脱水淫羊藿素与金雀异黄酮对MCF-7、MDA-MB231细胞株增殖的影响研究

目的比较脱水淫羊藿素与金雀异黄酮对受体状态不同的人乳腺癌细胞株增殖的影响。方法运用MTT法研究不同浓度的脱水淫羊藿素与金雀异黄酮对MCF-7、MDAMB231细胞增殖的影响,并以雌激素受体阻断剂ICI182,780和雌激素受体激动剂DPN、PPT为工具药来评价脱水淫羊藿素和金雀异黄酮雌激素样作用与雌激素受体(ERs)的关系。结果脱水淫羊藿素和金雀异黄酮终浓度为10~(-13)~10~(-7)mol/L时,MCF-7细胞株增殖均随浓度升高而增加,呈一定的剂量相关性;而各受试药物任何浓度对MDA-MB231细胞株均无显著增殖效果。加入终浓度为10~(-8)mol/L的ICI182,780时,MCF-7细胞增殖作用被拮抗,MDA-MB231细胞增殖无明显变化。加入终浓度为10~(-8)mol/L的ERα受体通路激动剂PPT时,MCF-7细胞增殖率明显增高(P<0.05),MDA-MB231细胞增殖无明显变化。加入终浓度为10~(-8)mol/L的ERβ受体通路激动剂DPN时,MCF-7和MDA-MB231细胞增殖均无明显变化。结论脱水淫羊藿素与金雀异黄酮在一定剂量范围内均有雌激素样作用,两者作用相当,体外实验促进MCF-7细胞增殖作用可能主要是由ERα介导,而非ERβ介导。     

黑大豆乙醇提取物的雌激素样作用及其机制研究

目的:评价黑大豆乙醇提取物(black soybean ethanol extract,BSE)的雌激素样作用及其作用机制。方法:采用富含雌激素受体的雌激素依赖性人乳腺癌细胞株MCF-7细胞,分别以E-SCREEN法观察BSE对其增殖的影响、以RT-PCR法观察BSE对其雌激素效应基因mRNA表达的影响,并以雌激素受体拮抗剂ICI182,780为工具药来评价BSE发挥雌激素样作用的机制。结果:与溶剂对照组相比较,BSE(10～200μg.mL^-1)能显著促进MCF-7细胞的增殖,100μg.mL^-1时作用达到最大;BSE能明显诱导MCF-7细胞pS₂,孕激素受体(PR)基因mRNA的表达,并与药物浓度有一定相关性;以上作用均能被雌激素受体拮抗剂所完全拮抗。结论:BSE能促进MCF-7细胞的增殖,诱导雌激素效应基因mRNA的表达,即BSE能通过雌激素受体发挥雌激素样作用。     

薏苡仁水煎液雌激素样活性筛选研究

目的：对薏苡仁水煎液进行雌激素样活性筛选,探讨其作用机制。方法：首先通过小鼠子宫增重实验和人乳腺癌细胞（MCF-7）增殖实验对薏苡仁水煎液进行雌激素样活性筛选;以质粒pERE-TAL-luc、pβgal-Control、pCXN2-hERα或pCXN2-hERβ共转染的HEK293细胞株为模型,采用以ERE调控的报告基因luc瞬时表达检测技术,评价薏苡仁水煎液雌激素样作用的信号通路。结果：薏苡仁水煎液可显著的诱导性未成熟小鼠子宫系数的增加（P<0.01）,且在去雌激素的培养基中能够显著促进MCF-7细胞的增殖（P<0.01）; ERE调控的报告基因瞬时表达结果显示,分别由ERα和ERβ介导时,与正常组相比,薏苡仁水煎液的标准化荧光素酶活性明显升高（P<0.05或P<0.01）。结论：薏苡仁水煎液可诱导性未成熟小鼠子宫系数的增加,在去雌激素的培养基中诱导MCF-7人乳腺癌细胞的增殖,首次发现薏苡仁具有雌激素样作用,且主要是通过ERβ介导发挥雌激素样作用。     

芒柄花素的植物雌激素作用研究

目的:探讨芒柄花素的雌激素样作用及其可能机制。方法:选取当归、黄芪、红三叶草中含有的黄酮类物质之一——芒柄花素,利用ER阳性T47D细胞,检测其对细胞增殖速率、分裂增殖指数以及ER亚型表达的影响,评价芒柄花素的植物雌激素活性。结果:MTT增殖试验结果显示,1×10-7~1×10-6mol.L-1芒柄花素不能促进人乳腺癌细胞T47D的体外增殖;在ICI182,780抑制试验中,芒柄花素可能能够与ICI182,780协同作用抑制T47D细胞体外增殖;流式细胞术测定细胞周期结果显示,1×10-7~1×10-6mol.L-1芒柄花素对T47D细胞的分裂增殖指数没有影响;芒柄花素有增强T47D细胞ERα表达的作用(P0.05)。结论:芒柄花素能够在体外条件下增强T47D细胞ERα表达,具有植物雌激素样作用,但该物质不能促进T47D细胞的体外增殖。     

葛根素和葛根总异黄酮的雌激素样活性

目的：研究葛根素和葛根总异黄酮的雌激素样活性。方法：去卵巢大鼠、幼年小鼠、成年小鼠和雌激素化小鼠灌胃给予葛根素和葛根总异黄酮150－600mg/kg，连续5－9天后，阴道脱落细胞检查和子宫重量法判断雌激素样作用。结果：葛根素和葛根总异黄酮能明显增加去卵巢大鼠阴道涂片中角化细胞数量，部分恢复去卵巢大鼠的性周期；使去卵巢大鼠和幼年小鼠子宫重量明显增加，这种作用呈明显的剂量依赖性。对正常成年小鼠的子宫生长无明显影响，在合用雌二醇时，葛根素和葛根总异黄酮均使雌二醇的促子宫生长作用明显减弱。结论：葛根素和葛根总异黄酮对雌激素低下动物显示弱雌激素活性，对正常雌激素水平动物无明显雌激素样活性，而在合用雌二醇时，则部分抑制雌二醇的促子宫生长作用，提示葛根素和葛根总异黄酮具有雌激素受体部分激动剂的特性。     

金雀异黄酮对体外培养成骨细胞缺氧损伤的保护作用

目的:研究金雀异黄酮(genistein,Ge)对缺氧培养条件下成骨细胞增殖、细胞周期、凋亡和成骨分化等的影响。方法:采用酶消化法分离培养SD大鼠颅骨成骨细胞并用三气培养箱建立缺氧模型。将细胞分为常氧对照组、缺氧对照组和缺氧加药组,其中缺氧加药组进一步分为Ge-6组、Ge-5组及Ge-4组,分别加入1×10-6,1×10-5,1×10-4mol.L-1金雀异黄酮。于缺氧处理36 h后分析各组的细胞存活率、乳酸脱氢酶漏出率、细胞凋亡率、细胞周期等,并用Real time RT-PCR法检测HIF-1α,Bcl-2及Caspase-3的基因表达情况。缺氧处理48 h后检测碱性磷酸酶活性、钙化结节数量和面积等成骨分化指标。结果:与缺氧对照组比较,金雀异黄酮可显著提高细胞存活率,降低乳酸脱氢酶漏出率,减少细胞凋亡并提高G1期细胞百分比,提高HIF-1α和Bcl-2 mRNA的表达水平,抑制Caspase-3 mRNA的表达水平,对碱性磷酸酶活性和钙化结节数量与面积等也有显著提高作用,并都呈现出剂量依赖性特点。结论:金雀异黄酮对成骨细胞缺氧损伤具有明显保护作用。     

淫羊藿苷及其拟代谢物的雌激素样作用研究

目的:用雌激素受体(Estrogen Receptor,ER)表达阳性细胞株人乳腺癌细胞MCF-7检测淫羊藿苷及其拟代谢物的雌激素样活性[1]及构效关系。方法:用MTT法,增殖细胞核抗原(Proliferating CellNuclear Antigen,PCNA)免疫组化法检测其对体外培养MCF-7细胞增殖及细胞周期的影响;Real-timeRT-PCR法检测ERα、ERβ和PS2 mRNA表达水平变化。结果:淫羊藿素促进MCF-7增殖,而淫羊藿苷、淫羊藿次苷I和脱水淫羊藿素促增殖效应不明显;淫羊藿素10-9mol.L-1组PCNA阳性表达强于其它三组;淫羊藿素极显著增加ERα和PS2 mRNA的表达水平。所有受试物均不促进ERβmRNA表达。淫羊藿素促进ERα蛋白表达强于其它三组。结论:淫羊藿素有明显的雌激素样作用,而淫羊藿苷及其它两种受试物雌激素样作用不明显。四种受试物均不促进ERβmRNA表达。     

杜仲雌激素样作用实验研究

目的用体外实验检测杜仲的雌激素样作用,并对其可能的作用机制进行探讨。方法采用MCF-7细胞增殖实验对杜仲进行雌激素样活性筛选,稳定转染ERα-ERE、ERβ-ERE荧光素酶报告基因的HEK293细胞荧光表达实验、蛋白质免疫印迹法探讨其作用机制。结果杜仲在0.5 ～1 mg/ml时可诱导MCF-7细胞增殖,1 mg/ml杜仲能显著促进ERE报告基因荧光素酶表达,差异有统计学意义(P 0.05、P 0.01 或P 0.001),1 mg/ml可上调雌激素受体ERα、ERβ的蛋白表达,0.5 ～1 mg/ml可上调雌激素膜受体GPR30的表达。结论杜仲具有雌激素样作用,其作用机制在于能与雌激素受体结合发挥作用。     

女金丹雌激素样作用的实验研究

本文研究了女金丹对成熟去卵巢小鼠和未成熟小鼠的子宫脏器系数、子宫摄水增加量以及成熟去卵巢小鼠阴道上皮细胞角化的影响,结果表明:15g/kg和7.5g/kg剂量的女金丹复方制剂均明显增加未成熟小鼠的子宫重量和子宫水摄取增加量,并恢复成熟小鼠因摘除卵巢而消失了的动情周期。15g/kg剂量更能明显增加成熟去卵巢小鼠的子宫重量和子宫水摄取增加量。提示女金丹作用于小鼠有雌激素样作用。     

补骨脂雌激素样作用的有效成分研究

目的筛选中药补骨脂类雌激素样作用的有效成分。方法采用系统溶剂法对补骨脂药材进行分段制样,通过小鼠子宫增重法筛选出活性部位;对石油醚部位进行硅胶柱色谱分离,通过小鼠子宫增重法筛选出有效成分。结果补骨脂石油醚提取部位高剂量组(5g/kg)能显著增加子宫重量和子宫系数,与正常对照组相比有显著性差异(P<0.01),具有较强的类雌激素样作用;从补骨脂石油醚提取部位分离得到的化合物补骨脂酚具有显著的雌激素样活性(P<0.01)。结论补骨脂酚为中药补骨脂雌激素样作用的有效成分之一。     

淫羊藿苷促成骨细胞分化成熟主要不依赖其雌激素活性

目的：利用人乳腺癌细胞MCF-7检测淫羊藿苷（icariin,I）与染料木黄酮（genistein,G）雌激素样活性的大小。方法：MCF-7细胞系采用无酚红DMEM培养基（含5%活性炭吸附处理血清CS-FBS）培养48 h后,利用CCK-8试剂盒检测不同浓度的I和G对体外培养MCF-7增殖的影响,筛选出最佳药物浓度;以最佳浓度的I和G处理细胞12,24,36,48 h后提取总RNA,Real-time RT-PCR检测I和G对MCF-7细胞雌激素受体α（ERα）、雌激素受体β（ERβ）、雌激素调节蛋白（PS2）、孕激素受体（PR）mRNA表达水平的影响;以最佳浓度的I和G处理MCF-7细胞48 h后,Western blot检测G和I对MCF-7细胞ERα,ERβ,PS2,PR蛋白表达量的影响。结果：I和G均能显著促进MCF-7的增殖,其中最佳的I和G作用浓度为10 μmol·L^-1,并且在该浓度下G促MCF-7增殖的能力明显高于I;I和G作用MCF-7 细胞24,36 h后,10 μmol·L^-1的 I和G均能显著促进ERα,ERβ,PS2,PR mRNA表达水平,其中G促进ERα,PS2,PR mRNA表达的能力明显强于I,对于ERβ mRNA的表达两者没有显著性差异;Western blo检测结果表明,10 μmol·L^-1的 I和G均能促进ERα,ERβ,PS2,PR 蛋白的表达,其中G促进ERα,PS2,PR蛋白表达的能力明显强于I,对于ERβ蛋白的表达两者没有显著性差异。结论：10 μmol·L^-1的G和I都具有较强的雌激素活性,但是该浓度下G的雌激素活性明显高于I,而本课题组前期研究表明,I在促进成骨细胞分化成熟及生物矿化的药理学活性明显强于G,因此I促成骨细胞分化成熟主要不是依赖其雌激素活性。     

植物雌激素的研究进展

植物雌激素是植物中一类结构与功效类似于动物雌激素的天然杂环多酚类化合物,能够与雌激素受体亚基(ERα或ERβ)结合,发挥雌激素样或抗雌激素样作用。就植物雌激素成分的结构分类以及含植物雌激素成分的中药进行归纳总结,以期在数以千计的中药中寻找到具有雌激素样或抗雌激素样活性的新药源。     

柚皮苷对体外培养乳鼠颅骨成骨细胞增殖和分化成熟的影响

目的:研究柚皮苷对体外培养大鼠乳鼠颅骨成骨细胞(rat calvarial osteoblasts,ROB)增殖和分化成熟的影响.方法:取新生SD大鼠颅骨,多次酶消化法培养ROB,每3d换液1次,铺满80％皿底后传代培养.采用终浓度分别为1×10-4,1 ×10-5,1 ×10-6,1×10-7 mol·L-1的柚皮苷进行药物干预,MTT法检测细胞增殖率,同时检测成骨性诱导培养9d后的碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性,筛选出最佳浓度.以最佳药物浓度干预ROB的分化成熟,比较柚皮苷组和不加药的对照组之间的骨钙素(osteocalcin,OC)、骨桥蛋白(oesteopontin,OPN)、骨形态发生蛋白-2(bone morphogenetic protein2,BMP-2)的分泌量;提取总RNA,Real-time RT-PCR检测bFGF,IGF-1,Runx-2,Osterix,ERα和ERβ的mRNA水平;Westernblot法检测ERα,ERβ和Ⅰ型胶原蛋白的表达量;并用雌激素竞争性抑制剂ICI 182.780进行阻断,观察阻断前后各指标的变化情况.结果:柚皮苷剂量依赖性刺激成骨细胞的增殖,并可强烈促进ROB的分化成熟.最佳药物浓度为1×10-5 mol·L-1,该浓度下的柚皮苷可明显提高OC,OPN和BMP-2的分泌量,促进与成骨相关的因子bFGF,IGF-1,Runx-2,Osterix和雌激素受体基因ERα及ERβmRNA的表达,同时也可增强ERα,ERβ和Ⅰ型胶原蛋白的分泌,但以上效果均可被阻断剂ICI 182.780所抑制.结论:浓度为1 ×10-5mol·L-1的柚皮苷可显著促进ROB的增殖与分化成熟,并且该促进效果会被雌激素通路阻断剂ICI 182.780所抑制,表明柚皮苷属于植物雌激素,通过雌激素信号通路发挥其促骨形成活性,可以用于骨质疏松症的防治.     

淫羊藿苷与染料木黄酮对体外培养成骨细胞增殖及矿化成熟影响的对比研究

目的:对比研究淫羊藿苷( icariin,I)与染料木黄酮(genistein,G)对体外培养大鼠成骨细胞(rat calvarial osteoblasts,ROB)增殖与分化成熟的影响及其药理活性的强弱.方法:取新生SD大鼠颅骨,多次酶消化法获得成骨细胞,培养子含10％ FBS的MEM培养液中,3d后首次换液,铺满90％皿底后传代培养;I与G的作用终浓度为1×10-5 mol·L-1,增殖分析采用96孔板,MTT法分析;分化成熟分析采用24孔板,于成骨性诱导培养第3,6,9,12天分别测碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性、钙盐沉积量、骨钙素,第12天进行ALP组织化学染色、茜素红染色和钙化结节计数;于成骨性诱导培养0,6,12,24,48,72 h提取总RNA,Real-time RT-PCR法检测Runx-2,bFGF,IGF-I,Osterix( OSX)等成骨性相关因子的表达情况.结果:终浓度为1×10-5 mol·L-1的I与G均不促进ROB的增殖,均能显著提高细胞ALP活性、增加钙含量、促进骨钙素分泌,并增加钙化结节数量;同时上调Runx-2,bFGF,IGF-I和Osterix等成骨性相关因子的表达量;在成骨细胞水平上I促进ROB矿化成熟的药理学活性明显强于G的活性.结论:1×10-5 mol·L-1的I与G均能促进ROB矿化成熟,均有抗骨质疏松的作用,但在成骨细胞水平上I促进ROB矿化成熟的药理学活性显著强于G.     

糙苏素的抗肿瘤活性研究

目的:探讨藏药螃蟹甲中环烯醚萜类成分糙苏素(phlomiol)的抗肿瘤作用.方法:采用MTT法检测糙苏素对体外培养的2种人肿瘤细胞增殖的抑制作用;体内试验采用小鼠实体瘤S180、肝癌H22细胞株接种小鼠,连续给药14 d,计算抑瘤率.采用MTT比色法检测糙苏素对S180荷瘤小鼠NK细胞杀伤活性的影响和对S180荷瘤小鼠T淋巴细胞增殖反应的影响.结果:糙苏素在50～150 mg·L-1对2种肿瘤细胞增殖均有抑制作用,且呈剂量依赖关系(r=0.989,P<0.05);体内试验结果显示小鼠分别灌胃给予2.5,5,10 mg·kg-13个剂量的糙苏素,对接种的实体瘤S180、肝癌H22细胞株的抑瘤率分别为28.5%～65.0%.35.0%～74.5%.同时,糙苏素可显著提高S180荷瘤小鼠淋巴细胞增殖活性(P<0.05),显著增加S180荷瘤小鼠NK细胞的杀伤能力(P<0.05).结论:糙苏素对体外培养的人肿瘤细胞和接种的小鼠肿瘤具有明显抑制作用,能够增强淋巴细胞增殖功能和NK细胞的杀伤能力,具有抗肿瘤和免疫调节功能.     

欧前胡素体外经皮渗透研究

该文考察了欧前胡素的体外经皮渗透性及影响因素。 选择SD大鼠腹皮作为渗透模型,采用改良Franz扩散池法进行体外经皮渗透实验,HPLC测定欧前胡素的含量,考察不同接收液、不同皮肤处理方法及扩散液浓度对欧前胡素稳态渗透速率的影响。结果表明,20%乙醇,0.5%聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯(吐温-80)均能显著增加欧前胡素的稳态渗透速率;皮肤经20%乙醇、20%乙醇-1%吐温-80处理后,欧前胡素的透皮速率均有所增加,而只经1%吐温-80处理后,欧前胡素的透皮速率反而减小;欧前胡素的稳态渗透速率与扩散液的浓度相关,在低浓度时稳态渗透速率随浓度的增大而增大,当达到一定浓度后,稳态渗透速率无明显变化。由此可见乙醇可以改变皮肤角质层的结构,使药物的稳态渗透速率增加;吐温-80对稳态渗透速率的影响与皮肤结构的改变无关。欧前胡素的经皮渗透受浓度影响,是多种途径扩散的综合结果。     

瑞香狼毒提取物体外诱导肿瘤细胞凋亡作用比较研究

目的:体外比较瑞香狼毒提取物ESC,ESC-1,ESC-2对NCI-H157细胞的凋亡诱导作用。方法:采用流式细胞仪检测凋亡率;采用分光光度法检测caspase-3,8,9的活性;采用ELISA法观察凋亡通路Fas,Fas-L,TNF-α,TRAIL-R,Cyto-C,Smac/DIABLO蛋白的表达。结果:与对照组相比,ESC,ESC-1,ESC-2可明显提高NCI-H157细胞的凋亡率;ESC可明显提高NCI-H157细胞caspase-3,8酶的活力,ESC-2可明显提高NCI-H157细胞caspase-3,8,9酶的活力;ESC,ESC-1,ESC-2可显著上调NCI-H157细胞Fas蛋白的表达,ESC可明显增高Fas/Fas-L;ESC,ESC-1,ESC-2可显著上调NCI-H157细胞TNF-α蛋白的表达。ESC-1可显著下调NCI-H157细胞TRAIL-R的表达。ESC,ESC-1,ESC-2对NCI-H157细胞Cyto-C蛋白表达无显著性影响。ESC-1,ESC-2可显著下调NCI-H157细胞Smac蛋白的表达。结论:瑞香狼毒提取物诱导肿瘤细胞凋亡可能与调控死亡受体途径通路蛋白有关。瑞香狼毒提取物诱导肿瘤细胞机制复杂,可能存在双向调节的作用,其诱导凋亡是综合调控的结果。     

地龙体外抗凝血部位的制备工艺研究

目的:采用体外活性评价法,研究地龙基于膜分离技术抗凝血部位的制备工艺.方法:以蛋白质含量和酶活性为指标,采用单因素考察和正交试验优选地龙的提取、精制、浓缩工艺.结果:地龙体外抗凝血部位的制备工艺为地龙粗粉加入15倍量0.9%NaCl溶液,37℃超声提取3次,每次40 min;将上述提取液经30×103超滤膜进行精制,超滤液经10×103超滤膜进行浓缩.结论:超声提取技术与膜分离技术相结合,能够提高地龙抗凝血部位的分离纯化效果,有利于活性部位的进一步研究.