基于高通量测序技术对牛蒡子药材与伪品药材混合粉末鉴定研究

牛蒡子是我国传统中药,主要伪品为毛头牛蒡、水飞蓟、云木香、大翅蓟、紫穗槐等果实。传统鉴定方法或分子条形码技术可以对牛蒡子和其伪品进行鉴定,但是对牛蒡子与其伪品混合粉末的鉴定较困难。该文利用高通量测序技术对牛蒡子以及其5种伪品混合粉末ITS2序列进行测序,对混合粉末物种进行鉴定,为牛蒡子药材混合粉末的鉴定提供新思路。对药材混合粉末中的总DNA进行提取,并对总DNA中ITS2片段进行扩增,利用Illumina MiSeq平台对群落DNA片段进行双端(paired-end)测序,利用FLASH,QIIME以及GraPhlAn等软件对序列进行整理分析。结果显示:混合样品中共得到高质量的ITS2序列39 910条,其中,样品中的物种ITS2序列共34 935。进一步的进化分析表明样品中含牛蒡子、毛头牛蒡、水飞蓟、大翅蓟、云木香和紫穗槐。利用高通量测序技术,以ITS2序列作为DNA条形码,可以检测出混合粉末中含有牛蒡子及其伪品,为牛蒡子药材质量控制、安全用药以及中药混合粉末的鉴定提供参考。     

RAPD法结合TLC鉴别中药牛蒡子及其混淆品

对中药牛蒡子 Arctium lappa L.及其5种常见混淆品——毛头牛蒡 Arctium tomentosum Mill.、大翅蓟Onopordum acanthium L.、水飞蓟 Silybum marianum Gaertn.、云木香 Aucklandia lappa Decne.和紫穗槐Amorpha fruticosa L.的果实进行了TLC法和 RAPD法鉴别。以TLC法鉴别出其中的大翅蓟、水飞蓟和紫穗槐,余者以 RAPD法作出鉴别,并对PCR技术和TLC法在中药鉴定中的应用进行了初步探讨。     

不同产地牛蒡rDNA ITS的PCR扩增、克隆及序列分析

目的:对中国11个不同产地的牛蒡进行ITS序列分析,为牛蒡DNA分子鉴定提供参考。方法:从11个不同产地的牛蒡中提取总DNA,用通用引物对ITS序列进行扩增,对扩增产物克隆测序。结果:牛蒡完整的ITS序列长度范围为641 bp,不同产地间无长度差异,GC含量为59.1%~59.6%之间,其中ITS1序列为256 bp,GC含量为58.6%~59.4%之间,其中ITS2序列为221 bp,GC含量为63.8%~64.7%之间。结论:11个不同产地的牛蒡ITS序列遗传距离为0.0000~0.0094,平均遗传距离为0.0024,相似度在99%以上,可以作为DNA分子鉴定的依据。     

黄芪与其混伪品的ITS序列分子鉴定研究

目的:研究黄芪与其混伪品之间的DNA分子鉴别方法.方法:采集不同产地的黄芪药材13份,替代品红芪2份,混伪品紫花苜蓿3份和蜀葵1份,所有样品进行总DNA的提取,PCR扩增,并对扩增产物进行测序得到相应的序列,同时从GenBank下载蓝花棘豆、锦鸡儿2种伪品的ITS序列.用MEGA 4计算其种间的K-2-P距离,最后利用ITS序列构建其系统发育树.结果:测得了19份样品的ITS序列全长,分别为蒙古黄芪646 ～ 650 bp,膜荚黄芪为646～650 bp;红芪为664 bp；紫花苜蓿为659 bp;蜀葵为728 bp,在GenBank中注册,获得登记号.通过以ITS序列重建系统进化树进行的聚类分析可以将黄芪与其混伪品有效的区分开.结论:ITS序列能够成功鉴定黄芪及其易混伪品,可以作为黄芪与其混伪品的分子鉴定方法.     

RAPD法结合TLC鉴别中药牛蒡子及其混淆品

对中药牛蒡子Ａｒｃｔｉｕｍ ｌａｐｐａ Ｌ．及其５种常见混淆品－毛头牛蒡Ａｒｃｔｉｕｍ ｔｏｍｅｎｔｏｓｕｍ Ｍｉｌｌ、大翅蓟Ｏｎｏｐｏｒｄｕｍ ａｃａｎｔｉｕｍ Ｌ．、水飞蓟Ｓｉｌｙｂｕｍ ｍａｒｉａｎｕｍ Ｇａｒｅｔｎ．云木香Ａｕｃｋｌａｎｄｉａ ｌａｐｐａＤｅｃｎｅ。和紫穗槐Ａｍｏｒ－ｐｈａ ｆｒｕｔｉｃｏｓａＬ．的果实进行了ＴＬＣ法和ＲＡＰＤ法鉴别,以ＴＬＣ法鉴别出其中的大翅蓟、水飞蓟和紫     

沙苑子与其混伪品的ITS序列分子鉴别研究

目的：研究沙苑子与其混伪品之间的 DNA 分子鉴别方法。方法：采集不同产地的沙苑子药材10份,基原植物2份,达乌里黄芪3份,蒙古黄芪4份,直立黄芪3份,混伪品猪屎豆和凹叶野百合各1份,所有样品进行总 DNA 的提取,PCR 扩增,并对扩增产物进行测序得到相应的序列,用 MEGA 计算其种间的 K-2-P 距离,最后利用 ITS 序列构建其系统发育树。结果：测得了24份样品的 ITS 序列全长,分别为沙苑子644～688 bp,蒙古黄芪为646～673 bp;直立黄芪685～687 bp;达乌里黄芪为676～688 bp;猪屎豆为785 bp;凹叶野百合为837 bp。通过以ITS 序列重建系统进化树进行的聚类分析可以将沙苑子与其混伪品有效的区分开。用 MEGA 软件基于 ITS 序列构建的沙苑子与其混伪品间的遗传距离分析得到了沙苑子与达乌里黄芪的种间 K-2-P 距离0.0802;蒙古黄芪为0.0812,与直立黄芪之间的遗传距离为0.0824,凹叶野百合和猪屎豆与沙苑子的遗传距离稍大,达到0.2362和0.2299。用 MEGA 软件测定沙苑子种内遗传距离为0.0010。此外,对通过测定种间的遗传距离发现,蒙古黄芪与直立黄芪种间的遗传距离最小为0.0009,与猪屎豆种间的遗传距离最大为0.2362。结论：ITS 序列能够成功鉴定沙苑子及其混伪品,可以作为沙苑子与其混伪品的分子鉴别方法。     

基于DNA条形码-产地-形态联用的药材溯源新方法研究——以黑果枸杞1种伪品为例

利用NCBI核酸数据库中ITS (internal transcribed spacer) 序列, 结合产地分析和形态分析对新发现的一种黑果枸杞混伪品进行溯源研究。通过提取样品DNA, PCR扩增及双向测序, 获得样品的ITS序列。所得序列用ContingExpress软件进行拼接, 截取ITS序列全长;利用 NCBI核酸数据库中已登录的ITS序列进行相似度分析对其进行DNA条码溯源;根据其产地分析DNA条形码溯源结果;再根据形态特征进一步验证结果, 3种方法联用获得溯源结果。新发现的黑果枸杞混伪品来源于小檗科小檗属植物喀什小檗Berberis kaschgarica。与黑果枸杞的主要区别:喀什小檗果实表面平滑, 质地轻脆, 黑果枸杞表面皱缩, 质地坚实而硬;喀什小檗外果皮细胞壁连珠状增厚, 石细胞壁平直, 层纹不明显, 黑果枸杞外果皮细胞壁不增厚, 石细胞壁波浪状, 层纹明显;喀什小檗的ITS序列长度为606 bp, 黑果枸杞的长度为654 bp, 二者序列对齐后的相似度为53.32%。     

维吾尔药材新疆圆柏DNA 条形码鉴定研究

目的：本研究采用形态学与DNA 条形码技术,建立维吾尔药材新疆圆柏Juniperus sabina L.及其混伪品的鉴别方法。方法：随机选择不同产地新疆圆柏及其混伪品的叶片和果实,比较外观差异;采用ITS2 序列对新疆圆柏及其混伪品10 份样品进行PCR 扩增并测序,结合GenBank 获得4 条侧柏ITS2序列,比较14 份样品ITS2 序列种内和种间变异,采用K2P 模型构建NJ 系统树。结果：4 种植物叶片和果实外观相态均有相似之处;DNA 条形码ITS2 序列鉴定结果显示,14 份研究样品ITS2 序列长度均为219 bp,种间最大K2P 距离为0.089。结论：ITS2 序列及NJ 树可将新疆圆柏与3 种混伪品植物区分,为维吾尔药材新疆圆柏的标准化奠定基础。     

阳春砂的ITS序列分析

目的：用ITS全序列鉴别各地产阳春砂及常见伪品。方法：从各地产阳春砂及常见伪品绿壳砂和海南砂中提取总DNA，以核基因组通用引物ITS为引物进行扩增，扩增产物经纯化后，用PCR产物直接法进行测序。结果：各样品的ITS序列总长度均为626bp，其中ITS－1序列长度为248bp,5.8S序列长度为155bp，ITS－2序列长度为223bp；6个阳春砂和绿壳砂的ITS－2序列完全一致，各样品的5．8S序列完全一致，在ITS-1可各样品却有不同的碱基位点。结论：ITS－1序列可对阳春砂的道地性作出鉴别，明显区分其伪品。     

种子类药材补骨脂及其混伪品的ITS2条形码序列鉴定

目的:种子类药材补骨脂具有肝肾毒性,其混伪品曼陀罗子、天仙子、洋金花的种子、猪屎豆也含有毒性成分,且补骨脂与其混伪品外形相似,易导致混用误用,严重危害人体健康。本研究利用DNA条形码技术,分析补骨脂及其混伪品的ITS2序列,以期快速准确鉴定补骨脂及其混伪品,保证其用药安全及临床疗效。方法:对补骨脂及其混伪品样品进行DNA提取、PCR扩增ITS2序列,并进行双向测序,所有序列用MEGA6.0软件进行种间、种内Kimura2-parameter(K2P)遗传距离计算,并构建NJ系统聚类树。结果:补骨脂ITS2序列长度为233bp,G+C含量为69.5%,种内无变异位点。补骨脂与其混伪品种间变异位点较多,种间K2P最小距离为0.5321,远远大于其种内距离,NJ树显示可以将补骨脂及其混伪品完全分开。结论:ITS2条形码序列可准确鉴别种子类药材补骨脂及其混伪品,为保证补骨脂的临床用药安全和种质资源鉴定提供了良好的技术手段。     

牛蒡ITS 序列与药材质量的相关性研究

目的 研究牛蒡ITS序列与牛蒡子药材质量相关性.方法 采集全国26个不同产地的牛蒡子药材,采用PCR扩增后测定ITS序列,HPLC法对牛蒡子药材中牛蒡苷含量进行测定,应用ClustaiX( 1.81),Mage 4.0,SPSS 13.0等统计软件进行遗传多样性、基因分型、相关性等分析.结果 测得了26份牛蒡的ITS序列全长,在GenBank中注册,获得登记号,测定牛蒡子药材中牛蒡苷含量、千粒重,统计分析牛蒡的基因分型与药材质量具有相关性.结论 为揭示牛蒡子道地药材的分子形成机制奠定了基础.     

基于ITS2和psbA-trnH序列对细小种子类药材车前子的鉴定比较

为考察ITS2 序列和psbA-trnH 序列对车前子药材及其常见混伪品的鉴定能力,该研究对车前子2个基原物种及7种混伪品共71份样本进行了研究。采用MEGA 5.1对获得的ITS2和psbA-trnH进行序列比对,计算种内和种间kimura 2-parameter（K2P）遗传距离,并构建系统发育树。结果显示,车前和平车前的ITS2 序列长度分别为199,200 bp;两者的ITS2序列种内最大 K2P 遗传距离均小于与混伪品的最小种间K2P 遗传距离;基于ITS2 序列构建的NJ 树中,车前、平车前及其混伪品都表现出良好单系性,都能相互明显区分。表明ITS2序列能将车前子药材与混伪品进行很好的区分。车前和平车前的psbA-trnH序列长度均为340 bp,两者的psbA-trnH 序列种内最大K2P 遗传距离小于与混伪品的最小种间K2P 遗传距离;基于psbA-trnH 序列构建的NJ 树结果显示,除大车前外,车前子药材与其余混伪品可以明显区分。因此,ITS2序列作为DNA条形码,车前子及其混伪品具有良好的鉴别能力,对保障车前子用药安全具有重要意义。     

山茱萸药材及其混伪品的ITS／ITS2序列鉴定研究

利用DNA条形码技术准确快速鉴定山茱萸药材及其混伪品。方法：提取山莱萸及其混伪品的基因组DNA,利用PCR技术扩增它们的ITS序列。所得序列经双向测序后用CodonCode AlignerV3．5．4软件进行拼接和质量评估,用MEGAV5．0计算种内、种间的遗传距离,构建NJ（邻接）树鉴定山茱萸药材及其混伪品。结果：山茱萸药材的ITS序列长度均为659bp,种内变异较小,平均K2P遗传距离为O．005,远小于其与混伪品的种间平均K2P遗传距离0．357。不同来源的山茱萸药材ITS2序列无变异,长度均为250bp,其与混伪品的种间平均K2P遗传距离为0．571。ITS／ITS2序列的NJ系统聚类树和BLAST比对结果均可明显区分山茱萸药材及其混伪品,表现出良好的单系性。结论：ITS／ITS2序列可准确有效鉴定山茱萸药材,为临床安全用药奠定了基础,也为其它药材的分子鉴定提供了新的思路。     

五味子与南五味子药材的DNA条形码鉴定

目的:利用内转录间隔区2(ITS2)序列对五味子及南五味子药材进行DNA条形码鉴定。方法:对五味子和南五味子样品的ITS2序列进行聚合酶链式反应(PCR)扩增和测序。从Gen Bank中下载了五味子属10个近缘种和2个外类群的ITS2序列。利用Codon Code Aligner软件拼接,采用MEGA 5.10计算相关数据,基于K2P模型构建聚类树(NJ树),应用Blast法进行鉴定分析。获取所测样品序列的ITS2二级结构信息,分析各样品间ITS2序列二级结构的差异。结果:五味子、南五味子样品序列长度分别为231,225~227 bp,Blast鉴定五味子药材原植物为五味子Schisandra chinensis,南五味子药材原植物为华中五味子S.sphenanthera。五味子与南五味子药材的种间K2P遗传距离(0.010 4~0.015 7)远大于五味子种内K2P遗传距离(0~0.002 5)和南五味子种内K2P遗传距离(0~0.005 1)。在NJ树模型中,五味子样品被独聚为1支,南五味子样品被独聚为1支,皆表现出单系性,Bootstrap支持率较高,可与五味子属近缘种区分开。结论:以ITS2序列为标准的DNA条形码能够有效地鉴定五味子和南五味子药材。     

凉茶药材鸡蛋花及其混伪品的DNA条形码鉴定

该研究应用ITS2序列作为DNA条形码鉴定凉茶药材鸡蛋花及其混伪品,共收集48份药材和基原植物样本,提取基因组DNA,通过PCR扩增ITS2序列并进行双向测序,经CodonCode Aligner拼接注释获得序列,然后应用MEGA5.0比对ITS2序列,计算种内和种间遗传距离,构建系统进化NJ树进行鉴定。结果表明,鸡蛋花ITS2序列长度为244 bp,种内遗传距离为0~0.016 6,远小于其与混伪物种间的遗传距离0.320 8~0.650 4,NJ树结果显示鸡蛋花与其混伪品均可准确区分。因此,应用ITS2条形码能够准确、有效地鉴别凉茶药材鸡蛋花及其混伪品,为鸡蛋花药材的鉴定提供了一种新的分子手段,为其使用安全提供了有力保障。     

蔓荆子药材及其混伪品DNA条形码鉴定研究

本研究应用ITS2序列鉴别蔓荆子及其混伪品,收集药材和基原植物样本共46份,通过提取基因组DNA、PCR扩增和双向测序获得ITS2序列,经CodonCode Aligner V4.2拼接注释获得序列,应用MEGA5.0对序列进行分析比对,计算种内和种间遗传距离（Kimura 2-Parameter,K2P）,构建系统发育NJ树进行鉴定。结果表明,蔓荆子药材基于ITS2序列的种内最大K2P遗传距离均小于其与混伪品的种间最小K2P遗传距离,NJ树显示蔓荆子药材与其混伪品可明显分开,表现出良好的单系性。因此,应用ITS2序列能够准确地鉴定蔓荆子药材及其混伪品。     

苍耳子药材及其混伪品ITS2 序列鉴定研究

目的：应用ITS2 序列快速并准确地鉴定中药材苍耳子,为其药材质量、用药安全提供保障。方法：提取苍耳子药材及其混伪品的基因组DNA、扩增ITS2 序列并测序,采用软件CodonCode Aligner V 4. 2 对测序峰图进行校对拼接,并对峰图进行质量控制。应用MEGA 5.0 软件计算种内种间Kimura 2-parameter（K2P）遗传距离,构建邻接（NJ）系统聚类树。结果：苍耳子药材基原物种种内K2P 遗传距离为0,药材基原物种与其他混伪品的K2P 遗传距离分布于0.009~0.542;NJ 树结果显示苍耳子药材与其混伪品均可明显区分。结论：ITS2 序列适用于中药材苍耳子及其混伪品鉴别,进一步验证了DNA 条形码技术鉴定中药材的有效性。     

基于ITS2序列鉴别道地药材岷县当归及其混伪品

目的利用核糖体r RNA基因内转录间隔区(ITS2)序列,对甘肃道地药材岷县当归(岷归)及其混伪品和近缘属药材进行鉴定分析。方法对供试材料ITS2序列进行PCR并双向测序,所得序列经Codon Code Aligner校对拼接后,利用MEGA 6.0对序列进行分析比对,计算种内、种间遗传距离,利用邻接法(NJ)构建系统聚类树,并应用ITS2数据库网站预测其ITS2二级结构。结果经PCR扩增测序,15份甘肃栽培当归与标准样品岷归1号序列比对无差异,序列长度230 bp,GC含量为55.46%,37份当归混伪品与近缘属药材ITS2序列长度为228～233 bp,GC含量为51.53%～65.65%。岷归与混伪品、近缘属药材共53条序列中共检测到变异位点220个,保守位点10个,信息位点213个。根据K2P遗传距离计算,岷县当归种内遗传距离明显小于种间遗传距离,基于ITS2序列构建的NJ树和网站预测的ITS2二级结构,均能将岷归与其混伪品和近缘属药材区分。结论 ITS2序列可作为当归鉴定的DNA条形码,为当归市场的健康可持续发展提供有效的技术手段。     

基于ITS2 序列的女贞子原植物及其混伪品的分子鉴定

目的:通过分析女贞子原植物及其混用品和伪品的ITS2序列,探究鉴定女贞及其混伪品的新方法。方法:采用CodonCode Aligner进行序列拼接,MEGA4.1计算女贞及其混伪品的种内、种间的K2P距离,并基于K2P模型构建NJ树,最后应用Schultz等建立的ITS2数据库和网站预测二级结构。结果:女贞的最小种间K2P距离(3.2%)大于种内最大K2P距离(0.90%),NJ树中女贞的不同来源样品聚为一支。女贞与其混伪品的二级结构的分子形态均有差异。结论I:TS2序列可以作为鉴定女贞子原植物及其混伪品的条形码序列,并且该序列在中药材原植物的鉴定中具有很大的潜力。