桑遗传转化体系的建立及槲皮素合成的研究

目的:建立桑的遗传转化体系,并对其毛状根生长特性和次生代谢产物槲皮素含量进行探索。方法:利用卸甲型根癌农杆菌Agrobacterium tumefaciensC58C1侵染桑的黄化无菌苗,建立毛状根的诱导与培养体系;优化毛状根的扩大培养条件并测定其生长曲线,对桑毛状根T-DNA转化结果进行PCR检测;利用RP-HPLC检测槲皮素的含量。结果:用C58C1侵染无菌苗外植体,侵染10 min、分别预培养、共培养2 d及添加质量浓度为100 mg.L-1的乙酰丁香酮(AS)可得最高转化率;PCR检测结果表明,发根农杆菌Ri质粒的rolB,rolC基因片段已整合入桑的毛状根基因组中;C58C1侵染桑黄化无菌苗茎段10 d后,茎段伤口处陆续产生毛状根,30 d后幼茎上产生毛状根的外植体达92%;在1/2MS+0.05 mg.L-1IBA液体培养基中培养50 d后,由HPLC检测结果表明,毛状根中槲皮素含量相比于原植株增加了8.5倍。结论:成功建立桑科毛状根诱导与离体培养体系,为其他木本植物毛状根培养的研究提供了参考,并进一步为槲皮素等药用活性成分的工业化生产奠定了基础。     

Ti和Ri质粒对栝楼双转化的研究

目的 :建立栝楼双转化毛状根培养系统。方法 :①利用根癌农杆菌Agrobacterium tumefaciens菌株C58感染栝楼Trichosanthes kirilowii.无菌苗诱导冠瘿瘤 ,然后用发根农杆菌Agrobacterium rhizogenes菌株 15834感染其再生植株 ,诱导出毛状根 ;②用纸电泳检测Ti和Ri质粒是否转化成功 ;③运用分光光度计和SDS PAGE检测栝楼组织中所含蛋白。结果 :Ti和Ri质粒转化成功并建立了栝楼双转化毛状根培养系统。结论 :双转化毛状根与一般毛状根相比 ,具有生长更迅速等特点而蛋白含量基本一样 ;因此 ,利用它来生产天花粉蛋白更具有开发潜力。     

紫锥菊毛状根诱导及离体培养

 目的 研究紫锥菊毛状根的诱导及活性成分的产生。方法 用发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）A4,R1601,1025感染紫锥菊外植体。结果 紫锥菊外植体被3种发根农杆菌感染后,外植体伤口处均能陆续分化生长出白色的毛状根。A4菌株的诱导效果明显好于其他2种菌株,A4对紫锥菊叶片的毛状根诱导率高达66.7%。紫锥菊毛状根的最佳诱导条件为：发根农杆菌A4,感染时间12 min,菌液A₆₀₀值 0.8,共培养温度24 ℃,共培养时间2 d,预培养时间2 d,培养基pH值6.0,此条件下紫锥菊毛状根的平均诱导率达到54%;对诱导出的毛状根进行PCR检测,证明其确为已转化的毛状根。检测得到紫锥菊毛状根中的多糖含量为15.54%,总酚的含量为2.491%。结论 本实验所建立的紫锥菊毛状根培养系统,为研究紫锥菊毛状根大量培养生产活性成分奠定了基础。     

甘草Ri质粒转化及不同理化因子对甘草毛状根生长的影响

目的:研究甘草毛状根的诱导及外界因子对其生长的影响。方法:用发根农杆菌Agrobacterium rhizo-genesLBA9402和R1601感染甘草Glycyrrhiza uralensis外植体。结果:2种发根农杆菌均能诱导甘草产生毛状根,LBA9402比R1601表现出较强的对甘草的感染能力,下胚轴的转化率高于子叶。在WP培养基上毛状根生长最快。光照对毛状根生长有抑制作用。毛状根中5种黄酮类化合物的总量比愈伤组织中高1.5倍,其中甘草查耳酮含量是愈伤组织中的15.5倍。结论:本实验所建立的甘草毛状根培养系统,为研究甘草毛状根大量培养生产黄酮类化合物奠定了基础。     

短葶飞蓬毛状根的诱导及黄酮类成分测定

目的通过诱导培养短葶飞蓬毛状根产生有用次生代谢产物。方法利用发根农杆菌C58C1感染短葶飞蓬无菌苗叶盘诱导毛状根,小量提取脱农杆菌完全的毛状根DNA用于rol基因的PCR检测,经PCR检测阳性的毛状根采用4种不同液体培养基振荡扩大培养,对于获得的毛状根系测定其中总黄酮和灯盏花素的量。结果发根农杆菌感染10min共培养2d可取得较好的转化效果,继代培养约两个月后可脱菌完全,获得的毛状根PCR检测阳性率为52.9%,4种液体培养基中B5培养基更适合于毛状根的生长,毛状根中总黄酮量要明显高于正常根中的量,但灯盏乙素的量明显低于正常根中的量。结论通过短葶飞蓬毛状根大量培养可获取灯盏黄酮类药用成分。     

诱导子对黄芩毛状根生长及黄芩苷合成的影响

目的 考察诱导子对黄芩毛状根生长和黄芩苷生物合成的影响.方法 用非生物诱导子(Ca2+、Mg2+和Co2+)和从黑曲霉Aspergillus niger、米曲霉A.oryzae、蜜环菌Armillaria mellea中提取的真菌诱导子,与黄芩毛状根共培养;HPLC法测黄芩苷的量.结果 各诱导子对黄芩毛状根生长和黄芩苷合成有不同影响:黑曲霉诱导子和米曲霉诱导子质量浓度为40和20 mg/L时,CO2+浓度为1.53×10-4 mmol/L时,黄芩苷的量从7.64%分别增至9.18%、8.81%和8.62%.结论 诱导子对黄芩毛状根次生代谢产物具有特异性,可选择性地促进某一类次生代谢产物的合成.试验证实黑曲霉诱导子、米曲霉诱导子和Co2+是适合黄芩毛状根代谢黄芩苷调控的诱导子.     

Ri质粒人参转化系统的建立及鉴定

目的 :建立人参毛状根转化体系。方法 :利用含有Ri质粒的发根农杆菌Agrobacterium rhizogenes感染人参Panax ginseng进行毛状根诱导 ,利用PCR技术及TLC分析方法对毛状根进行鉴定。 结果 :首次从人参带叶幼茎处诱导出毛状根 ,用激素和AS(乙酰丁香酮 )处理可提高转化率并缩短转化时间。毛状根在无激素B5培养基上生长并失去向地性 ,月增长倍数可达 50倍 (鲜重 )。PCR分析证实农杆菌Ri质粒含有rolC序列 (564bp)的T DNA已整合到人参转化株的染色体组中 ,TLC分析证明T DNA特异的表达产物冠瘿碱在转化细胞中合成。人参毛状根中人参总皂苷含量为 2.486% (干重 ) ,而人参原药材总皂苷含量为 1.403% (干重 )。结论 :人参毛状根生长迅速 ,皂苷含量高于原药材 ,该体系的建立为利用生物技术工业化生产人参活性成分奠定了基础。     

竹节参毛状根培养体系的建立及人参皂苷Re的合成

目的:建立竹节参毛状根的诱导方法和培养体系,并对其生长特性和所合成的人参皂苷Re的含量进行分析。方法:用卸甲型根癌农杆菌C58C1菌株感染竹节参预培养的地上茎,诱导毛状根产生,在1/2MS培养基上扩大培养并测定其生长特性;用PCR检测竹节参转化毛状根的T-DNA及HPLC测定人参皂苷Re含量。结果:C58C1菌株能诱导竹节参地上茎产生毛状根,在浸染25min时,诱导率最高,为90%;经PCR检测,C58C1菌株Ri质粒上的rolB基因已经整合到竹节参毛状根基因组中;HPLC检测发现,竹节参毛状根均能合成人参皂苷Re,其中含量最大的是1/2MS液体培养的单克隆PJ8,其值高达60.26 mg.g-1。结论:初步建立了竹节参毛状根的诱导和培养方法,为大规模培养竹节参毛状根以生产高含量的人参皂苷Re奠定了实验基础。     

高效液相色谱法测定蒙药粘毛黄芩中黄芩苷的含量

目的采用高效液相色谱法测定粘毛黄芩中黄芩苷含量。方法色谱条件为：采用C18柱，以甲醇-1％冰醋酸的水溶液（54：46）为流动相，检测波长280nm。结果平均回收率98．7％，RSD为0．96％。结论此法简便、灵敏、快速、可靠、重复性好，可用于粘毛黄芩药材的质量控制。     

复方双黄连与黄芩提取物中黄芩苷代谢的比较研究

 目的　比较复方双黄连剂和黄芩单味药材提取物中黄芩苷在大鼠体内代谢的差异。方法　运用高效液相色谱法和液质联用技术检测黄芩苷的代谢产物种类和数量,并测定水解后黄芩苷元的量。结果　从给药后的大鼠尿样中,发现并初步鉴定了几个主要代谢产物的化学结构,测定了黄芩苷元的量。结论　黄芩提取物和复方双黄连剂中黄芩苷在尿样里的主要相同代谢物为5,6,7-三羟基黄酮-6-O-葡萄糖醛酸苷-7-O-葡萄糖醛酸苷,5,6,7-三羟基黄酮-6-O-葡萄糖-7-O-葡萄糖醛酸苷,5,7-三羟基-6-甲氧基黄酮-7-O-葡萄糖醛酸苷,5,6,7-三羟基黄酮-6-O-葡萄糖醛酸苷以及黄芩苷元,黄芩单方灌胃给药后黄芩苷的肾清除速度低于复方双黄连,复方中其他药味促进了黄芩苷的代谢。     

白英毛状根的培养与薯蓣皂苷元的测定

目的建立白英Solanum lyratum毛状根诱导与培养体系,筛选出薯蓣皂苷元高产的毛状根无性系。方法利用发根农杆菌C58C1感染白英外植体获得毛状根,建立白英毛状根遗传转化体系。采用HPLC法检测薯蓣皂苷元量。结果菌液浸染时间为10 min、共培养时间为4 d可获得最佳转化效果,毛状根诱导率为83.33%。HPLC检测结果表明,野生型白英植株中叶片的薯蓣皂苷元量最高,为1.742 mg/g。毛状根中薯蓣皂苷元的平均质量分数为4.620 mg/g,是白英叶片的2.652倍。结论通过白英毛状根离体培养,可以高效率地获得薯蓣皂苷元。     

长春花毛状根培养及抗癌生物碱产生的研究

目的:建立长春花毛状根转化体系,从毛状根中获得生物碱。方法:用发根农杆菌A₄和R₁₀₀₀菌株分别感染长春花的不同外植体获得毛状根,并对毛状根的培养条件进行优化。结果:采用A₄感染叶片,分别预、共培养2d及添加100mg·L^-1的乙酰丁香酮(A_s)可得到最佳转化效果,毛状根的诱导率达86.25%。以蔗糖为碳源及以水解乳蛋白为氮源的1/2MS培养基为毛状根的最佳生长条件。检测结果表明,毛状根中的总生物碱含量高于长春花的原植株和愈伤组织。结论:可通过毛状根的培养来获得抗癌生物碱长春碱和长春新碱等。     

杜仲毛状根培养条件优化及其桃叶珊瑚苷药用成分的研究

目的:诱导杜仲毛状根的发生及筛选优良毛状根系.方法:利用发根农杆菌C58C1诱导杜仲不同外植体产生毛状根,并利用HPLC测定桃叶珊瑚苷含量.结果:采用杜仲无菌苗胚轴经菌液浸染20 min,共培养3 d可得到最佳转化效果.液体培养的生长量优于固体培养,最有利于毛状根生物量和药用成分的积累,并筛选到桃叶珊瑚苷高产根系E_1.结论:可通过毛状根的培养来获得桃叶珊瑚苷药用成分.     

王不留行毛状根的诱导及培养

目的:利用4种发根农杆菌R15834,R1601,R1000,A4诱导药用植物王不留行产生毛状根,建立王不留行的毛状根培养体系。方法:采用共培养法研究不同外植体、菌株、外源激素、侵染时间、预培养时间和共培养时间对王不留行毛状根诱导率的影响。结果:用王不留行叶片作为外植体,外植体预培养60 h,共培养48 h,发根农杆菌R1601侵染10 min,培养基中添加0.1 mg.L-1吲哚丁酸(IBA)转化率最高。结论:王不留行毛状根诱导成功,为其遗传转化提供了依据。     

甘草毛状根诱导培养及其黄酮含量检测的研究

 目的 探讨影响甘草毛状根的诱导培养的因素及其总黄酮含量。方法 利用发根农杆菌的遗传和液体培养技术,研究了甘草（Glycyrrhiza uralensis毛状根的诱导和离体培养及其黄酮的产生情况。结果 不同发根农杆菌中,A4菌株侵染效果最好,约96%的子叶节外植体产生毛状根;不同外植体中,子叶节的转化效果最高,毛状根产生只需3~4 d;在毛状根的液体培养过程中,接种量为0.3 g,培养容积为500 mL时生长速率最快,毛状根湿重增长41倍;毛状根能产生药用成分甘草黄酮,根系中最高黄酮含量高于商品甘草,达干重的2.042%,约为未转化植株根的4.3倍;毛状根中的黄酮还分泌到培养液中,最高量为每100 mL培养液1.36 mg。结论 较为系统地研究了甘草毛状根的诱导培养条件和总黄酮量,为今后规模培养甘草毛状根生产药用甘草黄酮提供了可能性。     

RiT-DNA对四倍体菘蓝的遗传转化及其植株再生

目的：建立一套利用发根农杆菌转化四倍体菘蓝的有效方法。方法：利用发根农杆菌R1601,ASTCC15834和A4感染四倍体菘蓝的子叶外植体诱导出毛状根,再将毛状根置于含不同激素的培养基上诱导再生植株。结果：3种农杆菌具有不同的诱导能力,毛状根在不含激素的MS固体培养基上快速生长并表现出典型的毛根性状：多分枝、多根毛且无向地性,经冠瘿碱分析证明确已被转化。毛状根在无激素的MS增养基中悬浮培养两周后其生物量增加近35倍,在含BA的MS固体培养基上不经愈伤组织阶段直接分化出不定芽,所有不定芽都可在生根培养基上生根长成再生植株。冠瘿碱检测表明Ri质粒的T-DNA部分已转化到再生植株基因组中。结论：发根农杆菌可以诱导四倍体菘蓝长出毛状根,经诱导出的毛状根具有再生完整植株的能力。     

植物表达载体在三分三发根中的高效表达

目的建立基于发根培养的三分三Anisodus acutangulus遗传转化体系及在三分三发根中表达外源基因的方法。方法由种子直接萌发得到无菌苗,建立了三分三的无菌苗培养系统。将植物高效表达载体pCAMBI-A1304 导入经过“disarmed”改造的根癌农杆菌C58C1(携带pRiA4质粒),获得了携带外源基因表达载体的重组C58C1工程菌。取生长良好的幼嫩真叶作为外植体,在乙酰丁香酮的诱导下用重组C58C1进行感染,诱导发根。选取在无激素培养基上生长迅速,分支多的发根单克隆进行继代培养。经过3次继代培养,PCR(polymerase chain reaction,聚合酶链式反应)检测用于验证发根型质粒pRiA4和表达型质粒pCAMBIA1304 是否整合到三分三发根基因组内。结果建立了基于发根培养的三分三遗传转化体系,发根诱导频率达到100%,PCR检测表明pRiA4和pCAMBIA1304 质粒共转化率达到32%。结论该方法可以用于在三分三发根中高效表达外源基因,为实现基于发根的三分三产托品烷类生物碱的代谢工程奠定了基础。     

野葛毛状根的诱导及离体培养

目的; 野葛毛状根的诱导和无激素离体培养。 方法：用含超强毒性基因的发根农杆菌R1601与野葛离体叶片共培养。 结果：经感染的野葛叶片表面直接形成大量生长快、分枝多、负向地性的毛状根,毛状根离体培养具有抗卡那霉素特性和激素自给特征。 结论：建立了发根农杆菌诱导野葛毛状根的方法和野葛毛状根的离体培养系统。