乌头霜霉病病原物分子检测方法的建立

目的:建立乌头霜霉病病原菌快速分子检测方法,为乌头种苗检疫及栽培环境土壤安全性评价提供依据。方法:使用真菌DNA提取试剂盒提取病原菌DNA,采用真菌核糖体内转录间隔区(ITS)通用引物ITS1/ITS4,对病原菌的r DNA-ITS区间序列进行扩增,将聚合酶链式反应(PCR)产物回收纯化并进行序列测定,并将测得的ITS序列同Gene Bank中搜索到的相关ITS序列进行比较,运用DNAMAN比对出特异序列片段,利用特异序列片段通过Primer Premier 5.0设计并筛选特异性引物,建立乌头霜霉病病原菌快速PCR检测方法。结果:从Primer Premier 5.0设计的8对引物中筛选出了灵敏度高、特异性强的引物对L1A/L1B,该引物能够从乌头霜霉病病原菌DNA扩增出670 bp的具有检测价值的明亮条带,利用该引物也能够检测出乌头种苗、成株以及栽培土壤是否存在乌头霜霉病原菌。结论:筛选出的引物对L1A/L1B能够快速、简便、有效地检测出乌头霜霉病病原菌,建立的方法能用于对乌头种苗霜霉病的提前检测或检疫。     

乌头霜霉病传播机制初步研究

目的:明确乌头霜霉病病原菌的繁殖方式及传播途径,为乌头霜霉病的生物防治技术提供理论基础。方法:调查不同种源地乌头霜霉病发病情况,并对患病乌头的根、茎、叶进行石蜡切片,在光学显微镜下观察病原菌的繁殖方式;采用扫描电子显微镜观察乌头病叶上病原菌的定殖、生长以及传播的方式。结果:不同种源地的乌头幼苗霜霉病发病情况不同;通过显微观察,在患病乌头的茎和叶中均发现了卵孢子,在种根中未观察到卵孢子;在电子显微镜下观察乌头霜霉病叶,发现孢子囊以萌发芽管的方式,通过叶片气孔或者伤口定殖于植株上,并通过在细胞间产生吸器从寄主吸取营养,萌发孢囊梗,再产生孢子囊。结论:乌头霜霉病发病与种苗是否带菌有关,其传播可能是乌头霜霉卵孢子在种苗内越冬,春天萌发侵染乌头。     

基于“形态+分子”方法对疑似灵芝属样品的基原探究

目的:为疑似"灵芝"属样品基原探究提供性状和分子鉴定证据。方法:在基于传统形态特征初步鉴定基础上,对疑似灵芝属两样品ZZ和SS的rDNA-ITS区序列进行PCR扩增,经克隆测序后,与GenBank数据库中序列进行BlastN比对,样品及最相似物种ITS序列对齐后使用MEGA 6.0软件构建系统发育树。结果:测序得到样品ZZ和SS的rDNA-ITS区序列分别为752、753个碱基,与已发表极硬红皮孔菌(Pyrrhoderma adamantinum)rDNAITS区序列相似度达99.0%,并在系统发育树中与极硬红皮孔菌聚为一支,而与紫芝、树舌灵芝遗传距离较远。结合样品ZZ和SS的子实体形态和扫描电镜观察鉴定结果判断其为极硬红皮孔菌。结论:基于rDNA-ITS区序列分析和系统发育树构建药用真菌分子鉴定方法,为疑似样品基原鉴定提供理论依据和技术支持。     

基于ITS2条形码的乌头属藏药植物鉴别

目的乌头属藏药植物变异极为复杂,品种繁多,商品来源复杂,极易造成药材混乱,且大多乌头属藏药具有较大的毒性,使安全用药面临巨大挑战。采用ITS2序列为DNA条形码,建立一种快速、准确鉴定乌头属藏药药材的方法。方法从青藏高原地区采集展花乌头、凉山乌头、工布乌头、露蕊乌头、铁棒锤、甘青乌头、木里乌头、弯喙乌头、多裂乌头、缩梗乌头等乌头属藏药样品50份,分别提取样品DNA,对ITS2目标序列进行PCR扩增、测序,获得其ITS2序列信息;运用MEGA 6.0对50条ITS2序列进行对比,计算种间、种内遗传距离,构建neighbor joining(NJ)系统进化树,并比较样本ITS2序列间的二级结构差异。结果乌头属藏药植物样本种间最小距离大于种内最大距离,NJ树显示各种乌头属植物种内之间各单独形成一个分支,ITS2序列二级结构也有明显差异,能够将乌头属各种植物区分开。结论 ITS2序列作为DNA条形码可以将乌头属藏药植物进行准确、快速的识别和鉴定,为乌头属藏药的安全使用提供可靠的技术手段。     

D101型大孔树脂纯化附子生物碱

目的:研究附子生物碱经D101型大孔树脂富集后化学成分的变化.方法:以附子中总生物碱、酯型生物碱、乌头碱、次乌头碱及新乌头碱的转移率为指标,采用UV,HPLC,TLC分别对富集前后附子提取物中的生物碱进行含量测定及其成分鉴别.结果:采用D101型大孔树脂富集附子生物碱,总生物碱转移率83.70％,纯度67.34％;乌头碱转移率77.78％,次乌头碱转移率94.12％,新乌头碱转移率52.63％;TLC比较发现显示6个相似的生物斑点,说明富集前后生物碱化学成分无明显差异.结论:D101型大孔树脂能有效提高附子中总生物碱的纯度,且各生物碱转移率较高,可用于大生产推广.     

基于rDNA-ITS序列及相似度分析的中药赤芍分子鉴别研究

目的:分析中药赤芍正品及混伪品ITS序列的种内相似度及特定位点序列碱基差异,为建立中药赤芍的分子鉴别标准提供思路。方法:采用PCR扩增产物直接测序的方法对市场上购得的未知来源赤芍样品S1、S2的ITS序列(包括ITS1,ITS2,5.8S)进行测定,测定结果进行BLAST比对、相似度分析、序列特异性碱基位点差异比较;用DNAMAN对GenBank上已注册的正品赤芍和混伪品赤芍的ITS序列进行分析。结果:建立了赤芍药材分子鉴别的3个指标,即根据BLAST结果定属,种内相似度缩小属内范围并定种,再通过特异性碱基位点差异最终确定并证实样品的物种;确定了样品S1来源于芍药属植物芍药Paeonia lactiflora Pall.,样品S2来源于芍药属植物川赤芍Paeonia veitchii Lynch.。结论:本文为赤芍的分子鉴别提供较为有效的思路与方法,同时为基于rDNA-ITS相似度及序列分析进行其他中药品种鉴别提供依据。     

不同产地菊苣的ITS序列分析及模式识别研究

目的 通过分析不同产地菊苣Cichorium intybus和毛菊苣C.glandulosum核糖体基因内部转录间隔区(ribosomal DNA internal transcribed spacer,rDNA-ITS)序列,为菊苣药材鉴定和品种鉴别提供DNA分子标记.方法 采用广谱植物基因组DNA快速提取试剂盒提取14个产地的菊苣和毛菊苣样本的总DNA,利用ITS序列扩增通用引物PCR扩增rDNA-ITS序列并测序.运用DNAMAN V6软件比较两品种菊苣样品ITS序列的差异.所有样品ITS序列上的差异碱基经数学处理后使用SPSS 17.0软件对其进行聚类分析.结果 菊苣ITS序列种内相似度基本上在99.2％以上,毛菊苣ITS序列种内相似度在99.8％以上,而两品种间ITS序列相似度在99.2％以下.两品种菊苣的ITS序列上分别有多个特异性信息位点.聚类分析实现了两品种菊苣ITS序列差异的识别.结论 rDNA-ITS序列是菊苣和毛菊苣药材鉴定和品种鉴别的有效分子标记.     

基于ITS2序列的乌头属药材分子鉴定及亲缘关系分析

目的 应用核糖体基因内转录间隔区（ITS）2序列对乌头属12种药材进行DNA条形码（DNA barcoding）分子鉴定，并确定其亲缘关系。方法 收集乌头属12种药材共计30份，运用离心柱型植物基因组试剂盒的方法提取DNA、使用ITS2序列通用引物进行聚合酶链式反应（PCR）扩增、电泳检测后双向测序，应用CodonCode Aligner 17.0软件对测序序列和峰图进行校对拼接，利用MEGA 7.0软件进行序列变异分析，采用ITS2 Database在线工具预测其二级结构，使用邻接法（NJ）构建系统聚类树。结果 乌头属12种药材ITS2序列长度为220~221 bp，鸟嘌呤和胞嘧啶（GC）平均含量为64.09%；变异位点共140个，信息位点共137个，保守位点共81个，种内遗传距离（K2P）小于种间K2P；在ITS2序列二级结构和NJ聚类分析中，花葶乌头、西伯利亚乌头和高乌头的亲缘关系接近，其他9种药材的亲缘关系接近，其中华北乌头和阴山乌头的亲缘关系更为接近。结论 ITS2序列在乌头属12种药材分子鉴定及确定亲缘关系方面具有较好的应用价值，为民族药的资源保护、开发应用方面提供新的思路、技术和方法。     

乌头内生细菌组成分析

目的 揭示乌头内生细菌的菌群组成及其与生物碱含量的相关性。方法 运用高通量测序分析不同产地乌头叶、茎和根组织内生细菌的16S rDNA V4区,基于测序结果进行内生细菌的多样性分析、物种分类、差异及相似性分析。运用高效液相色谱法分析不同产地乌头叶、茎和根组织乌头类生物碱含量,并对乌头各组织的内生细菌相对丰度和生物碱含量之间进行相关性分析。结果 乌头内生细菌主要由4门,9纲,16目,36属组成;不同产地乌头的内生细菌丰度和多样性均存在差异,但核心菌群组成相似,以变形菌门（Proteobacteria）占主导;共发现6种操作分类单元（operational taxonomic units,OTU）与乌头根组织生物碱含量之间存在相关性。结论 不同产地乌头内生细菌组成存在差异但核心菌群相似,部分内生细菌丰度与生物碱含量之间显著相关。     

菘蓝霜霉病原及其生物学特性研究

目的:为菘蓝霜霉病的深入研究和防治提供理论依据。方法:在菘蓝生长季节观察和描述症状发展变化过程。用悬滴法测定温度、营养和pH值对孢子囊萌发的影响,用硫酸法控制小容器相对湿度和载玻片法测定湿度对孢子囊萌发的影响。结果和结论:经鉴定,菘蓝霜霉病病原菌为寄生霜霉Peronospora parasitica(Pers.) Fr.。孢子囊萌发温限为5~30℃,最适16℃,萌发率为34%,低于6℃不萌发。100%相对湿度的萌发率为3.20%,低于80%不萌发,在水中能很好萌发。孢子囊在pH 4.92~9.18均能萌发,最适pH 7.17。1∶5蔗糖液对孢子囊萌发有较强的促进作用,萌发率较对照高20.5%~38.9%。     

北京地区一种菘蓝白粉病病原菌的鉴定

目的 明确北京地区菘蓝白粉病病原菌的种类及分类地位。方法 通过田间调查了解病害发生情况及为害特征;通过显微镜观察病原菌菌丝形态、产孢结构、分生孢子及其着生方式等;采用特异性引物ITS1/PM6扩增病原菌核糖体脱氧核糖核苷酸-内部转录间隔区,病原菌扩增序列及其高度同源序列用MegaX软件中的邻接法构建系统发育进化树。结果 菘蓝白粉病病原菌菌丝直或略弯,上有浅裂叶状附着胞;分生孢子梗直立或微弯,不分枝;顶端串生分生孢子,长椭圆形或近圆柱形;芽管在分生孢子近端处萌发,直或弯曲,芽管顶端有吸器。根据显微形态特征初步推测,该病原菌属于白粉菌目（Erysiphales）白粉菌科（Erysiphaceae）白粉菌属（Erysiphe）。核酸序列比对结果表明,其与十字花科白粉菌Erysiphe cruciferarum核酸序列（MT309701、MK341128、MF192845、KY660929）一致性均为100%。该病菌与十字花科白粉菌聚为一枝,与其他白粉菌亲缘关系较远。结论 综合形态学特征及分子鉴定结果,该菘蓝白粉病病原菌为十字花科白粉菌。     

附子与山茱萸配伍对慢性心力衰竭大鼠的影响

目的探讨附子与山茱萸配伍对慢性心力衰竭大鼠增效减毒作用。方法 ip盐酸阿霉素构建大鼠慢性心力衰竭模型,分别给予附子提取物、山茱萸提取物和附子-山茱萸提取物3周后,检测动物血清脑钠素(BNP)含量,心肌细胞Ca2+-ATP酶和Na~+,K~+-ATP酶活性,镜下观察左心室组织病理学形态变化。结果造模3周后,模型组大鼠普遍出现腹水、消瘦、稀便、弓背等症状体征;左心室射血分数(EF)和左心室短轴缩短率(FS)明显下降;血清BNP水平显著升高;左心室组织出现心肌纤维断裂及心肌细胞变性、坏死等病理改变。连续ig给予附子-山茱萸提取物3周后,大鼠症状及体征明显改善,血清BNP水平下降,心肌细胞Na~+,K~+-ATP酶活性升高,左心室组织病理学形态有明显改善。附子提取物和山茱萸提取物分别连续给药3周,上述指标未见明显改善。结论附子与山茱萸配伍可能通过提高心肌细胞Na~+,K~+-ATP酶活性,改善慢性心力衰竭的心肌能量代谢障碍,提高心力衰竭的心肌活性,起到增效减毒作用。     

金莲花白粉病病原菌鉴定

目的:明确导致药用金莲花Trollius chinensis Bge.白粉病发生的病原种类及其分类学地位。方法:田间调查观察病害发生及为害特征;借助光学显微镜观察白粉菌闭囊壳、子囊、子囊孢子、附属丝等的显微形态特征;核糖体脱氧核糖核酸(rDNA)-内转录间隔区(ITS)扩增引物ITS1/PM6用于白粉菌分子鉴定,扩增序列用MegaX软件中的邻接法(NJ)构建系统发育树。结果:白粉病每年7月中旬至9月上旬在成株期金莲花茎秆、叶柄及叶片上发生,造成金莲花及种子严重减产,甚至植株早衰死亡。金莲花白粉菌闭囊壳聚生,暗褐色,近球形,直径60~100μm,壁细胞不规则多角形,有凸起;闭囊壳内子囊单个,内含8个浅褐色、卵圆形的子囊孢子;附属丝多根,聚生于闭囊壳一侧,菌丝状,浅褐色,有隔膜,近等粗,直径4~6μm。金莲花白粉菌rDNA-ITS序列与叉丝单囊壳属白粉菌Podosphaera fuliginea(MF543026、AB046986)同源性最高,分别为98.88%、98.73%,与叉丝单囊壳属其他多个种的序列也有较高的同源性(96.00%~98.03%)。根据上述同源菌株的rDNA-ITS序列构建系统发育树,供试金莲花白粉菌与叉丝单囊壳白粉菌P.fuliginea聚为一支。结论:结合田间病害发生、为害特征及病菌闭囊壳、子囊、附属丝等的显微形态特征,将金莲花白粉病菌鉴定为叉丝单囊壳P.fuliginea。     

基于生物转化的附子减毒增效考察

目的:通过固态发酵筛选能使附子减毒增效的微生物,并初步探讨其生物转化机制。方法:选用附子粉为原料,以菌种生长情况、双酯型生物碱含量变化及物质成分变化为评价指标,通过固态发酵方式筛选适合附子生物转化的菌种。采用HPLC-MS初步鉴定新增物质的结构,为附子生物转化的可行性提供理论依据。结果:采用黑曲霉对附子进行生物转化,可使乌头碱含量减少,新增1种毒性较小的苯甲酰乌头原碱。结论:黑曲霉发酵附子实现了减毒增效的目的,为附子炮制新方法的深入研究提供理论依据。     

附子的化学和生物活性研究进展

通过系统查阅附子近40年化学成分和药理作用研究研究文献,对其现代研究进行了综述。分析结果显示附子主要含有生物碱类成分,其中以乌头碱（aconitine）骨架的C-19型二萜生物碱为主,其次为具有海替生碱（hetisan）、维替碱（veatchine）、纳哌啉（napelline）、光翠雀碱（denudatine）等骨架的C-20型二萜生物碱;除生物碱外,附子还含有黄酮、皂苷、多糖、脂肪酸等其他成分。附子的生物活性主要表现为强心、降压、镇痛、抗炎、增强免疫、杀虫、降血糖及毒性等作用。附子现代研究尽管取得了巨大进展,但在阐明其传统药效作用及机制方面,仍存在诸多问题,仍需要进行深入研究。     

淡豆豉炮制过程中产纤溶酶微生物的筛选和鉴定

目的 筛选和鉴定淡豆豉炮制过程中产纤溶酶的优势菌株。方法 按《中国药典》2020年版制备淡豆豉；采用酪蛋白平板法和纤维蛋白平板法分别对淡豆豉炮制不同时间点样本中产纤溶酶的微生物进行初筛和复筛；将产纤溶酶微生物分别接种在特定的液体培养基中培养，获得纯种发酵液，用纤维蛋白平板法测定发酵液的纤溶酶活力；应用16S rDNA和18S rDNA通用引物分别对产纤溶酶细菌和真菌进行PCR扩增、对扩增产物进行测序，测序结果通过NCBI同源性比对、MEGA 4.1软件构建系统发育树进行分子生物学鉴定。结果 筛选获得3种产纤溶酶细菌，分别为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis、嗜麦芽窄食单胞菌Stenotrophomonas maltophilia、微球菌Micrococcus。纤维蛋白平板法测定纯种发酵液纤溶酶活力的结果显示，嗜麦芽窄食单胞菌所产纤溶酶活力最高，达527.49 IU/mL。结论 淡豆豉炮制过程中存在高产纤溶酶的优势菌株，淡豆豉的溶栓作用值得进一步研究。为揭示淡豆豉炮制中纤溶酶形成机制奠定基础。     

基于ITS2和psbA-trnH序列鉴别金线兰及其近缘种

目的 应用ITS2和psbA-trnH条形码鉴定金线兰Anoectochilus roxburghii及其近缘种。方法 提取金线兰及其近缘种的DNA,对ITS2和psbA-trnH序列进行扩增和测序,计算物种种内、种间遗传距离,构建邻接法（neighbor-joining,NJ）系统聚类树直观反映鉴定结果。结果 经PCR扩增后测序,金线兰及其近缘种ITS2序列长度为250～254 bp,GC含量为48.2%～51.6%;psbA-trnH序列长度为636～704 bp,GC含量为31.8%～32.0%。根据K2P遗传距离计算,金线兰的种内遗传距离明显小于种间遗传距离。基于ITS2序列构建的NJ树结果显示,除长片金线兰A.longilobus外,金线兰与其余混伪品可以明显区分。基于psb A-trnH序列构建的NJ树结果显示,除长片金线兰和丽蕾金线兰A.lylei外,金线兰与其余金线兰属近缘种可以明显区分。结论 ITS2和psb A-trnH序列可以鉴别金线兰与其遗传距离较远的近缘种。     

拳距瓜叶乌头二萜生物碱成分研究

目的对拳距瓜叶乌头Aconitum hemsleyanum var.circinatum的块根进行化学成分研究。方法采用柱色谱方法进行分离纯化,结合波谱数据(~1H-NMR、~(13)C-NMR、MS)进行结构鉴定。结果从拳距瓜叶乌头块根总生物碱中共分离得到17个二萜生物碱,分别鉴定为黄草乌碱丁(1)、8-甲氧基黄草乌碱丁(2)、贡乌生(3)、塔拉地萨敏(4)、查斯曼宁(5)、8-甲氧基塔拉胺(6)、14-乙酰塔拉胺(7)、8-去乙酰滇乌碱(8)、crassicautine(9),crassicaudine(10)、粗茎乌头碱甲(11)、黄草乌碱丙(12)、黄草乌碱甲(13)、滇乌碱(14)、transconitine B(15)、工布乌碱(16)、大渡乌碱(17)。结论化合物2、3、6、7、9、12~16为首次从该植物中分离得到。