滋补脾阴方药对脾阴虚糖尿病大鼠海马内质网应激影响的研究

目的:探讨滋补脾阴方药(ZiBu PiYin Recipe,ZBPYR)对脾阴虚糖尿病大鼠海马内质网应激相关分子表达的影响。方法:高脂饲料喂养联合小剂量链脲佐菌素(streptozocin,STZ)注射建立2型糖尿病模型,在此基础上,通过复合因素造模的方法建立脾阴虚糖尿病模型,以水迷宫实验评价模型大鼠是否出现学习记忆障碍,之后观察各组大鼠海马内质网应激相关分子葡萄糖调节蛋白78(glucose regulated protein 78,GRP78)、蛋白激酶样内质网激酶(protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase,PERK)和真核转录因子2的α亚单位(eukaryotic translation initiation factor 2 subunitα,eIF2α)表达的变化。结果:ZBPYR治疗后GRP78 mRNA水平降低(P0.05),GRP78、磷酸化PERK、磷酸化eif2α蛋白水平明显降低(P0.05),与脾阴虚糖尿病组相比,差异有统计学意义。结论:滋补脾阴方药可能是通过影响内质网应激PERK信号传导改善脾阴虚糖尿病大鼠学习记忆障碍。     

滋补脾阴方药对脾阴虚糖尿病大鼠大脑皮质内质网应激的影响

目的观察脾阴虚糖尿病大鼠大脑皮质磷酸化(p)RNA依赖的蛋白激酶样内质网激酶(PERK)、真核起始因子2α-亚单位(eIF2α)、p-eIF2α、葡萄糖调节蛋白78(GRP78)的变化,探讨脾阴虚糖尿病相关认知下降发病机制及滋补脾阴方药的作用机制。方法将大鼠随机分为对照组、糖尿病组、脾阴虚组、脾阴虚糖尿病组(病证组)、脾阴虚糖尿病+滋补脾阴方药组(治疗组)。采用高脂喂养4周联合小剂量链脲佐菌素注射方法建立2型糖尿病模型。在此基础上采用饮食不节、劳倦过度及灌服伤阴药方法建立脾阴虚糖尿病模型。治疗组给予滋补脾阴方药灌胃,其余各组给予等体积生理盐水灌胃,连续15 d,取大脑皮质。采用Western Blot、RT-PCR方法观察PERK、eIF2α、p-eIF2α、GRP78表达变化。结果糖尿病组、脾阴虚组、病证组PERK、p-eIF2α蛋白表达及GRP78 mRNA表达较对照组增强(P0.05),糖尿病组、病证组GRP78蛋白表达较对照组增强(P0.05),治疗组上述分子表达较糖尿病组、病证组均减弱(P0.05)。结论内质网应激参与脾阴虚糖尿病相关认知下降的发病,滋补脾阴方药通过减轻内质网应激改善学习记忆障碍。     

滋补脾阴方药对脾阴虚痴呆大鼠海马蛋白质组影响的研究

目的:从蛋白质组水平探索脾阴虚痴呆的本质以及滋补脾阴的方药(ZBPYR)作用靶点.方法:采用饮食不节、劳倦过度、耗伤阴液的复合因素综合考虑的方法建立脾阴虚的大鼠模型.并于双侧海马定位注射聚合态β-淀粉样蛋白1-40,应用ZBPYR干预.通过双向凝胶电泳比较各组大鼠海马蛋白质组表达图谱的不同;由MALDI-TOF-MS鉴定表达差异的蛋白.结果:与空白对照组相比,脾阴虚痴呆组有9个蛋白表达差异点;脾阴虚痴呆+ZBPYR组有2个差异点.经质谱鉴定显示脾阴虚痴呆组大鼠海马蛋白中Annexin Ⅲ表达上调,Tubulin beta chain 15、Dihydropyrimidinase-like 2和Guanine nucleotide-binding protein beta-1 subunit表达下降,ZBPYR干预后这些蛋白点的表达与空白对照组比较无明显差异.结论:脾阴虚痴呆大鼠海马的病变是一个多种蛋白质参与的复杂过程,AnnexinⅢ、Tubulin beta chain 15等分子参与了脾阴虚痴呆大鼠的海马病变;ZBPYR可能通过对海马的差异表达蛋白的调控而达到治疗目的.     

滋补脾阴方药对脾阴虚痴呆大鼠海马蛋白质组影响的研究

目的:从蛋白质组水平探索脾阴虚痴呆的本质以及滋补脾阴的方药(ZBPYR)作用靶点。方法:采用饮食不节、劳倦过度、耗伤阴液的复合因素综合考虑的方法建立脾阴虚的大鼠模型。并于双侧海马定位注射聚合态β-淀粉样蛋白1-40,应用ZBPYR干预。通过双向凝胶电泳比较各组大鼠海马蛋白质组表达图谱的不同;由MALDI-TOF-MS鉴定表达差异的蛋白。结果:与空白对照组相比,脾阴虚痴呆组有9个蛋白表达差异点;脾阴虚痴呆+ZBPYR组有2个差异点。经质谱鉴定显示脾阴虚痴呆组大鼠海马蛋白中AnnexinⅢ表达上调,Tubulin beta chain 15、Dihydropyrimidinase-like 2和Guanine nucleotide-binding protein beta-1 subunit表达下降,ZBPYR干预后这些蛋白点的表达与空白对照组比较无明显差异。结论:脾阴虚痴呆大鼠海马的病变是一个多种蛋白质参与的复杂过程,AnnexinⅢ、Tubulin beta chain 15等分子参与了脾阴虚痴呆大鼠的海马病变;ZBPYR可能通过对海马的差异表达蛋白的调控而达到治疗目的。     

滋补脾阴方药对脾阴虚糖尿病大鼠海马胰岛素抵抗影响的实验研究

目的探讨滋补脾阴方药对脾阴虚糖尿病大鼠海马胰岛素信号通路改变的保护作用及其可能的机制。方法高脂饮食加注射小剂量链脲佐菌素(STZ)建立2型糖尿病模型。脾阴虚模型参照经典的复合因素造模法建立。行为学测试大鼠学习记忆能力。Western blot检测海马IRE1α、JNK、IRS-1蛋白表达情况。结果脾阴虚糖尿病大鼠学习记忆能力与空白对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。滋补脾阴方药治疗后学习记忆能力改善。脾阴虚糖尿病大鼠海马中磷酸化IRS-1、JNK及IRE1α蛋白表达增强(P<0.05),滋补脾阴方药治疗后表达减弱。结论滋补脾阴方药可显著改善脾阴虚糖尿病大鼠学习记忆障碍。其作用可能与改善内质网应激来调节胰岛素信号通路有关。     

滋补脾阴方药对脾阴虚痴呆大鼠脑内树突棘变化影响的研究

目的：通过对病证结合脾阴虚痴呆大鼠模型脑内不同区域树突棘变化的观察,探讨滋补脾阴方药（ZBPYR）对脑内树突棘变化的作用和影响。方法：采用经典方法建造脾阴虚模型,凝集态β-淀粉样蛋白1-40（β-Amyloid 1-40,Aβ1-40）定位注射到海马,建立脾阴虚痴呆模型,并应用ZBPYR干预。使用高尔基（Golgi）染色法,对动物模型脑内不同区域的树突棘进行染色,观察数量和形态。结果：脾阴虚痴呆组的海马各区和皮质的树突棘密度比脾阴虚组有所减少;与痴呆组和脾阴虚痴呆组比较,脾阴虚痴呆+ZBPYR组的大鼠海马各区和皮质的树突棘密度有所增加;与空白对照组比较,在痴呆组模型大鼠的脑内海马不同区域和皮质的树突棘密度下降。结论：脾阴虚痴呆大鼠不同脑区树突棘密度有不同程度减少,ZBPYR对学习记忆障碍的改善可能与维持不同脑区树突棘密度相关。     

脾阴虚痴呆证病结合模型建立及滋补脾阴方药干预的实验研究

目的:为有效模拟临床,建立脾阴虚痴呆证病结合大鼠模型,并观察滋补脾阴(Zi-Bu-Pi-Yin,ZBPY)方药对其影响。方法:采用经典方法建立脾阴虚模型,随后将凝集态β-淀粉样蛋白1-40(β-Amyloid1-40,Aβ1-40)定位注射到双侧海马,应用ZBPY方药干预,观察各组体征变化。通过跳台仪和Morris水迷宫进行行为学测试,比较各组学习记忆能力的改变。结果:脾阴虚组和脾阴虚痴呆组表现出饮水量增加(P<0.01),肛温升高(P<0.01)等阴虚内热征象;痴呆组和脾阴虚痴呆组学习记忆力降低(P<0.05);脾阴虚痴呆 ZBPY组阴虚表现和学习记忆力均有所改善(P<0.05)。结论:本研究在完善阿尔茨海默病的证病结合模型方面作了尝试,观察了证、病、证病结合模型在体征和行为学方面的变化;ZBPY方药对脾阴虚痴呆大鼠的阴虚表现及学习记忆能力均有一定改善作用。     

脾阴虚痴呆大鼠不同脑区Snk-SPAR路径及滋补脾阴方药调控作用研究

目的:观察脾阴虚痴呆大鼠不同脑区树突棘相关的Rap-特异性GTPase-活化蛋白和血清诱导激酶mRNA表达的变化及滋补脾阴方药对其调控作用。方法:采用逆转录聚合酶链反应检测各脑区SPAR、Snk mRNA表达变化。结果:痴呆组和脾阴虚痴呆组大鼠各脑区SPAR mRNA表达明显减弱(P<0.05),Snk mRNA表达呈上调趋势;脾阴虚痴呆+ZBPYR组大鼠各脑区SPAR mRNA表达明显增强(P<0.05),Snk mRNA表达呈下调趋势。结论:ZBPYR能使脾阴虚痴呆组大鼠各脑区SPARmRNA表达增强,Snk mRNA表达下调,提示ZBPYR具有保护并维持突触和树突棘正常形态的作用,这一作用机制可能与Snk-SPAR信号途径传递有关。     

脾阴虚证与自由基、能量代谢的相关性及理脾阴正方对其的作用

目的:通过观察理脾阴正方对脾阴虚证大鼠回肠组织中MDA含量、GSH-PX以及线粒体呼吸链酶复合物Ⅰ、Ⅳ活性的影响,探讨其对脾阴虚证大鼠自由基代谢和细胞能量代谢的恢复机理。方法:以复合因素损害大鼠,对正常对照组、脾阴虚模型组、脾阴虚中药反证组用比色法检测回肠组织中丙二醛(MDA)含量和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性以及回肠组织线粒体Ⅰ、Ⅳ活性。结果:(1)脾阴虚模型组MDA含量明显高于正常组(P<0.05)、GSH-Px、线粒体呼吸链酶复合物Ⅰ、Ⅳ活性明显低于正常组(P<0.05)。(2)脾阴虚中药反证组MDA含量低于脾阴虚模型组(P<0.05)、GSH-Px、线粒体呼吸链酶复合物Ⅰ、Ⅳ活性活性高于模型组(P<0.05)。结论:理脾阴正方能提高大鼠回肠组织中GSH-Px、线粒体呼吸链酶复合物Ⅰ、Ⅳ的活性,降低大鼠回肠组织中脂质过氧化物MDA的含量,这可能是理脾阴正方对脾阴虚证大鼠自由基修复和细胞能量代谢障碍的保护机理。     

滋补脾阴方药对脾阴虚大鼠空肠葡萄糖转运蛋白1、葡萄糖转运蛋白5 表达的影响

目的：观察脾阴虚大鼠空肠葡萄糖转运蛋白1（GLUT1）、葡萄糖转运蛋白5（GLUT5）mRNA与蛋白表达的变化，以及滋补脾阴方药（ZBPYR）的干预作用。方法：利用饮食失常兼过劳结合燥热耗伤阴液法进行脾阴虚大鼠模型的复制，将SPF级雄性Wistar大鼠随机分为正常组、脾阴虚组和滋补脾阴方药组。使用实时荧光定量PCR（qPCR）法测定空肠GLUT1、GLUT5的mRNA表达，蛋白质印迹（Western Blot）法测定空肠GLUT1、GLUT5的蛋白表达。结果：与正常组比较，脾阴虚组GLUT1、GLUT5的mRNA和蛋白表达量均下降（P<0.05）；与脾阴虚组比较，滋补脾阴方药组能够明显上调GLUT1、GLUT5的mRNA表达水平（P<0.01），并增加GLUT1、GLUT5蛋白的表达含量（P<0.05）。结论：通过上调脾阴虚大鼠空肠GLUT1、GLUT5 mRNA和蛋白的表达，可能是ZBPYR对脾阴虚证发挥干预作用的机制之一。     

滋补脾阴方药对脾阴虚痴呆大鼠脑内NMDA受体mRNA表达的影响

目的：观察滋补脾阴方药对脾阴虚痴呆大鼠脑内N-甲基-D-天冬氨酸受体（NMDAR）亚单位NR1、NR2A、NR2B mRNA表达的影响。方法：运用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）技术,对NMDAR亚单位NR1、NR2A、NR2B mRNA在各脑区的表达状况作相应的检测。结果：痴呆组以及脾阴虚痴呆组大鼠NMDAR亚单位NR1、NR2A、NR2B mRNA在各脑区表达均明显减弱下调（P<0.05）;ZBPYR治疗组NMDAR亚单位NR1、NR2A、NR2B mRNA均明显上调（P<0.05）。结论：使用ZBPYR治疗的大鼠NMDAR mRNA的表达水平在各脑区均明显上调,这表明ZBPYR以提升NMDAR mRNA的方式,使得NMDAR蛋白的含量显著增多,而发挥其抗痴呆作用。     

黄芪多糖对毒胡萝卜素诱导人结肠癌系HT29细胞内质网应激的影响

目的探讨黄芪多糖(Astragalus polysaccharides,AP)对毒胡萝卜素内酯(Thapsigargin,Tg)诱导人结肠癌系HT29细胞发生内质网应激(Endoplasmic Reticulum Stress,ERS)时内质网结构变化及相关分子GRP78和CHOP的影响。方法常规培养HT29细胞后,将细胞分为4组:①空白细胞组(Control组):细胞不做任何药物处理;②细胞模型组(Model组):采用1μmol/L Tg诱导HT29细胞建立ERS模型;③黄芪多糖低浓度组(AP-L组);④黄芪多糖高浓度组(AP-H组)。CCK8法检测黄芪多糖对HT29细胞活性,透射电镜观察内质网结构变化,Real-time PCR法检测ERS时GRP78、CHOP mRNA表达情况。结果黄芪多糖浓度分别为1、10μg/mL,且分别作用HT29细胞12、24、36、48 h时,细胞存活率随着浓度的增加而增加,说明对细胞无明显毒副作用。透射电镜观察Control组内质网结构呈网膜状结构,网膜腔不扩张;Model组内质网形态迥异,大小不一,呈空泡状改变,部分可见融合成簇现象;AP-L组内质网网膜腔扩张程度减轻,空泡体积减小和数量减少;AP-H组内质网形态基本恢复正常,呈网膜状结构,可见数量较少,形态较小的空泡状结构。Real-time PCR法检测结果:与Control组相比,Model组HT29细胞GRP78、CHOP mRNA表达明显增加(P<0.05);与Model组比较,AP-L组和AP-H组HT29细胞GRP78、CHOP mRNA表达均减少(P<0.05);与AP-L组比较,AP-H组HT29细胞GRP78、CHOP mRNA表达减少(P<0.05)。结论黄芪多糖能够抑制Tg诱导HT29细胞发生ERS,其机制可能与降低GRP78和CHOP的表达、减轻内质网应激有关。     

中介素通过抑制内质网应激保护缺氧复氧损伤的大鼠肾小管上皮细胞

目的探讨中介素(intermedin,IMD)通过抑制内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)途径的细胞凋亡,发挥对大鼠肾小管上皮细胞NRK-52E缺氧复氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)损伤的保护机制。方法 NRK-52E细胞随机分为对照组;H/R组;空质粒(H/R+p IRES2)组;IMD(H/R+IMD)组。四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞活力;Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡;Realtime PCR法和Western-blot法分别检测ERS相关经典分子GRP78、CHOP、Caspase 12在mRNA及蛋白水平的表达;ER特异性荧光染料Dapoxyl用于观察ER形态变化。结果 MTT结果显示,H/R组NRK-52E细胞存活率较对照组明显下降,而IMD转染后细胞存活率提高;肾小管上皮细胞NRK-52E经H/R处理后出现凋亡,细胞凋亡率显著增加,同时H/R可导致ERS途径经典分子GRP78、CHOP、Caspase 12的mRNA和蛋白表达均显著上调;IMD转染后可显著降低NRK-52E细胞凋亡,细胞凋亡率降低,ERS途径经典分子GRP78、CHOP、Caspase 12的mRNA和蛋白表达均明显下降。内质网染色结果显示,H/R可以导致内质网结构受损,Dapoxyl染料聚集,荧光强度加强,内质网颗粒感增强,荧光颗粒分布不均、浓集,并有空泡;IMD转染后内质网结构受损减轻。结论大鼠肾小管上皮细胞NRK-52E H/R损伤过程中可能存在ERS凋亡途径的活化,IMD可以通过抑制ERS相关的凋亡信号通路,从而减少肾小管上皮细胞凋亡,减轻肾脏IRI。     

保肾冲剂对系膜增生性肾小球肾炎大鼠肾组织内质网应激相关蛋白葡萄糖调节蛋白78表达的影响

目的观察保肾冲剂对系膜增生性肾小球肾炎(Ms PGN)大鼠肾脏的保护作用及内质网应激(ERS)相关蛋白葡萄糖调节蛋白78(GRP78)表达的影响,探讨其作用机制。方法将21只雄性SD大鼠随机分为造模组(14只)及空白对照组(7只)。造模组大鼠予尾静脉注射抗大鼠胸腺细胞抗血清(ATS)建立Ms PGN模型,造模成功后再随机分为模型组及中药组,每组7只。中药组给予保肾冲剂药液灌胃,空白对照组和模型组予等容积0.9%氯化钠注射液灌胃,连续14周。实验结束后,观察比较各组大鼠治疗前后24 h尿蛋白定量(24 h UTP)及血肌酐(Cr)水平变化,并检测大鼠肾组织内GRP78蛋白及基因表达水平情况。结果治疗前中药组及模型组大鼠24 h UTP及Cr水平均明显高于空白对照组(P0.05),治疗后中药组大鼠24 h UTP及Cr水平较模型组均明显降低(P0.05);模型组及中药组大鼠治疗后GRP78蛋白及基因表达水平IOD值均明显高于空白对照组(P0.05),但中药组大鼠治疗后GRP78蛋白及基因表达水平IOD值均低于模型组(P0.05)。结论 Ms PGN大鼠肾脏组织GRP78表达增高,提示ERS可能参与其肾脏损害过程,而中药保肾冲剂对Ms PGN模型大鼠肾脏具有一定的保护作用,可减轻大鼠肾功能损害,降低大鼠24 h UTP及Cr水平,降低GRP78蛋白及基因表达水平,从而起到治疗作用,且抑制ERS相关蛋白GRP78的过度表达可能是其减轻肾功能损害的重要作用机制靶点之一。     

冬凌草甲素通过内质网应激诱导胰腺癌细胞凋亡的研究

目的 探讨冬凌草甲素通过内质网应激诱导胰腺癌细胞凋亡的机制。方法 选取胰腺癌SW1990和Panc-1细胞株作为研究对象。采用细胞计数试剂-8(cell counting kit-8,CCK-8)和流式细胞术分别检测细胞增殖和凋亡情况,蛋白印迹法检测内质网应激相关因子葡萄糖调节蛋白78(glucose regulated protein 78 kD,GRP78)、环磷酸腺苷反应元件结合转录因子同源蛋白（C/EBP-homologous protein,CHOP）、裂解的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白水解酶-12(cleaved cystein aspartate specific proteinase-12,cleaved Caspase-12)、活化的（active）Caspase-3、cleaved Caspase-3、cleaved多腺苷二磷酸多聚酶[poly(ADP-ribose) polymerase,PARP]的蛋白表达水平,实时荧光定量RCR检测GRP78、CHOP、Caspase-12的m RNA表达水平。结果 冬凌草甲素浓度和时间相关性抑制SW1990和Panc-1细胞增...     

橙皮素通过激活内质网应激C/EBP同源蛋白诱导人神经胶质瘤细胞凋亡实验研究

目的:分析橙皮素(HES)对人神经胶质瘤细胞凋亡的影响及相关分子机制。方法:将人神经胶质瘤U251细胞分为100 μmol/L橙皮素组、200 μmol/L橙皮素组、400 μmol/L橙皮素组、600 μmol/L橙皮素组、800 μmol/L橙皮素组、阴性对照组、4-苯基丁酸(4-PBA)组、橙皮素加4-苯基丁酸组、转染对照组、C/EBP同源蛋白(CHOP)低表达组、橙皮素加转染对照组、橙皮素加CHOP低表达组。采用CCK-8法检测细胞增殖活性,Hoechst 33258染色法和Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡率,qRT-PCR法检测CHOP mRNA表达水平,Western blot法检测细胞凋亡蛋白和内质网应激(ERS)蛋白表达水平。结果:HES对胶质瘤U251细胞的增殖抑制作用呈剂量和时间依赖性,与阴性对照组比较,HES可诱导U251细胞凋亡,上调Caspase-3、剪切Caspase-3、多聚ADP核糖聚合酶(PARP)、剪切PARP蛋白以及CHOP、ERS蛋白分子伴侣葡萄糖调节蛋白78、X盒结合蛋白1(XBP-1)、激活转录因子6蛋白表达量和磷酸化真核起始因子2α/eIF2α。4-PBA可逆转HES引起的ERS蛋白和凋亡蛋白表达变化; 干扰CHOP表达可逆转HES对凋亡蛋白的调控作用。结论:HES通过介导ERS途径CHOP诱导胶质瘤细胞凋亡。