广藿香化学诱变植株SRAP遗传特性及质量研究

目的 研究广藿香化学诱变植株的遗传特性和品质差异。方法 以前期经氟乐灵、亚硝酸钠及亚硫酸钠诱变后筛选出的变异植株为材料,对其基因组DNA进行相关序列扩增多态性（SRAP）分析,并测定其主要有效成分含量。结果 10对SRAP引物扩增的总位点数为235个,其位点数为16~29个,而多态位点数为220个,平均多态性百分比达86.96%;广藿香变异植株的遗传相似系数为0.445~0.938,其变异程度大于不同产地种群间的变异程度;当遗传相似系数为0.55时,变异程度较大的植株N1a、N1b、N1c、S4c、S4d、S6c聚为一类,其他与CK聚为另一类。变异植株主要化学成分百秋李醇及广藿香酮含量与CK差异均有统计学意义（P<0.05）,其中变异植株F1、F2a、F4a、F4d、F4e、F6e、F8i、N2c、N2d的广藿香酮明显升高,且高于百秋李醇的含量,由“醇型”广藿香转变为“酮型”广藿香;变异植株F4c、F6d、F8j、N1a、N1b、N1c、S3b、S4c、S4d、S6b、S6c的百秋李醇或广藿香酮含量均显著高于CK。结论 化学诱变是广藿香新品种选育的有效途径,可提高其遗传多态性,影响其有效成分的合成和积累;变异植株F1、F2a、F4a、F4b、F4d、F4e、F6e、F8i、F10d、N2c、N2d、N1a、N1b、N1c、S4c、S4d、S6c具有开发潜能,可为后续研究提供材料。     

源于鲨鱼肝的一种新基因的克隆表达及其对肝肿瘤细胞的抑制作用

目的：从鲨鱼肝脏中克隆表达一种新基因psll2，纯化该基因的表达产物，研究其对肝肿瘤细胞的抑制作用。方法与结果：我们前面已报道发现了鲨肝细胞再生刺激因子（sHRSF），根据sHRSF的N端氨基酸序列设计了引物，并利用RT-PCR方法从鲨鱼再生肝组织的，6-RNA中扩增到大小约为350bp的cDNA片段，序列分析表明350bp的片段含有一个开放阅读框（ORF），含有333个碱基，编码111个氨基酸残基，其编码的N端氨基酸序列与天然sHRSF的前7个氨基酸一致。该肽被命名为PSL12（来源于鲨肝的分子量约为12kD的肽）。该cDNA被连接到质粒pGEM—T-Easy，获得重组质粒pGEM—T-psll2。根据cDNA序列分析和质粒pET-32a的多克隆位点（BamHI和SalⅠ）的序列，设计并合成了psll2基因的特异性引物，质粒pGEM—T-psll2作为模板，进行了PCR扩增。将此PCR产物插入pET-32a得到表达质粒pET-32a—psll2，并将它转化入E．coli的BL21菌株。经IPTG诱导，带有组氨酸标签的融合蛋白的表达量约为40％。用金属螯合层析纯化融合蛋白后，再用FXa切割融合蛋白，经ResourceQ和MonoQ柱层析得到PSL12纯品，它可抑制肝肿瘤细胞株SMMC．7721和HepG2的增殖。结论：从鲨鱼肝脏中获得了一种新基因psll2。该基因的表达产物PSL12能显著抑制体外培养的肝肿瘤细胞的增殖。     

冬虫夏草指标蛋白IP4的cDNA全长克隆及抗原决定簇预测研究

目的克隆获取冬虫夏草指标蛋白氰酸酶(IP4)的c DNA全长及对其抗原表位预测。方法结合课题组前期采用蛋白组学法筛选得到的冬虫夏草指标性蛋白IP4和冬虫夏草转录组数据,挖掘IP4 m RNA序列,并克隆IP4 c DNA全长,通过NCBI结构分析服务系统对IP4进行保守区和功能区分析,利用DNAMAN 6.0和DNAStar软件分别进行序列比对和抗原表位分析。结果从转录组数据中挖掘到IP4的2个可变剪接体,属于内含子保留的可变剪接。RT-PCR结果显示,IP4 c DNA全长465 bp,编码154 aa(氨基酸)。IP4蛋白的保守区和主要催化活性位点位于87～154 aa,该区域为氰酸酶家族保守核心区域和二聚体结合区域,DNAMAN 6.0分析结果表明1～39 aa和55～81 aa区具有较高种属特异性,DNAStar预测IP4蛋白的抗原表位区主要分布于25～90 aa。结论最终确定IP4的25～39 aa和55～81 aa为最佳抗原特异区,为后续规模化制备IP4蛋白特异抗原区及免疫法鉴定冬虫夏草奠定基础。     

利奈唑胺诱导金黄色葡萄球菌耐药株50S核糖体蛋白突变位点分析

目的阐明体外诱导利奈唑胺耐药金黄色葡萄球菌的核糖体蛋白位点变异特征。方法收集2株金黄色葡萄球菌质控菌ATCC29213和ATCC25923、1株乳汁来源的金黄色葡萄球菌和1株血流感染的金黄色葡萄球菌(编号分别为S2、S3、S5和S7菌株,均为甲氧西林和利奈唑胺敏感株),通过体外浓度倍增法诱导利奈唑胺耐药;挑取单克隆,经E-test条测定MIC值,获得各菌株的耐药浓度梯度;提取耐药菌株基因组DNA,PCR扩增核糖体蛋白L3和L4(对应rpl C和rpl D基因),扩增产物经测序后与野生株比较,获得核糖体蛋白对应氨基酸的突变位点。结果经体外多步法诱导利奈唑胺耐药的不同MIC值金黄色葡萄球菌共24株。PCR测序分析4株母株均无变异位点,各菌株L3对应的氨基酸位点不尽相同,S2组菌株L4未见统一的氨基酸位点,余S3、S5、S7各组菌株普遍存在Ala56Asp氨基酸位点变异。结论体外多步法可诱导金黄色葡萄球菌利奈唑胺耐药,耐药机制与核糖体蛋白位点突变密切相关,但仍需进一步研究证实突变位点与耐药的关系。     

乙肝病毒前S_1抗原检测的临床意义

乙型肝炎病毒(HBV)表面抗原基因组分别编码前S1、前S2和S3种主要蛋白,前S1抗原(PreS1-Ag)由108或119个氨基酸残基组成[1],位于乙肝病毒外壳的最外面,具有高度的免疫原性.     

瘦素与前列腺癌

瘦素是一种主要由脂肪细胞分泌的蛋白类激素，通过自分泌和旁分泌对其靶细胞发挥着各种不同的作用。人瘦素基因由定位于7q31.3的肥胖基因（obese，ob）编码，其蛋白全长167个氨基酸，而循环中的瘦素是切掉N端21个氨基酸残基的信号肽后形成的146个氨基酸多肽。瘦素的活性通过与广泛存在于如中枢神经系统、脂肪、心、肝、肺、肾、胰岛、造血、淋巴组织以及前列腺等不同组织器官上的特异性受体和相应信号传导系统介导。目前研究发现瘦素不仅可以抑制食欲、参与调节能量代谢和神经内分泌，而且通过调节血管新生、肿瘤细胞增殖、细胞凋亡、免疫和炎症反应与肿瘤的发生、形成和代谢密切相关。     

同源建模和分子对接揭示甜菊糖苷糖基化关键酶SrUGT76G1的构效关系

目的 揭示甜菊糖苷糖基化关键酶SrUGT76G1的构效关系。方法 采用RT-PCR法克隆各甜叶菊Stevia rebaudiana材料中的SrUGT76G1变异序列;采用原核表达系统—大肠杆菌和体外催化反应验证各变异序列功能;采用Modeller 9.17软件对SrUGT76G1各变异序列蛋白进行同源建模,利用AutoDock Vina工具进行对接分析。结果 除变异序列N02序列和N03序列外,还分别从110和B1188材料中获取了2个变异序列110-3序列和B1188序列。各变异序列蛋白体外催化反应和催化效率比较分析结果表明,N02蛋白相较于UGT76G1（N01-1,AY345974.1）活性显著下降,特别是以甜茶苷、甜菊糖苷（stevioside,ST）和莱鲍迪苷D（rebaudioside D,RD）为糖基受体底物时,B1188、N03和110-3蛋白对糖苷的糖基化功能已丧失;同源建模和分子对接分析发现由于各变异序列蛋白中氨基酸残基的改变,导致翻译形成的蛋白三维空间结构改变,导致无法完全包裹催化底物。结论 SrUGT76G1形成的活性口袋能否较好地包裹糖基受体底物是其活性强弱和有无的关键。     

异叶天南星查尔酮合成酶和异构酶基因的克隆及蛋白的结构性质分析

查尔酮合成酶(CHS)和查尔酮异构酶(CHI)是黄酮类物质生物合成途径中的关键酶,该研究从中药异叶天南星(Arisaema heterophyllum Blume,Ah)转录组数据库中筛选出查尔酮合成酶基因(Ah CHS)和查尔酮异构酶基因(Ah CHI),利用RT-PCR技术克隆了它们的开放阅读框(ORF)部分,并对其编码蛋白Ah CHS和Ah CHI的理化性质、表达及结构特点进行分析。Ah CHS的ORF长度为1 176 bp,编码392个氨基酸的蛋白质;而Ah CHI的ORF长度为630 bp,编码蛋白含209个氨基酸。Ah CHS作为对称同二聚体,N端螺旋互相交换,每个单体由2个亚结构域组成,位于2个亚结构域之间交界处的4个保守的氨基酸残基构成了酶的活性中心; Ah CHI的三级结构采用了开放的β-三明治褶皱,1个大的β折叠片层(β4～β11)和1个α螺旋片层(α1～α7)组成其核心结构,其中β4,β5,α4和α6在不同物种间高度保守,部分疏水氨基酸形成了酶的活性位点。系统进化树分析发现Ah CHS与火鹤花CHS亲缘关系最近;而Ah CHI与紫牡丹CHI亲缘关系最近。表达分析表明编码Ah CHS的基因在根和块茎中的表达量明显比叶多,而编码Ah CHI的基因在块茎部位的表达量最高。该研究为Ah CHS和Ah CHI功能的进一步研究及植物黄酮类化合物生物合成途径的解析提供了基础。     

甘草中新NADPH细胞色素P450还原酶基因的克隆与相关生物信息学分析

目的从甘草Glycyrrhiza uralensis中克隆1个新的NADPH细胞色素P450还原酶基因(Gu CPR,登录号:MH401048)并进行生物信息学分析。方法提取甘草根部总RNA后逆转录为cDNA,通过转录组数据库筛选得到Gu CPR基因全长,利用NCBI ORF finder得到其开放阅读框并翻译得氨基酸序列,设计引物进行PCR扩增,构建克隆重组质粒。利用生物信息分析预测蛋白性质、结构等及模拟蛋白三级结构,并构建同源系统进化树。结果克隆得到Gu CPR基因cDNA全长2 118bp,编码705个氨基酸残基,相对分子质量78 450,等电点(pI)5.19。Gu CPR蛋白为非分泌蛋白,不具有信号识别功能。跨膜预测结果显示蛋白的第44~64位氨基酸为跨膜区,同时,亚细胞定位预测结果显示蛋白位于内质网上。结论克隆得到一个新的Gu CPR,并进行了生物信息学分析,为进一步研究提供了理论基础。     

人干细胞因子基因大肠杆菌表达产物结构分析及活性研究

 目的确证人干细胞因子基因在大肠杆菌表达产物的正确性。方法通过蛋白质杂交，氨基酸末端序列分析，质谱分析及动物体内生物活性的研究，对人干细胞因子基因大肠杆菌表达产物——重组人干细胞因子(rhSCF)分子进行了鉴定。结果大肠杆菌表达产物rhSCF N端15个氨基酸序列及C端2个氨基酸序列与理论推测一致，产物的相对分子质量为18 583.75，质量肽谱与理论序列的重叠率为98.2%，动物试验亦表明当与粒细胞集落刺激因子(G CSF)联用具有显著的外周血干(祖)细胞动员作用。结论人干细胞因子基因大肠杆菌表达产物与理论推测完全一致，为其中试及临床试验奠定了基础。