微波辅助萃取蛇足石杉总生物碱的工艺研究

蛇足石杉为厥类植物,属石松类石杉科(Huperziacease)石杉属(Huperzia),又名千层塔、蛇足草。蛇足石杉具有散瘀消肿、解毒、止痛功能,用于治疗瘀血肿痛、内伤吐血等。从蛇足石杉中提取分离得到的石杉碱甲(Hup A),是一种强效的可逆性胆碱酯酶抑制剂,在临床上主要用于治疗重症肌无     

不同种质资源蛇足石杉引种及差异蛋白比较分析

目的 筛选野生蛇足石杉引种驯化的优质种质资源,并建立其分子鉴别方法。方法 对来自福建大田、三明市郊、南靖3个不同种质资源野生蛇足石杉引种驯化,HPLC法分析不同种质资源蛇足石杉中石杉碱甲（Hup A）量;采用蛋白质双向电泳技术,分析不同种质资源蛇足石杉差异蛋白。结果 种质资源来自大田的蛇足石杉适应性较强,植株长势好,成活率为65.5%,且茎叶Hup A量也较高,分别为197.80和87.54 μg/g;遮阳成活率为77.8%,远高于未遮阳的成活率（7.1%）;黄土地成活率为75%,远高于水田沙壤土的成活率（18.8%）。不同种质资源蛇足石杉共有15个差异蛋白质点,不同种质资源蛇足石杉的差异蛋白质点丰度差异较大。结论 人工引种栽培时,土壤选择以黄土质为佳,并需要给予必要的遮阳;种质资源来自福建大田的蛇足石杉可以作为蛇足石杉优质种质资源进行引种驯化;利用蛇足石杉差异蛋白质点的丰度差异,可以作为鉴别不同蛇足石杉种质资源的依据。     

TMT蛋白质组学与生物信息学分析不同石杉碱甲含量的蛇足石杉叶状体的蛋白差异

目的分析不同石杉碱甲(Hup A)含量蛇足石杉叶状体(离体培养物,分别为株系A、B、C)的蛋白差异,探究可能与Hup A积累合成的相关酶。方法利用定量蛋白质组学串联质谱标签(tandem mass tag,TMT)技术对不同株系蛇足石杉叶状体进行定量蛋白质组学检测和鉴定,再对差异蛋白进行GO和KEGG等生物信息学分析。结果株系B的Hup A含量最低,株系C的Hup A含量最高,是B的2倍,株系B和C两者有78个差异蛋白,且差异蛋白GO富集分析,分子功能(MF)所占比例为28.75%;通过不同株系间蛋白质差异表达的比对,分析得到这3个株系在以氨基酸为起始的生物碱代谢通路中共有2种差异蛋白(P93541、Q8RXU4)。P93541蛋白在Hup A低含量的株系B中表达下调,在相对高含量的株系A和C中均上调;而Q8RXU4蛋白在低含量的株系B中表达上调,在相对高含量的株系A和C中均表达下调。结论 Hup A含量差异与蛋白表达差异呈正相关,分析得到2种可能与Hup A积累相关的酶P93541、Q8RXU4,为Hup A生物合成生物信息学分析提供了依据。     

不同产地皱边石杉中石杉碱甲的含量研究

目的 :采用HPLC测定湖南不同产地皱边石杉中的石杉碱甲含量。方法 :采用NovapakC18柱 ( 5 μm ,15 0mm×4 .6mm) ,流动相 :甲醇∶水 ( 4 0∶6 0 ) ,流速 :1mL·min-1,检测波长 :315nm。结果 :石杉碱甲在 4 .2～ 2 1μg·mL-1范围内与峰面积呈良好的线性关系 ,桑植产皱边石杉中石杉碱甲含量最高。结论 :皱边石杉中石杉碱甲的含量随着外界环境的改变而改变 ,所建立的HPLC方法快捷、灵敏、准确。     

蛇足石杉中石杉碱甲含量的动态变化分析

目的:为揭示蛇足石杉Huperzia serrata居群间和居群内石杉碱甲(HupA)含量的变异程度和变异规律,以及引种前后的变化情况。方法:以采自浙江、广西和重庆的3个蛇足石杉居群,共73株活体植物为研究对象,用改进的HPLC测定了每株引种前后的HupA含量,采用变异系数、单因素方差分析和配对t检验等统计方法,分析了居群间和居群内HupA含量的多样性特征,以及引种前后的含量变化规律。结果:蛇足石杉中石杉碱甲含量在居群间和居群内存在极其丰富的多样性,居群间的含量差异达显著或极显著水平,居群内含量的变异系数从东到西分别为0.36,0.43,0.40;同园引种1年后,东部的浙江居群与西部的广西和重庆居群间的含量差异仍保持极显著的水平,而西部的广西和重庆居群间含量的显著性差异则消失,同时,各居群个体的石杉碱甲含量在引种前后均未发生明显的变化。结论:蛇足石杉中石杉碱甲含量的高低是遗传因素与环境条件共同作用的结果,但更受遗传因素控制。     

不同条件对蛇足石杉组培苗生长及石杉碱甲积累的影响

目的:考察不同条件对蛇足石杉组培苗生长和石杉碱甲积累的影响。方法:通过添加不同浓度的组合激素、无机氮源、前体物、诱导子,考察其对蛇足石杉干重增长率和石杉碱甲含量的影响。结果:不同条件对蛇足石杉组培苗生长和石杉碱甲积累的影响不同,适当的组合激素和无机氮源利于蛇足石杉组培苗的生长,前体物和适当的诱导子利于石杉碱甲的积累。其中0.50 mg·L~(-1)6-BA+0.05 mg·L~(-1)IBA的激素组合对蛇足石杉组培苗的生长促进效果最显著,其干重增长率在培养12周时约是对照组的1.32倍,而0.5 mmol·L~(-1)的赖氨酸对石杉碱甲积累的调控效果最好,与对照相比,在培养12周时,石杉碱甲含量提高了71.46%。结论:本研究初步实现了对蛇足石杉组培苗生长和石杉碱甲积累的调控,为通过千层塔的组织快繁缓解石杉碱甲的资源短缺提供了理论基础。     

蛇足石杉生物碱成分的研究(Ⅳ)

从石杉科植物蛇足石杉中分离出二个生物碱,经光谱鉴定分别为６－β－羟基石杉碱甲和马尾杉碱Ｎ。这两个化合物均首次从该植物中得到。生物实验初步结果表明,６－β－羟基石杉碱甲为又一个强效胆碱酯酶抑制剂,其毒性低于石杉碱甲,而对电鳐ＡＣｈＥ的抑制作用比石杉碱甲强约４倍。     

蛇足石杉中生物碱含量测定方法的研究

目的建立蛇足石杉总生物碱含量的测定方法。方法采用紫外分光光度法,以石杉碱甲为对照,在246 nm波长下建立标准曲线进行蛇足石杉中生物碱含量测定。结果实验表明吸光度和含量间具有良好的线性关系(r=0.999 49),且精密度良好(RSD=1.14%);样品在1 h内测定稳定(RSD=0.947%)。结论紫外分光光度法是一种简便、快速测定蛇足石杉中生物碱含量的方法,该测定方法可作为蛇足石杉的质量控制。     

超声波提取蛇足石杉内生真菌2F09P03B中石杉碱甲的研究

 目的确定一株蛇足石杉内生真菌2F09P03B发酵培养物中石杉碱甲的超声波辅助提取工艺,以改善石杉碱甲提取率。方法对提取溶剂、pH值等影响提取效率的因素分别进行单因素实验;对料液比、超声波功率、负载率(dutycycle)、超声时间4个影响超声波提取效率的因素在单因素实验基础上利用正交实验进行优化。结果超声波辅助提取石杉碱甲的最佳工艺条件是:提取溶剂为pH4.0的酸水,碱性还原反应在pH7.5～8.0进行,料液比1:20,超声波功率140W,超声波负载率30%,超声时间40min。此条件下,该内生真菌石杉碱甲的提取率达0.074%,约为其他传统提取方法的1.5～2倍。结论超声波辅助提取法的石杉碱甲提取率较其他方法有了显著提高,并能大幅度缩短提取时间,应在蛇足石杉内生真菌2F09P03B石杉碱甲的提取中加以应用。     

微生物对蛇足石杉扦插生根及若干生理生化指标的影响

目的:研究原生境土壤微生物、内生真菌和根表真菌对蛇足石杉扦插生根率和若干生理生化指标的影响。方法:蛇足石杉分别在原生境土壤(土壤Ⅰ)、接种了内生真菌和根表真菌的灭菌土壤(土壤Ⅱ)、灭菌土壤(土壤Ⅲ)上进行扦插,调查蛇足石杉扦插生根率,测定可溶性蛋白含量,可溶性糖含量,PPO(多酚氧化酶),POD(过氧化物酶)活性、黄酮类化合物和石杉碱甲含量。结果:与土壤Ⅲ上的扦插蛇足石杉相比,土壤Ⅰ和土壤Ⅱ上植株生根率,分别提高了10%和16%,土壤Ⅱ上扦插植株茎中的可溶性蛋白含量显著提高(P<0.05),土壤Ⅰ上扦插植株叶片和茎中的可溶性糖含量显著提高(P<0.05),土壤Ⅰ和土壤Ⅱ上的扦插植株的黄酮类化合物含量显著提高。结论:原生境土壤微生物、内生真菌和根表真菌对扦插蛇足石杉的生根有促进作用,提高蛇足石杉体内的代谢水平。     

皱边石杉内生真菌资源遗传多样性的ISSR分析

目的 采用ISSR标记技术从分子水平探讨皱边石杉内生真菌资源的遗传多样性,建立皱边石杉内生真菌资源遗传分化指纹图谱,为筛选可产石杉碱甲的目标菌株提供快捷的判别依据.方法 以从皱边石杉中分离的100株内生真菌为材料,建立其ISSR优化反应体系并分析其遗传多样性;TLC、HPLC检测发酵产物.结果 优化筛选的10条ISSR引物对皱边石杉内生真菌进行遗传多样性分析,共扩增出3 975条清晰条带,多态性条带占100％.遗传相似系数为0.59～0.96,在0.64水平,皱边石杉内生真菌可分为11类;在0.67水平,第Ⅰ类又可分为5个亚类.采用引物UBC868对13号菌株及皱边石杉基因组DNA扩增,在500、200 bp均具有清晰的扩增条带,发酵产物经TLC和HPLC检测,发现13号菌株与宿主植物皱边石杉同样可产生石杉碱甲.结论 皱边石杉内生真菌资源遗传多样性高,遗传距离较远,遗传基础较宽,与13号菌株同属一类的内生真菌可作为石杉碱甲生产的潜力菌株进行重点筛选和诱变.     

补肾益智方对老年性痴呆模型鼠NOS1表达的影响

探讨天然促智药复方－补肾益智方对基底前脑神经元型一氧化氮合酶（ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ、,ＮＯＳ１）表达的影响。方法：用鹅膏蕈酸（Ｉｂｏｔｅｎｉｃ ａｃｉｄ,ＩＢＯ）损毁老年大鼠双侧基底核作为老年性痴呆（Ａｌｘｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ,ＡＤ）模型,治疗组行补肾益智方灌胃,用药对照组用石杉碱甲（Ｈｕｐ Ａ）灌胃,下沉对照组为青年组和老年下沉组。各组Ｍｏｒｒｉｓ水迷宫检测一取     

补肾益智方对老年性痴呆模型鼠NOS1表达的影响

探讨天然促智药复方——补肾益智方对基底前脑神经元型一氧化氮合酶（ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅｓｙｎｔｈａｓｅ１, ＮＯＳ１）表达的影响。方法：用鹅膏蕈酸（Ｉｂｏｔｅｎｉｃ ａｃｉｄ,ＩＢＯ）损毁老年大鼠双侧基底核作为老年性痴呆（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ, ＡＤ）模型,治疗组行补肾益智方灌胃,用药对照组用石杉碱甲（Ｈｕｐ Ａ）灌胃,正常对照组为青年组和老年正常组。各组Ｍｏｒｒｉｓ水迷宫检测,之后取各组受试大鼠脑组织冠状切片进行ＮＯＳ１免疫细胞化学染色。结果：逃避潜伏期中药组大鼠较模型组、Ｈｕｐ、 Ａ组明显缩短。 ＮＯＳ１阳性细胞数中药组较模型组、Ｈｕｐ　 Ａ组明显增加,明显低于青年组和老年正常组。灰度值中药组较青年组、老年正常组明显降低,斜角带水平支（ ｈｏｒｉｚｏｎａｌ ｄｉａｇｏｎａｌ ｂａｎｄ ｏｆ Ｂｒｏｃａ, ｈＤＢ）较模型组有明显增加。胞体面积中药组较模型组、Ｈｕｐ Ａ组显著增加。结论：补肾益智方可增加基底前脑 ＮＯＳ１表达。     

山茱萸总有机酸含量的变化及测定

目的　本文分析了山茱萸的总有机酸含量。方法　以容量法 (滴定法 )对不同产地及不同品种、同一品种不同生长时期、不同温度干燥的山茱萸总有机酸进行测定。结果　发现 13个样品 (9个品种 )山茱萸总有机酸的含量为 9.6 5 %～13.2 6 % ,不同品种的干品和鲜品有机酸含量不同 ,10月中旬总有机酸的含量最高 ,70℃干燥后总有机酸的含量最高。结论　产地不同、形态学各异的山茱萸总有机酸含量不同 ,同一品种不同生长时期、不同温度干燥 ,其含量也不同。此可作为确定山茱萸品种和优种选育、制订最佳加工方法的依据。     

不同产地与采收季节虎耳草中原儿茶酸的含量测定

目的　测定不同产地与采收季节虎耳草中的原儿茶酸含量。方法　高效液相色谱法 ,WatersNova- Pa K C1 8柱 ,流动相为甲醇 - 0 .0 5 mol· L- 1磷酸 -水 ( 85∶ 9∶ 6 ) ,紫外检测波长 2 5 8nm,流速 0 .8m L·m in- 1 。结果　原儿茶酸在 0 .0 82 6～ 0 .4 13μg范围内线性关系良好 ,平均回收率为 98.5 %。结论　安徽产虎耳草中原儿茶酸含量最高 ,安徽以 5月份采收的虎耳草含量最高。     

不同产地猫爪草中多糖含量的比较

目的 比较不同产地猫爪草中多糖的含量。方法 采用苯酚-硫酸法。结果 河南信阳、河南驻马店、安徽、浙江、江苏、湖北、山东等地猫爪草中多糖含量分别为:12.65%、12.05%、10.46%、9.78%、8.49 %、8.73%、9.47%。结论 不同产地猫爪草中多糖的含量差异明显,其中以河南产猫爪草中多糖含量最高。     

益智中2种倍半萜类成分的含量研究

目的:建立益智中oxyphyllenodiol A(1)和teuhetenone A(2)的HPLC含量测定方法,同时对市售药材、饮片及药材不同部位中2种成分的含量进行比较研究.方法:采用高效液相色谱法,使用Waters sunfire C18色谱柱(4.6 mm ×250 mm,5μm),以乙腈-水为流动相进行梯度洗脱,流速为1.0 mL·min-1,检测波长250 nm.结果:1和2分别在0.1296 ～0.8640μg和0.163 5 ～ 1.0900 μg线性关系良好,平均回收率分别为99.08％和97.80％,在所测的不同样品中质量分数分别为0.005 9％～0.0149％和0.0080％ ～0.0164％.1和2在益智全果中的质量分数均值分别为0.008 5％和0.0104％;在益智种子中的质量分数均值分别为0.0137％和0.0157％;果壳中未检测到2种成分.结论:该方法精密、准确、重现性好,可用于测定益智药材中oxyphyllenodiol A和teuhetenone A的含量;益智全果中2种成分含量主要源于益智的种子,且在不同样品间有一定差异;盐炙益智种子和生益智种子中2种成分含量较高且无明显差异.     

杠板归药材中重金属的含量测定及其质量评价

目的:对不同产地的杠板归药材中铅、镉、汞、砷、铜等重金属元素的含量进行测定,并据此评价其质量。方法:样品经湿法消解后,用原子荧光光度法和原子吸收分光光度法进行检测;采用聚类分析、主成分分析等数理统计方法对测定结果进行分析处理。结果:杠板归药材中镉、汞元素含量超标,超标率分别为镉73.33%、汞6.67%。结论:不同产地的杠板归药材中铅、砷、铜的含量符合相关标准,而有些产地的镉和汞的含量均有超标现象。     

全国20个主要产地茯苓质量分析比较研究

目的建立茯苓多糖和茯苓酸的含量测定方法,分析比较全国20个主要产地茯苓中茯苓多糖和茯苓酸的含量,为评价不同产地茯苓的质量品质提供依据。方法采用分光光度法测定茯苓多糖的含量,碱提,苯酚-浓硫酸显色,葡萄糖为对照品,检测波长490nm。采用RP-HPLC法测定茯苓酸的含量,Kromasil100-5C18色谱柱,柱温30℃,流动相为乙腈-0.2%甲酸(80:20),流速1.0mL/min,检测波长242nm。结果葡萄糖在40～200μg/mL范围内线性良好,r=0.9999,平均回收率为99.72%,RSD=0.99%;茯苓酸在0.48～2.40μg范围内与其色谱峰面积呈良好线性关系,r=0.9997,平均回收率100.26%,RSD=1.26%。不同产地茯苓药材中茯苓多糖和茯苓酸的含量有较大差异,说明药材质量并不一致。结论该方法简便快速、准确可靠,为评价不同产地茯苓药材的质量提供了一种可靠的分析方法。