甘草查尔酮A通过调控MAPK信号通路抑制MH7A细胞增殖并诱导凋亡

目的:探讨甘草查尔酮A(licochalcone A,LCA)对类风湿性关节炎成纤维样滑膜细胞(MH7A)增殖和凋亡以及相关炎性因子的影响,并揭示丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路与LCA调控MH7A细胞增殖和凋亡的关系。方法:培养MH7A细胞,将细胞分为空白组,LCA各浓度给药组(10,20,40μmol·L~(-1));采用噻唑蓝(MTT)比色法和DAPI染色检测MH7A细胞增殖情况;PI染色和流式细胞仪检测MH7A细胞周期,Annexin V/PI染色后流式细胞仪检测MH7A细胞凋亡情况。实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测LCA对炎症因子白细胞介素-1β(IL~(-1)β)mRNA的影响;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测LCA对MAPK信号通路关键蛋白的影响,同时应用细胞外信号调节激酶(ERK)特异性抑制剂PD98059处理,观察磷酸化(p)-ERK和IL~(-1)β蛋白表达水平。结果:与空白组比较,LCA能剂量依赖性抑制MH7A细胞增殖,活细胞数量显著减少(P0.01),而进入细胞周期早期凋亡的细胞数量显著增多(P0.01)。此外,与肿瘤坏死因子-α(TNF-α,10μg·L~(-1))组比较,LCA能剂量依赖性逆转TNF-α导致的炎症因子IL~(-1)βmRNA表达的升高(P0.01)。与空白组比较,LCA能剂量依赖性的促进MAPK信号通路中关键蛋白ERK,氨基末端激酶(JNK)和p38的磷酸化表达(P0.01)。与PD98059组比较,ERK的剂量依赖性磷酸化作用被抵消,同时LCA 10,20μmol·L~(-1)对IL~(-1)β的抑制作用消失。结论:LCA能抑制MH7A细胞增殖和诱导其凋亡,可能与其促进MAPK通路相关蛋白磷酸化的表达继而抑制炎症因子的表达有关。     

川芎当归提取物对血管平滑肌细胞MAPK信号通路与周期蛋白的调控效应

目的揭示川芎当归提取物(ELCAS)抑制血管平滑肌细胞增生的分子机制。方法以体外培养的原代大鼠血管平滑肌细胞为研究对象,应用Westernblot方法检测不同质量浓度ELCAS对血管平滑肌细胞内的ERK、JNK、p38磷酸化水平的影响,以及周期蛋白CyclinD1和细胞周期抑制子p21的表达情况。结果ELCAS能显著抑制ERK、JNK和p38的磷酸化以及血清诱导的CyclinD1蛋白的表达,并表现出良好的浓度依赖性;同时ELCAS能剂量依赖性地促进细胞内周期蛋白抑制子p21过表达,并抑制pRb磷酸化水平和CyclinD1蛋白表达。结论ELCAS可通过抑制MAPK信号通路以及对周期蛋白的调控来抑制血管平滑肌细胞增生。     

白花蛇舌草-半枝莲药对组分诱导三阴性乳腺癌细胞凋亡的机制

目的:考察白花蛇舌草-半枝莲药对的活性组分诱导三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231凋亡及其作用机制。方法:超高效液相色谱法对药对活性组分中化学成分进行测定,噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞体外增殖力,克隆形成实验考察克隆形成的数量变化,流式细胞仪检测凋亡细胞的比例,蛋白质免疫印迹法检测蛋白及信号通路的变化。结果:制备药对以3种配比(1∶1,1∶2,2∶1)进行水煎后脱脂浸膏的乙酸乙酯组分(YDW11,YDW12,YDW21)。YDW11含有对羟基苯乙酮、野黄芩苷、木犀草素和芹菜素4种成分。通过比对这3个组分对乳腺正常上皮细胞10A1和三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231的体外增殖的影响,发现YDW11在25~50 mg·L-1对10A1细胞无细胞毒性,且抑制MDA-MB-231的体外增殖(P0.01),其抑制活性强于YDW12,YDW21。YDW11呈质量浓度和时间依赖性抑制三阴性乳腺癌细胞株MDA-MB-231,HS578T,BT549的体外增殖(P0.05,P0.01),但对MCF-7体外增殖影响不大。YDW11呈浓度依赖性抑制MDA-MB-231的克隆形成(P0.01),并诱导其凋亡(P0.01)。YDW11提高p21 mRNA和蛋白表达的同时,抑制增殖细胞核抗原(PCNA)的表达(P0.05,P0.01),抑制丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路中p38,c-Jun氨基末端激酶(JNK),细胞外调节蛋白激酶(ERK)的磷酸化(P0.05)。YDW11处理MDA-MB-231后,VASP在Ser157位点和Ser239位点的磷酸化水平提高(P0.05,P0.01),提示激活环状核苷酸(c AMP)和环磷酸鸟苷(c GMP)信号通路的活化。结论:白花蛇舌草-半枝莲药对等比配伍的乙酸乙酯组分(YDW11)在对乳腺正常上皮细胞10A1无毒的剂量25,50 mg·L-1,呈剂量和时间依赖性显著抑制三阴性乳腺癌细胞MDAMB-231的体外增殖、克隆形成并诱导凋亡。呈浓度依赖性提高周期抑制蛋白p21在mRNA和蛋白的表达水平,抑制PCNA的表达,抑制p38,JNK,ERK的磷酸化水平,提高VASP在Ser157和Ser239位点的磷酸化,部分通过c AMP/c GMP和抑制MAPK信号通路而诱导MDA-MB-231的凋亡。     

知母皂苷对Aβ25-35引起小脑颗粒细胞损伤的保护作用及其机制探讨

目的 观察知母皂苷对淀粉样β蛋白25-35( Aβ25-35)激活小鼠巨噬细胞引起小脑颗粒细胞损伤的保护作用及探讨其作用机制.方法 小鼠小脑颗粒细胞与腹腔巨噬细胞联合培养及腹腔巨噬细胞单独培养,损伤组加入Aβ25-35( 20μmol/L),保护组同时加入不同质量浓度知母皂苷(10、30、100μmol/L).联合培养的细胞通过免疫组化染色观察微管相关蛋白-2( MAP-2)的表达和测定乳酸脱氢酶(LDH).单独培养的巨噬细胞用ELISA法和Griess法分别测定培养液中白细胞介素-1β(IL-1β)和一氧化氮(NO).Western blot检测巨噬细胞磷酸化p38MAPK表达水平.结果 知母皂苷组可使MAP-2表达阳性的小脑颗粒细胞数目较Aβ25-35组明显增加,LDH漏出量减少;巨噬细胞培养液中IL-1β和NO生成量减少以及巨噬细胞磷酸化p38MAPK表达水平明显降低.SB203580也能抑制Aβ25-35引起的IL-1β和NO生成量增加.结论 知母皂苷通过抑制Aβ25-35激活巨噬细胞p38MAPK通路,使IL-1β和NO表达水平降低,从而对小脑颗粒细胞起到保护作用.     

知母皂苷AⅢ对白血病细胞HL-60增殖、凋亡和细胞周期的影响及机制探讨

目的探讨知母皂苷AⅢ对人白血病细胞HL-60增殖、凋亡和细胞周期的影响及可能机制。方法对照组应用未加药的完全培养基培养,实验组分别采用10、50、100 nmol/L知母皂苷AⅢ处理,分别采用水溶性四氮唑(WST-1)法、流式细胞术双标法、分光光度法、流式细胞术单标法及蛋白免疫印迹(Western blot)法检测细胞存活率、凋亡率、半胱天冬酶-3(Caspase-3)活化水平、细胞周期分布及相关通路蛋白表达情况。结果知母皂苷AⅢ在10~100 nmol/L范围内可抑制HL-60细胞的增殖,且与对照组相比,实验组HL-60细胞的存活率均降低(P0.05);与对照组相比,实验组处理24、48 h后的凋亡率及Caspase-3活化率均升高,处理48 h后的G0/G1期细胞比例升高,S期细胞比例降低(P0.05);与对照组相比,100 nmol/L知母皂苷AⅢ处理后磷酸酶基因(PTEN)蛋白水平升高,而蛋白激酶B(Akt)、β-连环蛋白(β-catenin)、细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)和原癌基因(C-myc)水平均降低(P0.05)。结论知母皂苷AⅢ对人白血病细胞HL-60有细胞毒性作用,主要体现在抑制增殖、诱导凋亡和细胞周期阻滞方面,其机制可能与该药物抑制磷脂酰肌醇-3-羟激酶(PI3K)/Akt和Wnt/β-catenin通路有关。     

金复康口服液诱导肺癌细胞A549凋亡的机制

目的:研究金复康口服液(JFK)诱导人非小细胞肺癌细胞A549凋亡的作用机制。方法:取对数生长期的人非小细胞肺癌细胞A549,随机分为空白组和药物组,采用溴化四甲基偶氮(MTT)比色法,考察不同质量浓度JFK(0.3,1.5,3,7.5,15,30 g·L~(-1))对A549细胞体外增殖能力的影响。通过平板克隆形成实验考察JFK对A549细胞平板克隆形成的影响,利用流式细胞仪考察JFK对A549细胞凋亡的影响;蛋白免疫印迹法(Western blot)考察JFK对裂解DNA修复酶(cleaved PARP),活化型半胱天冬酶-3(actived Caspase-3),Wnt/β-联蛋白(β-catenin),细胞周期蛋白D1(cyclin D1)的蛋白表达及对促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路和蛋白激酶B(Akt)信号通路的影响,实验中设置空白组和药物组,药物组为A549细胞加入15,30 g·L~(-1)JFK,分别干预24 h,30 min。结果:JFK在1.5~30 g·L~(-1)呈质量浓度依赖性的抑制A549细胞外增殖(P0.01)。JFK抑制A549细胞的平板克隆形成在15~30 g·L~(-1),其中JFK 30 g·L~(-1)时抑制A549细胞的平板克隆最显著(P0.01)。与空白组比较,JFK 15~30 g·L~(-1)可提高AnnexinⅤ和PI双阳细胞率,诱导A549细胞凋亡(P0.05),且呈浓度依赖性提高cleaved PARP和actived Caspase-3的蛋白表达,并抑制β-catenin和cyclin D1在蛋白水平的表达(P0.05,P0.01)。JFK上调MAPK信号通路中JNK和p38的蛋白磷酸化水平(P0.05),同时下调Akt信号通路中Akt在T308和S473的位点磷酸化水平(P0.05)。结论:金复康口服液抑制人非小细胞肺癌细胞A549的体外增殖、平板克隆的形成并诱导其凋亡,部分通过调控JNK/p38/MAPK信号通路和Akt信号通路,抑制β-catenin和cyclin D1,同时提高凋亡相关蛋白cleaved PARP和actived Caspase-3的表达。     

祛风宣痹方对哮喘豚鼠p38 MAPK信号通路的影响

目的:探讨祛风宣痹方对支气管哮喘的作用机理。方法:用卵蛋白致敏豚鼠复制支气管哮喘动物模型,经祛风宣痹方治疗,运用免疫组化法及Western Blot法检测各组豚鼠肺组织匀浆中p38 MAPK磷酸化蛋白表达量;结果:两种检测方法均显示,p38 MAPK磷酸化蛋白水平在模型组中有明显的增加,地塞米松组、中药高剂量组和低剂量组p38 MAPK磷酸化蛋白水平低于模型组,且高剂量组蛋白水平低于低剂量组(P0.05);结论:祛风宣痹方有效治疗哮喘的作用与抑制哮喘豚鼠p38 MAPK信号通路的表达密切有关,且其抑制作用呈现剂量依赖性。     

三七皂苷R1对血管平滑肌细胞迁移及p38MAPK蛋白的影响

目的 观察三七皂苷R1对血管平滑肌细胞（VSMC）迁移及p38 MAPK蛋白的影响。方法 用AngⅡ诱导VSMC迁移建立细胞迁移模型，将迁移的VSMC随机分为对照组和三七皂苷R1低、中、高剂量组（5、10、20μmol/L）。用细胞划痕实验检测VSMC迁移面积，Western blotting法检测MMP2、MMP9、磷酸化p38 MAPK及p38 MAPK蛋白表达。结果 与对照组相比，三七皂苷R1中、高剂量组均能明显减少VSMC的细胞迁移面积及MMP2、MMP9迁移蛋白表达（P <0.05），且呈剂量依赖性；与对照组相比，三七皂苷R1中、高剂量组均能明显减少p38 MAPK蛋白磷酸化（P <0.05），且呈剂量依赖性。结论 三七皂苷R1抑制了AngⅡ诱导的VSMC迁移面积，同时下调MMP2和MMP9迁移蛋白，且呈剂量依赖性，其机制可能与降低p38 MAPK蛋白磷酸化有关。     

内脏脂肪素诱导血管内皮细胞损伤的MAPK信号通路及丹参酮ⅡA磺酸钠的干预作用

目的:研究内脏脂肪素(visfatin)参与血管内皮细胞损伤的机制及丹参酮ⅡA磺酸钠保护作用的机制。方法:培养人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC,1×105/mL),用visfatin(250μg·L-1)刺激HUVEC 4 h,以丹参酮ⅡA(30,60,120 mg·L-1))干预24 h,酶联免疫吸附法(ELISA)检测细胞上清液中高敏C反应蛋白(hs-CRP)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、金属基质蛋白-9(MMP-9)水平,用Western blotting方法观察丝裂原激活蛋白激酶(MAPKs)信号转导通路中p38丝裂原激活蛋白激酶(p38MAPK)、细胞外信号调节激酶(ERK)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)的活化情况。分别用p38 MAPK,ERK,JNK特异性抑制剂进行预处理细胞,再给予visfatin(250μg·L-1)刺激4 h,检测细胞上清液中hs-CRP,TNF-α,MMP-9水平。结果:与正常组比较,模型组细胞活力显著降低,细胞上清炎症因子hs-CRP,TNF-α,MMP-9显著增高,细胞内p38 MAPK,ERK,JNK磷酸化蛋白表达显著增高。与模型组比较,丹参酮ⅡA呈剂量依赖性地降低visfatin导致的hs-CRP,TNF-α,MMP-9高表达,并能抑制p38MAPK,ERK1/2磷酸化活化,但对JNK无显著抑制作用。用p38 MAPK,JNK,ERK1/2特异性抑制剂预刺激,可阻止visfatin诱导的hs-CRP,TNF-α,MMP-9细胞因子大量表达。结论:visfatin可能通过激活MAPK磷酸化信号通路,诱导炎症细胞因子高表达,促使血管内皮细胞炎症反应,丹参酮ⅡA通过抑制MAPK信号通路p38,JNK的激活,抑制visfatin诱导的炎症因子高表达,从而减少血管内皮细胞损伤。     

氧化苦参碱对TGF-β1诱导心肌细胞损伤的保护作用

目的:探讨氧化苦参碱(OMT)对转化生长因子-β_1(TGF-β_1)诱导的新生SD乳鼠心肌细胞损伤的保护作用及机制。方法:胰酶消化差速贴壁法分离纯化SD乳鼠原代心肌细胞。实验分为4组,包括正常组,模型组[转化生长因子-β_1(TGF-β_1),20×10-5g·L~(-1)],OMT高剂量组(TGF-β_1+0.1 g·L~(-1)OMT),OMT低剂量组(TGF-β_1+0.05 g·L~(-1)OMT)。OMT预保护2 h后,采用TGF-β_1孵育48 h建立心肌细胞损伤模型。利用噻唑蓝(MTT)法检测细胞存活率,生化法检测乳酸脱氢酶(LDH)外漏量,蛋白质免疫印迹法(Western blot)检测p38,细胞外信号调节蛋白激酶(ERK),c-Jun氨基末端激酶(JNK)蛋白的表达水平。结果:TGF-β_1显著引起心肌细胞损伤,OMT(0.1,0.05 g·L~(-1))能够抑制TGF-β_1诱导的心肌细胞存活率下降及LDH外漏量增加。OMT高剂量组(0.1 g·L~(-1))可下调TGF-β_1诱导的心肌细胞p-p38,p-ERK1/2,p-JNK的蛋白表达,但对p38,JNK,ERK1/2总蛋白表达无影响。结论:OMT对TGF-β_1诱导的心肌细胞损伤具有保护作用,其机制与其抑制p38,ERK1/2,JNK蛋白的磷酸化有关。