中药生物效应指纹图谱构建新思路——与微流控芯片技术的结合

随着中药分析手段和信息技术的发展,基于中药化学成分的指纹图谱技术已成为中药质量控制的重要手段之一,但如何更好地快速分析化学指纹图谱,并将其与生物效应指纹图谱在线结合在一定程度上较全面地反映中药质量仍然是中药现代化研究的关键科学问题。本文简单介绍了LC-MS和LC-NMR技术解析化学指纹图谱、微流控芯片技术在生物效应检测中的应用,分析了将微流控芯片技术与化学成分的指纹图谱技术相结合的可能性,希望对我国中药质量研究起到推动和促进作用。     

基于微流控芯片技术研究水红花子复方抗肿瘤的作用

目的：基于微流控芯片技术研究水红花子复方含药血清对肝肿瘤SMMC-7721细胞的凋亡坏死影响及血管内皮生长因子（VEGF）分泌的影响。方法：设计与制作玻璃-PDMS复合浓度梯度芯片,并对芯片药物浓度梯度进行表征;将SMMC-7721细胞长期培养在芯片中,绘制细胞的生长曲线,AO／EB法检测细胞死活率;将预制备的含药血清通入微流控芯片,分别作用于SMMC-7721细胞24h和48h,凋亡坏死试剂盒检测凋亡坏死率;收集各通道的细胞上清液,ELISA法测定VEGF的蛋白含量。结果：细胞在芯片中培养7d,细胞增殖活性良好,培养72h期间细胞存活率≥97％。芯片可产生稳定的浓度梯度,线性相关系数为0．9964。芯片中含有药物血清的培养液分别作用SMMC-7721细胞24h和48h后,发生凋亡坏死细胞的数量随含药血清作用浓度升高而逐渐升高,细胞培养上清液中VEGF蛋白含量随含药血清作用浓度升高而逐渐减少,都呈现出一定的时间与浓度依赖性。结论：基于微流控芯片技术,进一步证明水红花子复方含药血清对肝肿瘤SMMC-7721细胞具有促凋亡作用,且能抑制其分泌VEGF从而间接抑制肿瘤血管新生达到抗肿瘤作用。     

微流控肝、肾芯片在中药毒理研究中的应用

微流控肝、肾芯片是近年来进行新药研发、药效毒理研究和机制探索、疾病模型构建的优选模型载体。在美国食品药品监督管理局允许当动物疾病模型难以构建时,用体外模型数据代替动物模型数据进行新药申报的大背景下,微流控芯片因为具有高通量、能高度仿生生命体特征、可方便进行重复给药的正常或病理状态下的药物毒性评价且允许对培养物培养过程进行实时诱导、监测过程数据实时采集分析等优点而得到广泛的关注。在毒理学研究中,肝、肾芯片可以通过结合不同物种来源的2D单培养和共培养、3D培养、球状体/类器官细胞、精密切割肝、肾切片、永生化细胞系或夹心培养细胞系等培养物,构建适合不同物质药效毒理学检测的体外模型。该模型最大化模拟或保留肝脏和肾脏的脏器功能和体内微环境,包括特定的生理组织结构、多细胞相互作用/串扰、多器官相互协作/反馈等,以得到与体内实验数据相近或相同的结果,减少了不同种属之间的差异;同时大大减少实验动物的使用,降低了成本。微流控技术提供的微流体不仅能为内容物培养提供必要的剪切力微环境,还能解决目前由于肝、肾芯片培养过程中组织供氧不足、营养物质的缺失、代谢物堆积,导致的细胞凋亡甚至组织坏死纤维化,难以长期维持...     

基于微流控芯片技术的天然产物活性成分筛选的研究

随着药物筛选技术的不断发展,新的筛选途径和技术不断涌现,使得药物筛选朝着快速、高效、高通量等方面不断发展。微流控分析技术具有的分析微型化、高通量化、可集成化和良好的生物相容性等特点,为天然产物活性成分的筛选提供了新的方法和技术平台,该文介绍了用于天然产物活性成分的多种筛选方法,重点综述了与细胞培养相结合的微流控芯片筛选技术及其特点,微流控芯片筛选技术平台的构成,以及其在天然产物活性成分筛选中的应用。     

荆芥不同药用部位及炒炭后挥发油的成分研究

对荆芥不同药用部位及炒炭后挥发油的含量进行了测定,对挥发油成分进行了检索。从全荆芥中检出26个组分,其中11种系荆芥挥发油中首次发现;从荆芥炭中检出27个组分,其中9种为全荆芥中首次发现。其余18种成分的含量也绝大部分发生改变。并对荆芥穗和荆芥梗挥发油中主要成分的含量进行了比较。     

应用微流控芯片技术探讨膀胱癌细胞Warburg效应及其分子机制

目的:探讨膀胱癌细胞Warburg效应的发生发展及其分子机制。方法:常规培养膀胱癌细胞系T24细胞,利用微流控芯片技术平台,体外模拟肿瘤细胞生长微环境,分光光度法测定细胞有氧糖酵解的代谢产物尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)的含量变化。结果:成功设计并制作了本研究所用微流控芯片。T24细胞内NADPH含量在一定时间范围内随着细胞培养时间的增加呈下降趋势,提示NADPH在T24细胞合成代谢中以还原形式被消耗,经磷酸戊糖代谢途径的生成来源一定程度上受到抑制。结论:T24细胞的代谢形式主要是以有氧糖酵解的形式进行,部分参与磷酸戊糖代谢通路。     

盐酸雷尼替丁胶囊中盐酸雷尼替丁的微流控芯片测定

目的建立微流控芯片测定盐酸雷尼替丁胶囊中盐酸雷尼替丁含量的方法。方法在高电场强度条件下利用微流控芯片上特殊的微通道实现组分快速、高效的分离,以非接触电导检测器进行检测;研究电泳介质、分离电压、进样时间等因素对分离检测的影响。结果优化选择2 mmol.L-1 HAc+2 mmol.L-1 NaAc(pH=4.5)+0.2 mmol.L-1 SDS为电泳介质,在分离电压为2.00 kV,进样时间为10 s时,1 min内可实现盐酸雷尼替丁快速分离检测;在优化条件下,盐酸雷尼替丁的线性范围为10～110μg.ml-1(r2=0.999 6),检出限为1.3μg.ml-1(S/N=3),RSD为1.6%,加标回收率为99.1%～101.2%。结论该方法简便、快速、灵敏,重复性较好,可用于盐酸雷尼替丁制剂的质量控制。     

微流控芯片测定盐酸小檗碱片中盐酸小檗碱

目的:建立微流控芯片非接触电导检测法测定盐酸小檗碱片中盐酸小檗碱含量的方法。方法:在高电场强度条件下利用微流控芯片上特殊的微通道实现组分快速、高效分离,以非接触电导检测器进行检测;考察缓冲溶液种类和浓度、添加剂种类和浓度、分离电压和进样时间等因素对组分分离的影响。结果:优化选择2 mmol/LHAc+1 mmol/L NaAc(pH 4.5)为缓冲溶液,8%乙醇为添加剂,分离电压为2.20 kV,进样时间为10 s,盐酸小檗碱在2 m in内可得到较好分离和检测。在优化条件下,盐酸小檗碱的线性范围为10~160μg/mL(r=0.9999),检出限为2.0μg/mL(S/N=3),RSD为1.2%,加样回收率为100.0%~100.3%。结论:该方法简便快速,重现性较好,适合盐酸小檗碱的快速检测和质量控制。     

基于UPLC指纹图谱结合多模式识别的荆芥穗炮制前后差异研究

目的 测定荆芥穗炮制前后的超高效液相色谱法（UPLC）指纹图谱,结合不同模式识别方法比较炮制前后差异,为荆芥穗和荆芥穗炭质量控制及评价提供参考。方法 采用UPLC对荆芥穗炮制前后样品进行测定,生成对照指纹图谱,通过相似度分析、对照品指认、方差分析、聚类分析（HCA）、主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘法-判别分析（OPLS-DA）对荆芥穗炮制前后进行多模式识别研究。结果 分别建立了荆芥穗和荆芥穗炭的UPLC指纹图谱,确定了13个共有峰,指认4、9、11、13号峰分别为木犀草苷、迷迭香酸、胡薄荷酮、木犀草素;相似度结果显示,炮制前后相似度均大于0.9,HCA、PCA、OPLS-DA结果可明显将荆芥穗和荆芥穗炭区分为2类,2、4、7~12号峰是引起荆芥穗和荆芥穗炭间成分差异的主要标志性成分,与方差分析结果一致。结论 建立的多指标指纹图谱鉴别方法对荆芥穗药材及其炮制品的质量控制及整体性评价具有重要意义。     

中药仙鹤草不同药用部位的体外药效学研究

目的：研究仙鹤草药材不同药用部位的体外抗氧化、抗肿瘤、抗凝血活性,为生药不同部位的合理应用奠定实验基础。方法：采用HPLC色谱法建立仙鹤草不同药用部位的指纹图谱;采用MTT比色法研究仙鹤草不同药用部位对人肝癌细胞株HepG2细胞、人胃癌细胞株HGC-27细胞、人结肠癌细胞株Caco-2细胞增殖作用的影响;采用2,2''-联氮-（3-乙基苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（ABTS）法、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）法检测仙鹤草不同药用部位的抗氧化能力;采用ELISA法测定仙鹤草不同药用部位对小鼠凝血酶原（PT）指标的影响。结果：仙鹤草不同药用部位的指纹图谱之间存在明显差异,根、茎、叶、花均显示不同程度抗肿瘤、抗氧化、抗凝血药效,其中茎对HepG2、HGC-27、Caco-2三种癌细胞株的增殖抑制作用强于根、叶、花;叶、花清除DPPH、ABTS自由基的能力强于根、茎;茎、叶降低小鼠血浆凝血酶原水平的能力强于根、花。结论：仙鹤草不同药用部位的抗氧化、抗肿瘤、抗凝血药效存在差异,为仙鹤草药材以药效为导向的不同药用部位的合理使用提供实验依据,为生药不同部位的精准应用奠定实验基础。     

荆芥柠檬烯-3-羟化酶基因克隆及生物信息学分析

目的:克隆荆芥(Schizonepeta tenuifolia)中的柠檬烯-3-羟化酶基因(limonene-3-hydroxylase,StL3OH),并对该基因的cDNA序列进行生物信息学分析.方法:根据荆芥转录组数据库设计特异性引物,通过逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术克隆StL3OH基因的cDNA序列,...     

中药荆芥的单萜类化合物

目的：对传统中药荆芥Schizonepeta tenuifolia(Benth.)Briq。中的单萜类化学成分进行研究。方法：溶剂提取、柱层析分离纯化、光谱测定化学结构。结果：从中药荆芥的全草中分离得到2个新的和3个已知的单萜类化合物。结论：根据理化性质和光谱数据，新化合物的结构鉴定为3－羟基－4（8）－烯－对－薄荷烷－3（9）－内酯；1，2－二羟基－8（9）－烯－对－薄荷烷。     

HPLC法同时测定不同产地紫苏叶和荆芥中咖啡酸和迷迭香酸

目的建立同时测定紫苏Perilla frutescens叶和荆芥Schizonepeta tenuifolia中咖啡酸、迷迭香酸的方法。方法采用反相高效液相色谱法,Agilent C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm),流动相为乙腈-0.1%磷酸水溶液,梯度洗脱。检测波长327 nm,柱温30℃,体积流量1.0 m L/min。结果咖啡酸、迷迭香酸2种成分达到了较好的基线分离,且峰形良好,分别在0.69~22.12、3.65~116.92μg/m L内线性关系良好,r分别为0.999 5、1.000 0;平均加样回收率分别为紫苏叶102.9%(RSD 1.8%)、105.6%(RSD 1.9%),荆芥101.2%(RSD 2.4%)、101.0%(RSD 1.9%)。结论本方法快速、灵敏、准确,所有待测组分峰分离度良好,可为紫苏叶、荆芥药材的质量评价提供依据。     

荆芥1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶基因克隆及生物信息学分析

目的 克隆荆芥1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶(1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase,StDXS)基因,并进行生物信息学分析.方法 根据荆芥转录组数据获得的StDXS基因序列设计特异性引物,通过RT-PCR技术获得StDXS基因cDNA的全长序列,并进行生物信息学分析.结果...     

基于NLRP3/细胞焦亡通路研究荆芥挥发油的抗抑郁作用及作用机制

目的 观察荆芥Schizonepeta tenuifolia挥发油对慢性温和不可预知应激（chronic unpredictable mild stress,CUMS）模型小鼠抑郁样行为的干预作用,探究其调控NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NOD-like receptor pyrin domain containing 3,NLRP3)炎症小体/细胞焦亡从而抑制神经炎症的作用机制。方法 雄性ICR小鼠制备CUMS抑郁样模型,依据糖水偏好率将造模成功的小鼠随机分为模型组、氟西汀（10 mg/kg）组和荆芥挥发油高、低剂量（100、50 mg/kg）组,同时设置对照组。给予药物干预5周后,进行小鼠糖水偏好实验、强迫游泳实验、悬尾实验与飞溅实验。行为学测试结束后,取血并分离血清,取海马组织。ELISA法测定血清中白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)水平;尼氏染色法检测海马CA3区神经元尼氏小体平均吸光度值;免疫荧光法检测海马CA3区NLRP3、活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1(cle...     

远志花粉活力与柱头可授性分析

目的:研究远志花粉活力和柱头可授性,以期为远志的有性繁殖和杂交育种工作研究提供科学依据。方法:用I2-KI法,2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC)法测定不同开花天数(开花前一天、第1天、第2天、第3天、第4天、第5天、第6天、第7天、第8天)的远志花粉活力变化,并比较2种染色方法对远志花粉活力的染色效果。用I2-KI法分别测定1 d中不同时间段的远志花粉活力、不同贮藏方法(湿法保存的花朵和干法保存的花朵)的远志花粉活力及不同贮藏条件(4,26,-20,-80℃)条件下贮藏不同时间(2,4,8,24,48,72 h)远志花粉活力。用联苯胺-过氧化氢法测定其柱头可授性。结果:(1)远志的花粉活力随着散粉时间的延长而逐渐降低,在开花后第4天花粉活力最高;(2)在一天8:00~18:00中,10:00~16:00的花粉活力较强;(3)干燥花粉在-20℃贮藏的条件下能延长花粉的贮藏时间;(4)开花后第5天柱头可授性最强。结论:可以采集花后第4天的花粉对花后第5天的柱头进行人工授粉杂交,为远志良种选育提供理论依据。     

远志种苗的质量分级标准

目的:制定远志种苗质量分级标准,为远志优质种苗繁育及规范化生产奠定基础。方法:通过田间试验,以我国远志主产区征集的27份远志种苗为研究材料,在测定种苗单株鲜重、单株干重、苗长、苗粗、根长、根粗、叶长和叶宽等质量指标基础上,确定远志种苗分级的主要指标,通过K均值聚类法划分种苗类别,并制定分级标准。同时,采用高效液相色谱法测定分级后远志种苗中主要有效成分含量。结果:根长、根粗、苗长、苗粗是评价远志种苗质量分级的主要指标;单株鲜重是评价远志种苗质量的重要指标;叶长是评价远志种苗质量的参考指标。结合远志生产实践,将不同产地来源远志种苗划分为3个等级:一级种苗单株鲜重≥0.18 g,根长≥12.00 cm,根粗≥0.10 cm,苗长≥14.00 cm;二级种苗单株鲜重0.10~0.18 g,根长9.00~12.00 cm,根粗0.07~0.10 cm,苗长12.00~14.00 cm;三级种苗单株鲜重0.08~0.10 g,根长8.00~9.00 cm,根粗0.06~0.07 cm,苗长10.00~12.00 cm。结论:考虑到种苗是保证药材质量的基础,建议远志人工栽培中采用一、二级种苗,以保证获得高产量高品质的远志药材。     

基于色泽量化与UPLC指纹图谱的不同产地荆芥药材质量评价

目的：基于色泽量化原理分析荆芥药材粉末颜色与超高效液相色谱法 （UPLC） 指纹图谱、指标成分含量、浸出物的相关性,同时对不同产地荆芥药材的质量进行评价。方法：采用 UPLC 测定不同产地荆芥药材的指纹图谱,采用分光测色仪测定药材粉末颜色 （L~*、a~*、b~*值）,同时测定醇溶性浸出物、水溶性浸出物及指标成分含量,运用 SPSS 26. 0 软件分析色度值与各项测定指标的相关性,结合聚类分析法、正交偏最小二乘法-判别分析（OPLS-DA） 模型、熵权 TOPSIS 法对 13 批不同产地的荆芥药材质量进行评价。结果：13 批荆芥药材的 UPLC 指纹图谱共确定 21 个共有峰,相似度较高,指认出橙皮苷、迷迭香酸、胡薄荷酮 3 个成分。相关性分析筛选出峰 1 分别与 L~*、b~*、总色值 （E） 呈高度正相关,胡薄荷酮含量、峰 17 分别与 L~*、b~*、E 值呈高度负相关,橙皮苷含量、峰 9 分别与 b~*值呈高度正相关;峰 3 分别与 L~*、b~*、E 值呈显著正相关,橙皮苷含量、峰 9 分别与 L~*、E 值呈显著正相关,峰 7、18 分别与 L~*、E 值呈显著负相关,...     

远志种子质量分级标准考察

目的:研究制定远志种子的质量分级标准。方法:通过对不同产地29个批次远志种子的千粒质量、含水量、发芽率、生活力、单粒大小、净度等指标进行测定和外观形态的观察,使用Excel 2003,SPSS 20.0等统计分析软件对检测结果进行聚类分析整理,制订远志种子质量分级标准。结果:Ⅰ级远志种子的发芽率不低于77.00%,生活力不低于94.00%,千粒重不低于3.10 g,净度不低于80.00%,含水量不高于8.00%;Ⅱ级远志种子的发芽率(67.00～77.00)%,生活力(88.00～94.00)%,千粒质量2.80～3.10 g,净度(60.00～80.00)%,含水量(8.00～9.00)%;Ⅲ级远志种子的发芽率(55.00～67.00)%,生活力低于88.00%,千粒质量低于2.80 g,净度(48.00～60.00)%,含水量9.00%。结论:发芽率和生活力为质量分级标准的主要指标,千粒质量为重要指标,净度和含水量为参考指标。该研究制定的远志种子质量分级标准科学、符合实际情况,为远志种子的质量评价和人工栽培提供参考依据。     

钠盐胁迫对远志种子萌发特性的影响

目的:通过研究不同钠盐胁迫下远志种子的萌发特性,为盐碱地中远志的前期育苗提供参考,提高远志的产量,促进盐碱地的高效利用。方法:采用单盐NaCl,Na_2CO_3,Na_2SO_4和混合盐NaCl+Na_2SO_4,NaCl+Na_2CO_3,Na_2CO_3+Na_2SO_4,NaCl+Na_2CO_3+Na_2SO_4不同钠盐溶液对远志种子的发芽过程进行胁迫,以蒸馏水为对照,每天统计并记录发芽数,计算发芽率,发芽势,发芽指数和活力指数,发芽结束后测量株高,根长,鲜重及干重。结果:当NaCl浓度≥150 mmol·L~(-1),混合盐Na+(NaCl+Na_2SO_4)浓度≥50 mmol·L~(-1),混合盐Na+(NaCl+Na_2CO_3)浓度≥100 mmol·L~(-1),混合盐Na+(Na_2CO_3+Na_2SO_4)浓度≥25 mmol·L~(-1),混合盐Na+(NaCl+Na_2CO_3+Na_2SO_4)浓度≥50 mmol·L~(-1)时,处理组的发芽率显著低于蒸馏水组(P0.05),显著抑制远志种子的发芽。当Na_2CO_3浓度≥5 mmol·L~(-1)时,种子的发芽率与蒸馏水组相比显著降低(P0.05),显著抑制远志种子的发芽,且随着浓度的增大,抑制作用逐渐增强。结论:低浓度的NaCl,Na_2SO_4,NaCl+Na_2SO_4,NaCl+Na_2CO_3,Na_2CO_3+Na_2SO_4,NaCl+Na_2CO_3+Na_2SO_4盐溶液对远志种子的萌发无影响,随着浓度的增大,对远志种子的发芽有显著的抑制作用。单盐Na_2CO_3溶液对种子发芽的抑制作用最强,Na_2CO_3≥5 mmol·L~(-1)时对远志种子的萌发具有显著的抑制作用,且随着胁迫浓度的增大,抑制作用逐渐增强。