1和(65.2 ± 1.9) μg · mL^-1,表明肿瘤细胞比正常细胞对化合物更加敏感。用化合物 1和2 IC₅₀处理细胞48 h,测得HepG2细胞活性氧分别是对照组的1.6倍和3.2倍;L02细胞活性氧分别是对照组的1.2倍和1.8倍。化合物 1和2 处理后,HepG2细胞过氧化氢酶活力分别从对照组的(17.2±1.7)U ·mg^-1Pr.下降到(12.8±0.4)和(6.4±0.1)U ·mg^-1Pr.;L02细胞过氧化氢酶活力分别从对照组的(17.7±1.2) U ·mg^-1Pr.下降到(14.3±1.5) 和(8.6±0.5)U ·mg^-1Pr.;HepG2过氧化氢酶活力降低幅度大于L02。 结论 :二化合物对HepG2的毒性和活性氧的增幅均大于L02,同时HepG2过氧化氢酶活力降幅也大于LO2。据此推测二化合物细胞毒性与活性氧有关。     

重组葡萄球菌肠毒素B蛋白表达、纯化及生物活性的实验研究

 目的建立重组葡萄球菌肠毒素B(staphylococcal enterotoxin B,SEB)表达、纯化方法,了解rSEB细胞毒性、促淋巴细胞增殖和抑制肿瘤生长的作用。方法采用IPTG(1.0mmol·L^-1)诱导SEB原核表达系统pET32a-SEB-E.coliBL21DE3表达rSEB,10%SDS-PAGE检测其产量,Ni-NTA亲和色谱法纯化rSEB。采用Vero细胞测定rSEB的细胞毒性作用,并计算TCIC₅₀值。通过MTT法分别检测不同浓度rSEB体外促淋巴细胞增殖作用,以及对肿瘤细胞株HepG2、HeLa的生长抑制作用。结果所构建的SEB原核表达系统中,rSEB表达量约为细菌总蛋白的40%,主要以包涵体形式存在。纯化的rSEB对Vero细胞的TCIC₅₀为3.02μg。5.0～20.0mg·L^-1的rSEB对小鼠脾细胞和人PBMC均有明显的促增殖作用(P<0.05)。5.0～20.0mg·L^-1rSEB作用的人PBMC上清均能有效地抑制HepG2细胞和HeLa细胞生长(P<0.05)。结论建立了SEB高效表达、纯化方法,获得rSEB蛋白。所建立的细胞毒性、促淋巴细胞增殖和抑制肿瘤细胞生长作用的检测方法,为后续进一步分析SEB分子中相关活性位点及其减毒SEB突变体的筛选奠定了基础。     

幼仓鼠肾细胞表达重组人红细胞生成素在猕猴中的药动学

 目的：研究幼仓鼠肾(BHK)细胞表达红细胞生成素(EPO)在猕猴体内的药动学。方法：ELISA法测定血清浓度。结果：iv200u·kg^-1后符合二室开放模型，t_1/2α和t_1/2β分别为(1.8±0.3)h和(11.3±1.7)h?Sc50，200和800u·kg^-1后符合一级吸收一室模型，t_1/2Ke分别为(10.5±3.2)h?(10.0±1.3)h和(7.4±1.0)h，吸收速率受剂量限制，t_{1/2F=8.2，P<0.05)。tmax分别为(3.0±1.2)h,(4.0±0.0)h和(5.5±1.9)h。AUC随剂量增加，Cls相近，生物利用度为0.64。结论：EPO体内总过程基本符合线性药动学，方法学与结果对人体研究有参考意义。}     

独行菜幼苗叶片乙酰CoA酰基转移酶基因克隆、序列分析与原核表达

目的:研究独行菜强心苷生物合成途径的相关基因,从独行菜幼苗叶片中克隆强心苷生物合成途径关键酶乙酰CoA酰基转移酶(acetyl-CoA C-acetyltransferase,AACT)基因,进行序列分析和原核表达。方法:根据独行菜转录组数据中LaAACT基因序列设计特异性引物,克隆得到LaAACT基因的cDNA序列,构建pET-32a-LaAACT原核表达载体,诱导表达LaAACT重组蛋白。结果:LaAACT基因ORF全长为1 212 bp,编码403个氨基酸。序列分析结果显示LaAACT蛋白没有跨膜区,不含信号肽,位于细胞质中,含有硫解酶家族保守结构域。系统进化结果显示LaAACT蛋白与十字花科植物的AACT蛋白亲缘关系较近。通过IPTG诱导,在大肠埃希菌中成功表达LaAACT重组蛋白,并得到了纯化的LaAACT重组蛋白。结论:首次从独行菜幼苗叶片中克隆了LaAACT基因,建立其稳定的原核表达体系,为LaAACT蛋白抗体的制备,进一步研究LaAACT基因在独行菜强心苷生物合成途径中的功能奠定了基础。     

重组葡萄球菌肠毒素B突变体蛋白D9N的表达、纯化及生物学活性的研究

 目的表达、纯化重组葡萄球菌肠毒素B突变体蛋白D9N(rSEB-D9N),了解表达产物rSEB-D9N的细胞毒性、促淋巴细胞增殖和肿瘤生长抑制作用。方法不同浓度IPTG诱导SEB-D9N突变体原核表达系统pET32a-SEB-D9N-E.coliBL21DE3表达rSEB-D9N,经Ni-NTA亲和层析法纯化rSEB-D9N,10%SDS-PAGE和高效液相色谱检测其纯度。以Vero细胞为靶细胞,进行rSEB-D9N的细胞毒性作用,并计算TCID₅₀值。采用MTT法分别检测不同浓度的rSEB-D9N促人淋巴细胞增殖及抑制KB及MCF-7癌细胞株生长的作用。流式细胞术检测rSEB-D9N刺激人淋巴细胞后CD3、CD4、CD8的表达。结果rSEB-D9N表达产量约占细菌总蛋白30%,纯化后获得纯度为90.48%的rSEB-D9N。rSEB和rSEB-D9N对Vero细胞的TCID₅₀值分别为3.12,8.85μg,10.0,20.0mg·L^-1的rSEB-D9N具有显著的促PBMC增殖的作用(P<0.05),且主要上调CD3,CD4和CD8的表达。5.0～20.0mg·L^-1rSEB-D9N作用的PBMC上清对KB和MCF-7细胞生长均可产生明显抑制作用(P<0.05)。结论获得并纯化了重组葡萄球菌肠毒素B突变体蛋白(rSEB-D9N),其细胞毒性作用有所降低,但促人淋巴细胞增殖和抑制肿瘤细胞生长作用仍较强,可作为研制升白细胞、抗肿瘤相关药物的候选突变体。