基于PCR技术可视化鉴别金钱白花蛇方法的建立

目的 基于聚合酶链式反应(PCR)技术,利用核酸扩增产物,建立一种可以快速鉴定金钱白花蛇中药材真伪的可视化试纸条检测方法。方法 提取金钱白花蛇、赤链蛇及市售样本的基因;根据mtDNA Cytb序列进行对比分析,设计1对特异性鉴别引物,进行修饰物标记;建立鉴别PCR反应体系,使用核酸扩增产物,利用可视化试纸条对市售样本进行真伪鉴定。结果 鉴别引物可将正品金钱白花蛇中药材扩增出500~600 bp之间的特异性条带,而伪混品则不出现相应的特异性条带;可视化试纸条对市售样本进行检测,鉴别效果良好,灵敏度高,可准确鉴定中药材真伪。结论 可视化试纸条可以快速鉴别金钱白花蛇中药材真伪,稳定性高、特异性强,可应用于市场出售金钱白花蛇中药材的鉴定。     

金银花中几种分子的真伪鉴别方法比较及其研究进展

中药材的真伪对于中医临床用药具有至关重要的作用。作为中药鉴定的重要组成部分,DNA分子标记技术已越来越广泛地应用于中药材的真伪鉴别。近年来,涌现出许多中药分子鉴定新方法,但对于这些新方法的系统比较分析尚未见报道。本文以药材金银花真伪鉴别为例,比较了表达序列标签-简单重复序列多态性、聚合酶链式反应-限制性酶切长度多态性、位点特异性PCR、DNA条形码技术和环介导等温扩增技术的原理、特点、检测方法以及检测时间和应用范围等,并针对各方法的缺陷提出相应的改进措施,以期筛选到适合金银花快速真伪鉴别的方法,也为其他中药材分子鉴别研究提供示范。     

基于ITS2条形码的两面针药材及其混伪品的鉴别

目的 利用ITS2条形码鉴别两面针药材及其混伪品,为两面针药材鉴定提供新方法.方法 采用PCR法扩增ITS2(转录第二间隔区)序列,双向测序后运用CodonCode Aligner、MEGA软件进行数据处理,构建系统聚类树(NJ树).结果 两面针药材及其混伪品基因组DNA降解明显,但不影响ITS2条形码的PCR扩增和测序,ITS2条形码序列分析表明种内与种间遗传距离具有较大差异,基于ITS2条形码构建NJ树可鉴别两面针药材及其混伪品.结论 ITS2条形码适用于两面针药材及其混伪品的鉴别,为两面针药材快速、准确鉴定提供新方法;为两面针基原研究提供重要的分子鉴定证据;同时为DNA条形码技术应用于其他根、茎类中药材的鉴定提供了示范作用.     

中药地龙中参环毛蚓环介导等温扩增快速检测方法

[目的]建立中药材地龙中参环毛蚓的环介导等温扩增(LAMP)检测技术,实现对参环毛蚓的快速检测。[方法]采集不同产地地龙,提取总DNA后将所提取的总DNA进行线粒体细胞色素氧化酶Ⅰ亚基(COI)基因片段扩增、测序、比对,判断各产地地龙物种。用设计的LAMP引物组进行地龙LAMP实验,反应结束后向扩增产物中加入核酸染料SYBR GreenⅠ,分别在自然光、紫外光下直接通过肉眼来观察颜色变化及利用琼脂糖凝胶电泳来检测其引物的特异性。[结果]利用新设计的LAMP引物对参环毛蚓实现了特异性扩增,且检出限达40 fg/μL,具有极高的灵敏度。[结论]利用LAMP技术可实现参环毛蚓的现场快速检测。     

RAPD技术在中药鉴定中的研究进展

随着分子生物学和基因工程技术的日趋成熟,通过基因工程分析手段,从遗传物质的DNA分子水平检测生物遗传多样性并进行分类与鉴定成为一个新的便捷、准确的鉴定方法。中药鉴定所需的分子标记技术可分为3大类:①基于传统的Southern杂交技术的分子标记,如限制性内切酶片段长度多态技术(RFLP);②基于多聚酶链反应(PCR)的分子标记(PAPD)、随机扩增多态性DNA(RAPD)、任意引物PCR(AP-PCR)、DNA扩增指纹(DAF)等;③PCR和RFLP技术的结合,即RFLP技术。其中RAPD技术应用最多[1]。现将RAPD技术在中药鉴定中的研究进展综述如下。1技…     

中药分子鉴定方法评述

中药基原的准确鉴定是中药安全用药和质量控制的前提所在,作者综述了在中药鉴定中涉及到的分子鉴定方法,对基于测序、PCR扩增及杂交等发展起来的分子鉴定技术的原理、特征及其在中药鉴定应用中的优劣进行了介绍,并就分子鉴定技术的未来发展进行了展望.     

分子鉴定技术在中药中的应用

对近些年来兴起的分子鉴定技术进行了分析总结,主要包括随机扩增多态性DNA(RAPD)、扩增性简单序列重复(ISSR)、限制性内切酶切片段长度多态性(RFLP)、扩增限制性内切酶片段长度多态性(AFLP)、单核苷酸多态性(SNP)、DNA条形码序列分析等技术。从中药材真伪鉴定、中药材正品与替代品鉴定、中药材多基原鉴定和遗传多样性、中药材产地鉴别、中药材年限鉴别5个方面对分子鉴定技术在中药中的应用进展进行了归纳总结,阐述了分子鉴定技术存在的一些问题及其未来的发展方向。     

中药DNA条形码分子鉴定技术的应用与展望

中药材品种广泛,存在多基原的情况,质量差异较大,使临床用药安全性和有效性难以得到保证。因传统中药鉴定方法的局限性,对准确鉴别多基原中药材带来了一定的挑战。为了保证中药临床用药安全有效可控,中药鉴定学已成为最重要的研究课题之一,也是当前中医药事业急需解决的关键技术要求。DNA基因鉴别是从基因层面对中药材进行快速、准确的鉴定,包括DNA分子标记法、核酸探针杂交法和DNA条形码技术,其中DNA条形码技术应用最为广泛。DNA条形码是利用标准的DNA片段对物种进行鉴定的技术,2015年版《中国药典》收载了DNA条形码技术指导原则,建立了动物类采用细胞色素C氧化酶亚基I(COI)序列为主,转录间隔区间(ITS)2为辅;植物类采用ITS2/ITS为主,叶绿体psb A-trn H为辅的中药材鉴定体系。该技术的广泛应用为中药鉴别提供更高效快速的方法,并且有效地应用于多基原中药材的鉴别中,使中药品种混乱现象得到极大改观。文章首先对DNA条形码技术的原理、目的及意义、标准片段的选择进行介绍,着重阐述该技术在中药鉴定中的应用以及存在的局限性,并提出展望,以期为中药材的鉴定研究提供参考。     

DNA分子标记在中药鉴定中的应用及发展趋势分析

目的 对DNA分子遗传标记技术在中药材鉴定领域的应用作一综述.方法 通过查阅20世纪90年代以来发表的文献进行归纳分析.结果 DNA分子遗传标记技术具有微量、快速、特异性强、准确可靠、对样本要求较低的特点;使用较多的方法 主要有RAPD、ISSR、ITS标记以及rRNA基因序列分析技术.同时,DNA分子标记技术也存在着使用局限、对实验硬件和从业人员的技术要求高、成本较高、技术复杂度高、对不同部位入药的药材仍然难以区分以及无法用于成药、复方、提取液鉴定等弱点.结论 DNA分子遗传标记作为中药材鉴定的方法 还有待发展和完善.     

中药材分子鉴别现场运用的策略与实践

在中药材实际生产与贸易交流中,中药材准确、快速鉴别一直是比较困难的工作。分子鉴别被认为是传统鉴别技术的有益补充,但目前分子鉴别方法仅止于实验室阶段,难以实现在产地、药市、药房等进行现场鉴别,极大的限制了其使用的范围和推广程度。其中,中药材DNA快速提取技术和DNA标记的快速检测技术是实现分子鉴别现场运用的两大瓶颈和关键问题。该研究开发了一套中药材分子鉴别现场运用模块系统,包括药材DNA快速提取模块、DNA标记检测模块和保障模块,并配备了相应的自主开发试剂盒、仪器装备。运用这套系统对金银花进行现场鉴别,可在40~60 min完成,且仪器装置简单、易于操作,为传统中药现场鉴别手段的有益补充。     

滤纸法快速提取中药材DNA方法的研究

目的:为了建立一种快速提取中药材DNA的新方法,本研究考察了滤纸法对中药材DNA提取的适用性。方法:提取了33个中药材DNA,动物药使用COI(除了海马)、植物药使用ITS2、真菌使用ITS通用引物进行聚合酶链式反应(PCR)扩增。结果:通过琼脂糖凝胶电泳检测发现,27个中药材PCR扩增成功,扩增成功率达到81.8%。结论:研究结果表明滤纸法对于动物类、叶类、花类、全草类、果实类及根茎类药材DNA提取有较好的效果,提取时间可控制在30 s之内。滤纸法缩短了DNA提取时间,减少了提取成本,将在中药材分子鉴别中发挥重要作用。     

15种中药材表面污染真菌的分离与分子鉴定

为了了解中药材受真菌污染的状况,探索中药材表面污染真菌的快速鉴定方法.利用PDA培养基进行中药材污染真菌的分离与纯化.根据真菌基因组ITS序列设计特异引物,通过PCR扩增和序列分析进行菌株鉴定.从15种湖北市售中药材上分离得到50株真菌,污染率为93.3%.利用分子鉴定方法成功鉴定了其中的27株.中药材受真菌污染现象较为普遍,各菌属污染中药材情况不同,其中以曲霉属真菌的污染较严重,存在潜在的风险.该实验所设计的引物通用性较好,可用于中药材表面污染真菌的鉴定.     

相似中草药植物鉴定技术的研究进展与展望

本研究主要描述了相似中草药植物国内鉴定的研究现状以及国外对相似植物鉴定的研究进展,着重分析了新技术,新方法的原理及优缺点,例如植物生物技术、光谱鉴别技术和计算机视觉技术。随着科学技术的不断更新,相似中草药植物鉴定的精确度得到了提高,并且促进了我国中草药植物鉴定事业的快速进步。本文主要深入分析了相似中草药植物鉴定技术的最新进展,从而对新技术的原理和特点加以综述并对未来前景加以展望。     

多组学差异表征与分子鉴定赋能中药的精准鉴别——以人参属中药为例

中药基原鉴定特别是对易混淆品种的区分，是中药质量控制的难点。同属植物（或近缘品种）、同植物不同部位来源的中药往往化学组成十分相似，这为中药的真伪鉴别，特别是配方颗粒或中成药投料真实性的鉴定带来了极大的挑战。人参及其同属多种植物来源的中药对机体具有补益作用，目前在全球范围内使用广泛。人参属多个品种属于易混淆中药，特别是在饮片外观特征消失的成方制剂中易发生混用。近年来，多组学差异表征技术与分子鉴定技术在人参属中药的鉴别及区分中应用广泛，且具有互补性。以人参属多来源中药为例，综述了多组学差异分析技术及分子鉴定技术在品种区分中的应用，以期为易混淆中药的精准鉴别提供方法学参考。     

显微鉴定在中药质量标准中的应用及进展

显微鉴定具有准确、简便、快速、经济、实用及环保等特点,在中药质量标准中占有重要地位,已被主要国家的药典所采纳。本文从中药显微鉴定的理论基础——显微特征的稳定性与专属性两个方面介绍了中药显微鉴定在各国药典质量标准中的应用情况,并结合多年的研究实践提出中药质量标准中显微鉴定研究的技术路线图。最后,探讨了当前中药显微鉴定面临的挑战及发展方向。     

应用微卫星PCR技术鉴别中国林蛙

目的采用微卫星PCR电泳图谱鉴别中国林蛙长白山亚种及混淆蛙种,进而从基源上控制中药材哈蟆油的质量。方法以东北4种不同产地林蛙基因组DNA为原料,根据5对引物的PCR扩增结果,对4种不同产地的林蛙开展鉴别,并采用荧光标记法对结果进行验证。结果在同种引物作用下,4种林蛙的PCR产物电泳图谱显示,DNA条带大小差异明显;荧光标记验证微卫星分子遗传标记方法可以对东北地区4种蛙属动物进行准确鉴别。结论微卫星方法准确可靠,分子遗传标记技术是一个有效的生物鉴定手段,突破了传统鉴定方法,为道地药材保护和利用提供了有力的参考依据,能够用于鉴别物种种类及新物种的产生。     

应用rRNA基因间隔区碱基测序对中药(大黄)进行鉴定

目的:对大黄种子中提取的DNA中rRNA基因内转录间隔区进行PCR扩增,对于PCR扩增,并对PCR扩增产物进行碱基序列测定,以期从分子水平建立对中草药的鉴定标准。方法:常规提取当归、大黄种子DNA,利用合成的特异性引物对其DNA中rRNA基因内转录间隔区进行套式PCR扩增,将扩增产物以四色荧光标记的双脱氧末端终止循环法进行碱基序列测定。结果:经琼脂糖凝胶电泳证实大黄种子中rRNA基因内转录间隔区PRC基因内转录间隔区的完整碱基序列。RRNA基因内转录间隔区的碱基序列可作为分子水平鉴定植物中药材的又一有效途径。