竹节参毛状根培养体系的建立及人参皂苷Re的合成

目的:建立竹节参毛状根的诱导方法和培养体系,并对其生长特性和所合成的人参皂苷Re的含量进行分析。方法:用卸甲型根癌农杆菌C58C1菌株感染竹节参预培养的地上茎,诱导毛状根产生,在1/2MS培养基上扩大培养并测定其生长特性;用PCR检测竹节参转化毛状根的T-DNA及HPLC测定人参皂苷Re含量。结果:C58C1菌株能诱导竹节参地上茎产生毛状根,在浸染25min时,诱导率最高,为90%;经PCR检测,C58C1菌株Ri质粒上的rolB基因已经整合到竹节参毛状根基因组中;HPLC检测发现,竹节参毛状根均能合成人参皂苷Re,其中含量最大的是1/2MS液体培养的单克隆PJ8,其值高达60.26 mg.g-1。结论:初步建立了竹节参毛状根的诱导和培养方法,为大规模培养竹节参毛状根以生产高含量的人参皂苷Re奠定了实验基础。     

红参中人参皂苷Rg1和人参皂苷Re的含量测定

目的：改进红参中人参皂苷Rg1和人参皂苷Re的含量测定方法。方法：高效液相色谱法。色谱柱为C18柱，流动相为乙腈-水(20：80)，检测波长为203nm。结果：人参皂苷Rg1和人参皂苷Re的线性范围分别为0．6008-6．0080μg和0．4032-4．0320μg；平均回收率分别为98．5％(RSD：1．3％，n=6)和99．2％(RSD=1．1％，n=6)。结论：本法简单、快速，结果准确。     

Ri质粒人参转化系统的建立及鉴定

目的 :建立人参毛状根转化体系。方法 :利用含有Ri质粒的发根农杆菌Agrobacterium rhizogenes感染人参Panax ginseng进行毛状根诱导 ,利用PCR技术及TLC分析方法对毛状根进行鉴定。 结果 :首次从人参带叶幼茎处诱导出毛状根 ,用激素和AS(乙酰丁香酮 )处理可提高转化率并缩短转化时间。毛状根在无激素B5培养基上生长并失去向地性 ,月增长倍数可达 50倍 (鲜重 )。PCR分析证实农杆菌Ri质粒含有rolC序列 (564bp)的T DNA已整合到人参转化株的染色体组中 ,TLC分析证明T DNA特异的表达产物冠瘿碱在转化细胞中合成。人参毛状根中人参总皂苷含量为 2.486% (干重 ) ,而人参原药材总皂苷含量为 1.403% (干重 )。结论 :人参毛状根生长迅速 ,皂苷含量高于原药材 ,该体系的建立为利用生物技术工业化生产人参活性成分奠定了基础。     

真菌诱导子对人参毛状根皂苷生物合成和生长的影响

目的 :考察真菌诱导子对人参毛状根的生长和人参皂苷生物合成影响。方法 :提取黄瓜炭疽病菌Colletorichumlagnarinm、青菜炭疽病菌Phomafiltrate、棉花枯萎病菌Fusariumoxysponum、黑曲霉Asperillusniger中的真菌诱导子与人参毛状根共培养 ,应用HPLC及比色法对培养物中总苷及几种单体皂苷进行分析测定。结果 :真菌诱导子不但能影响人参毛状根总苷的合成量 ,也能使某些单体皂苷消失或增加 ,如培养液中黑曲霉多糖诱导子增加到 20mg·L^-1浓度时 ,使总苷含量增加到 3.649% ,而单体皂苷中Rg₁和Re未检出 ,Rg₂ 和Rb₁的含量则有明显增加 ,并可促进人参毛状根的生长。结论 :真菌诱导子对人参毛状根某些皂苷的合成具有特异性 ,同时也影响人参毛状根的生物量。培养过程中通过外源性诱导子的添加 ,有利于人参毛状根次生代谢产物的定向积累。     

人参Ri质粒转化及代谢产物对HepG2细胞的作用

目的:发状根生产的次生代谢产物含量比植物自身合成的含量高几倍甚至几十倍,利用人参发状根可以生产大量人参皂苷,并有效的抑制癌细胞的增值。方法:通过正交试验设计筛选人参发状根诱导的条件,通过发状根生物积累量和皂苷含量的测定确定培养条件,然后利用MTT法测定了人参皂苷对HepG2细胞的影响。结果:本实验优化了人参发状根的最佳诱导条件,吸光度A 0.6,侵染时间为10 min,预培养时间为3 d,筛选出发状根的最佳培养条件,MS培养基,pH 6.1,24℃培养时,发状根的生物积累量和皂苷含量均较高,采用人参总皂苷对肝癌细胞HepG2的抑制效果进行研究,证实人参总皂苷对HepG2的抑制率与给药浓度呈正相关。结论:筛选出最适的人参发状根诱导及培养条件,不同部位的总皂苷对肝癌细胞HepG2的增殖均具有抑制作用。     

人参毛状根生物合成熊果苷的研究

目的 :研究人参毛状根生物合成熊果苷的基本条件。方法 :以熊果苷的含量、氢醌 (1,4-对苯二酚 )的转化率为指标 ,找出适于生物合成的培养条件、持续时间和底物浓度。结果 :培养 22d的人参毛状根更换含底物的B₅培养基后 ,对浓度为 2mmol·L^-1的氢醌持续转化 24h ,所合成的熊果苷占干重的 13.0% ,转化率达 89.0%。结论 :本文首次以人参毛状根为反应器 ,人工合成出人参属植物所不具有的熊果苷。     

人参皂苷Rg1与人参皂苷Re含量测定方法的研究

目的：建立人参皂苷Rg1、Re的含量测定方法。方法：采用HPLC色谱法，流动相为乙腈-0．05％磷酸（199：801），检测波长为203nm，Echrom C18柱。结果：人参皂苷Rg1在0．032～0．192mg／ml范围内线性良好；人参皂苷Re在0．024～0．144mg／ml范围内线性良好。平均回收率为97.59％，RSD为1．64％。结论：该方法简便稳定，准确．重现性好，可用于控制人参药材的质量。     

HPLC法测定参苓白术颗粒中人参皂苷的含量

目的：建立HPLC法测定参苓白术颗粒中人参电苷的含量。方法：采用色谱柱：J＇sphere ODS-H80，流动相：乙腈-0．05％磷酸溶液（19．5：80．5），以人参皂苷为对照品，检测波长203nm。结果：人参皂苷Rg1在1.04～5.2μg、人参皂苷Re在0．48-2．4μg范围内线性良好。人参皂苷Rg1平均回收率98．29％，RSD为2．63％；人参皂苷Re平均回收率98．17％，RSD为1．82％。结论：该方法准确、灵敏，可用于参苓白术颗粒的质量控制。     

人参叶中总皂苷及人参皂苷Rg1、Re含量测定

目的：研究人参叶中总皂苷及人参皂苷Rg1、Re的含量测定方法。方法：采用紫外分光光度法,以人参皂苷Re为对照品,香草醛-冰醋酸-高氯酸为显色剂,测定人参叶总皂苷的含量;采用HPLC法测定人参皂苷Rg1、Re的含量。结果：人参叶中总皂苷、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re分别在25．2～151．2／,g、0．510～5．10μg、1．020～10．20μg范围内线性关系良好,平均回收率分别为99．53％（RSD=2．00％,n=6）,99．02％（RSD=2．07％,n=6）和100．16％（RSD=2．67％,n=6）。结论：该方法重复性好,结果准确、可靠,为人参叶的质量控制提供了-定的参考。     

HPLC法测定人参、三七颗粒中四种皂苷类成分的含量

目的：建立测定人参、三七颗粒中四种皂苷类成分含量的高效液相色谱方法。方法：WatersNova—Pakc18（150×3．9mm 4μm）色谱柱，流动相为乙腈-水溶液梯度洗脱，流速为1．0mL／min，检测波长为203nm。结果：三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re和人参皂苷Rbl分别在0．210～1．890μg，0．822—7．398μg，0．203～1．827μg及11．22—10．98μg范围内线性关系良好，相关系数r均大于0．9995。三七皂苷R1的回收率为101．7，RSD=2．3％（n=5）；人参皂苷Rg1的回收率为97．4，RSD=1．3％（n=5）；人参皂苷Re的回收率为98．9，RSD=1．6％（n=5）；人参皂苷Rb1的回收率为100．4RSD=0．9％（n=5）。结论：本方法操作简便，分离效果好，灵敏度高，重复性好，可用于控制人参、三七颗粒的质量。     

长春花毛状根培养及抗癌生物碱产生的研究

目的:建立长春花毛状根转化体系,从毛状根中获得生物碱。方法:用发根农杆菌A₄和R₁₀₀₀菌株分别感染长春花的不同外植体获得毛状根,并对毛状根的培养条件进行优化。结果:采用A₄感染叶片,分别预、共培养2d及添加100mg·L^-1的乙酰丁香酮(A_s)可得到最佳转化效果,毛状根的诱导率达86.25%。以蔗糖为碳源及以水解乳蛋白为氮源的1/2MS培养基为毛状根的最佳生长条件。检测结果表明,毛状根中的总生物碱含量高于长春花的原植株和愈伤组织。结论:可通过毛状根的培养来获得抗癌生物碱长春碱和长春新碱等。     

光照和植物生长物质对宁夏枸杞正常根和发状根离体生长的影响

目的:探索光照和植物生长物质对宁夏枸杞无菌苗正常根和发状根离体生长的影响,建立离体根的最佳培养体系。方法:以宁夏枸杞无菌苗正常根和发根农杆菌A₄诱导叶外植体再生的发状根为材料,观察根切段在光照、植物生长物质种类和含量等不同的培养条件下的生长(长长、侧根形成)情况。结果与结论:MS培养基中添加植物生长物质(IAA,IBA,NAA)能够诱导宁夏枸杞正常根切段的生长和分枝形成,而1 mg.L^-1IBA的存在最适合于正常根的长期离体培养。在无激素培养基上,光照能促进Ⅱ型发状根的长度增长和分枝侧根,却不利于Ⅰ型发状根的生长。在添加的3种外源植物生长物质(IAA,IBA,NAA)中,低含量的IAA更适合于Ⅰ型发状根的增长培养;而在促进Ⅱ型发状根的增长和侧根形成方面,1 mg.L^-1IBA的作用最强。随着植物生长物质添加含量的增加,Ⅱ型发状根的愈伤组织化程度也加大,同时也抑制了从发状根或其形成的愈伤组织上形成新的分枝侧根。     

石斛毛状根诱导及培养条件的优化

目的:建立石斛毛状根体系.方法:用发根农杆菌A4菌株诱导石斛外植体获得毛状根,并对毛状根的培养条件进行优化.结果:以蔗糖(3%)为碳源,添加水解乳蛋白(1g/L)的1/2MS培养基为毛状根的最佳生长条件.     

四倍体菘蓝毛状根培养系统的建立及外界因子对其生长的影响

用发根农杆菌Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ Ｒ１６０１,Ａ４,ＡＴＣＣ１５８３４菌株感染菘蓝Ｉｓａｔｉｓ ｉｎｄｉｇｏｔｉｃａ Ｆｏｒｔ,同源四倍体的子叶１０ｄ后,在子叶切口处均能陆续长出毛状根。转化根在不含激素的ＭＳ固体培养基上快速生长并表现出典型的毛根性状,经冠瘿碱分析证明确已被转化。建立了毛状根培养系统并比较了各种外界因子生长的影响。     

Thin layer chromatography and extractive technology of Panax japonicum C.A. Mey. var. major (Burk.) C. Y. Wu et K. M. Feng growing in Qingba Mountain Area]

Chemical components of the root, stem and leaves of Panax japonicum var. major were compared with those of Radix ginseng and Radix notoginseng by TLC. The results showed that the total saponin of the root Panax japonicum var. major was closer to that of Radix ginseng and the total saponin of its stem and leaves was similar to Radix notoginseng. A better extractive technology was obtained after isolating and purifying the whole herb of Panax japonicum var. major by ethyl alcohol at different concentrations. The components were compared by TLC. The results showed that with 60% ethyl alcohol the yield of the total extract was 17.15%.     

人参多糖含量测定方法研究

目的:建立人参多糖含量测定方法。方法:以人参精制多糖测得人参多糖对葡萄糖的换算因子,以苯酚-硫酸分光光度法测定人参多糖的含量。结果:供试液在2h内显色稳定,重现性好,平均回收率为99.8%,RSD为2.57%。人参多糖含量为28.56%,RSD为1.81%。结论:该方法简便,快速,测定结果客观,准确。     

丹参转基因毛状根离体培养体系的建立及分析

目的:建立起丹参的转基因毛状根诱导及离体培养体系。方法:考察了不同外植体、不同农杆菌侵染时间和共培养时间诱导丹参毛状根的效率,共培养外植体用400 g.L-1Cef水除菌5 min,接种在MS+400 g.L-1Cef+2.5 g.L-1Hyg的固体培养基上,完全除菌后转接入6,7-V+2.5 g.L-1Hyg液体培养基继代培养,GFP荧光检测阳性毛状根,PCR检测农杆菌特征基因rolC,并测定不同生长时期的毛状根干重和二氢丹参酮I的积累。结果:用丹参叶片基部诱导毛状根,成功率可达到93.3%;农杆菌侵染10 min诱导效率最高为63.3%;共培养2～3 d诱导效果最好;PCR结合GFP荧光检测的方法鉴定阳性转基因材料具有较高的可信性;丹参毛状根生物量变化与次生代谢物积累之间有着紧密联系。结论:成功建立起丹参转基因毛状根离体培养体系,为进一步的基因工程应用打下基础。