基于丹参功能基因的道地品质形成的分子机制

目的 探讨丹参功能基因单核苷酸多态性（SNP）和丹参有效成分之间的关系以及丹参药材产地特异性品质形成的分子机制。方法 以8个不同产地及变型的丹参为研究对象,采用高效液相色谱（HPLC）方法得到不同产地丹参成分指纹图谱,同时对丹参酮代谢途径中的3个功能基因丹参乙酰CoA酰基转移酶（SmAACT）,4-diphosphocytidyl-2-C-methyl-D-erythritol kinas（SmCMK）,丹参异戊烯焦磷酸异构酶（SmIPPI）的cDNA全长进行聚合酶链式反应（PCR）扩增、克隆测序以及生物信息学分析。结果 获得了8个产地及变型共23株丹参样品中3个功能基因SmAACT,SmCMK,SmIPPI的cDNA全长序列。通过对3个功能基因的SNP位点及氨基酸多态性序列分析,分别发现18,16和14个SNP位点。HPLC指纹图谱可以将8个产地的丹参聚为两大类,北京、湖北、山东白花、山西、河南、山东紫花样品聚为一支,河北与内蒙古样品聚为另一支,这也说明丹参成分变化趋势与地理距离关联不大,而变型及品种因素对质量差异的贡献率较高。结论 不同产地丹参具有明显的遗传分化趋势,并形成了各自的产地特异性基因型。通过探讨不同产地丹参药材特异性品质形成的分子机制,为保证临床用药的稳定有效奠定基础,同时为丹参优良品种选育提供指导。     

粘毛黄芩毛状根培养体系的建立及其黄芩苷的动态合成

目的：建立粘毛黄芩毛状根培养体系，并对其生长特性和次生代谢产物的合成进行初步探索。方法：采用卸甲型根癌农杆菌Agrobacterium tumofaciens C58C1感染粘毛黄芩无菌苗的茎段，获得毛状根，并得到了优质株系；测定了毛状根的生长曲线；利用PCR对毛状根进行T-DNA转化的检测及利用HPLC进行黄芩苷含量检测。结果：PCR检测结果表明，发根农杆菌Ri质粒的rolC基因已整合入粘毛黄芩毛状根基因组中。C58C1感染粘毛黄芩无菌苗茎段8 d后，毛状根陆续在其伤口处产生，28 d时幼茎产生毛状根的外植体达81%。1/2 MS液体培养32 d后毛状根干重增加了17.42倍，总黄酮和黄芩苷含量分别增加了21.60，25.56倍。结论：粘毛黄芩毛状根离体培养的建立为进一步进行药用活性成分的工业化生产奠定了基础。     

经典名方小承气汤物质基准的HPLC指纹图谱分析

目的 建立小承气汤物质基准的高效液相色谱法（HPLC）指纹图谱,结合化学模式识别方法对其质量进行分析与评价。方法 采用Diamonsil C₁₈色谱柱（4.6 mm×150 mm,5 μm）,流动相甲醇（A）-0.1%磷酸水溶液（B）梯度洗脱（0~60 min,20%~90%A;60~70 min,90%~100%A）,流速1 mL·min^-1,柱温25 ℃,检测波长254 nm。利用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”（2012版）软件对15批小承气汤物质基准的HPLC指纹图谱进行相似度评价,同时,采用聚类分析、主成分分析及正交偏最小二乘法-判别分析对指纹图谱数据进行分析,评价不同批次间小承气汤物质基准的质量差异,并找寻造成批间质量差异的主要化学成分。结果 建立了小承气汤物质基准的HPLC指纹图谱,确定了31个共有峰,并对各共有峰进行药材归属,通过与对照品比对指认了其中18个成分;15批小承气汤物质基准的HPLC指纹图谱与对照指纹图谱的相似度均>0.92;3种化学模式识别方法均可将样品分为两类;筛选出了包括大黄酸,大黄酚-8-O-β-D-葡萄糖苷,芦荟大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷,番泻苷A,大黄酚-1-O-β-D-葡萄糖苷,大黄酸-8-O-葡萄糖苷在内的9种主要差异成分。结论 建立的指纹图谱分析方法灵敏度高、稳定性强、数据准确可靠,基本体现了小承气汤物质基准的整体化学成分特征,可为该经典名方复方制剂的质量标准建立提供依据。     

桑白皮流浸膏质量标准研究

该研究通过对不同来源的桑白皮流浸膏进行薄层鉴别、含量测定及指纹图谱等研究,建立了合理可行的质量标准。薄层鉴别方法使用聚酰胺薄膜,以冰醋酸-水(1:3)为展开剂,在365 nm下检视。该方法专属性好,合格样品均含有与对照药材和对照品相同的显色斑点。建立了HPLC测定桑皮苷A含量的方法,色谱条件为:甲醇-水(25:75)为流动相;检测波长326 nm;标准曲线为Y=46.965X,r=0.999 6;线性范围4.6~228 mg·L^-1。14批样品中4批桑皮苷A的质量分数小于0.5 g·L^-1,其余样品质量分数均大于2.0 g·L^-1,建议将桑皮苷A的含量限量定为不少于1.5 g·L^-1。使用HPLC梯度洗脱,利用中药色谱指纹图谱相似度评价系统对桑白皮流浸膏的指纹图谱进行评价,发现各批样品之间相似度较低,且桑白皮药材的化学多样性是影响相似度的决定因素,工艺因素影响较小,因此暂不拟列入质量标准。     

不同产地九节木根HPLC指纹图谱研究＊

目的 建立九节木根的HPLC指纹图谱，综合比较不同产地的九节木根质量，为九节木根药材质量控制提供参考。方法 采用Kromasil C18 色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；以乙腈（A）-0.4%磷酸溶液（B）为流动相，梯度洗脱；检测波长为232 nm；流速为1 mL·min^-1；进样量为10 μL。利用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004A版）”计算相似度，SPSS21软件进行聚类分析和主成分分析，比较不同产地九节木根样品的指纹图谱。结果 建立九节木根的HPLC指纹图谱，确定了29个共有峰。10批九节木根指纹图谱与对照图谱的相似度为0.922-0.996，10批次样品聚为3类。结论 该研究建立的九节木根指纹图谱具有较高的重现性、稳定性及专属性，为九节木药材的质量控制和评价的依据。     

基于指纹图谱和多成分含量测定的丹参药材皮部和木部化学成分比较研究

目的 基于指纹图谱和多成分含量测定对丹参药材皮部和木部的化学成分进行分析与比较,阐明丹参药材不同部位活性成分的分布规律。方法 采用高效液相色谱法对不同批次的丹参皮部和木部样品进行分析,分别建立丹参皮部和木部指纹图谱;在此基础上,对丹参皮部和木部样品中的丹参素、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、二氢丹参酮I、隐丹参酮、丹参酮I和丹参酮II_A 8个活性成分进行含量测定,并结合聚类分析、主成分分析和正交偏最小二乘判别分析等化学计量学方法对丹参皮部和木部化学成分进行比较。结果 建立了丹参药材皮部和木部化学指纹图谱,共标定了10个共有峰;含量测定和化学计量学分析结果表明,丹参皮部和木部样品的化学成分存在差异,其中丹酚酸类成分差异不大,而丹参酮类成分差异较大,丹参皮部样品中丹参酮类成分明显高于丹参木部样品。结论 通过指纹图谱结合多成分含量测定方法,明确了丹参药材不同部位活性成分的分布差异,为丹参药材资源的开发和利用提供了科学依据。     

丹参水溶性成分HPLC指纹图谱与化学模式识别研究

采用HPLC法建立丹参水溶性成分指纹图谱测定方法,对10批丹参样品进行水溶性成分的HPLC测定,建立了丹参水溶性成分HPLC对照指纹图谱,并对各批样品进行相似度分析、聚类分析和主成分分析。指纹图谱测定方法操作简单,精密度、稳定性和重复性均良好,对照指纹图谱展现的各峰分离度较好,特征明显。各样品相对于对照指纹图谱的相似度>0.90,聚类分析和主成分分析结果基本一致,从化学成分的角度对样品质量做出了较为客观的评价,可为丹参的质量评价提供可靠的依据。     

紫锥菊毛状根诱导及离体培养

 目的 研究紫锥菊毛状根的诱导及活性成分的产生。方法 用发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）A4,R1601,1025感染紫锥菊外植体。结果 紫锥菊外植体被3种发根农杆菌感染后,外植体伤口处均能陆续分化生长出白色的毛状根。A4菌株的诱导效果明显好于其他2种菌株,A4对紫锥菊叶片的毛状根诱导率高达66.7%。紫锥菊毛状根的最佳诱导条件为：发根农杆菌A4,感染时间12 min,菌液A₆₀₀值 0.8,共培养温度24 ℃,共培养时间2 d,预培养时间2 d,培养基pH值6.0,此条件下紫锥菊毛状根的平均诱导率达到54%;对诱导出的毛状根进行PCR检测,证明其确为已转化的毛状根。检测得到紫锥菊毛状根中的多糖含量为15.54%,总酚的含量为2.491%。结论 本实验所建立的紫锥菊毛状根培养系统,为研究紫锥菊毛状根大量培养生产活性成分奠定了基础。     

白亮独活的HPLC指纹图谱

目的: 建立白亮独活的HPLC指纹图谱分析方法并测定药材中佛手柑内酯及欧前胡素含量,为该药材的质量评价提供参考。方法: 收集10批白亮独活样品,采用HPLC建立指纹图谱方法,流动相水-甲醇梯度洗脱,检测波长为302 nm。利用"中药色谱指纹图谱相似度评价系统"2004A版软件进行指纹图谱分析。结果: 10批白亮独活的HPLC指纹图谱相似度均>0.89,标定了11个共有峰。样品中佛手柑内酯、欧前胡素平均质量分数分别为0.117%和0.709%。结论: 该方法简单、重复性好,可用于白亮独活的品种鉴别和质量评价。     

基于HPLC指纹图谱与一测多评法联用的血府逐瘀片质量控制研究

目的 建立血府逐瘀片HPLC指纹图谱及其6种成分苦杏仁苷、芍药苷、柚皮苷、橙皮苷、阿魏酸、新橙皮苷的一测多评法（QAMS）,验证该方法在血府逐瘀片质量分析中应用的科学性与可行性。方法 采用中药指纹图谱软件（2012A版）软件对10批样品进行相似度分析。以苦杏仁苷为内参物,建立芍药苷、阿魏酸、柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷的相对校正因子（f_s/i）,并利用f_s/i计算血府逐瘀片样品中该6种成分的含量,同时采用外标法计算各成分的含量,并比较2种方法差异。结果 10批样品指纹图谱中共有24个峰,相似度均大于0.990。以苦杏仁苷为内参物建立的芍药苷、柚皮苷、橙皮苷、阿魏酸、新橙皮苷的f_s/i分别为1.169 6、0.172 0、0.363 3、0.141 3、0.259 2,QAMS与外标法得到的10批血府逐瘀片样品含量测定结果相对误差（RE）<3%,没有显著差异。结论 建立的指纹图谱和QAMS含量测定法稳定可控,简单易行,可用于血府逐瘀片的质量控制。     

乌拉尔甘草转鲨烯合成酶基因毛状根系研究

目的:为了研究甘草酸的合成调控途径及提高甘草酸合成水平.方法:将已克隆的乌拉尔甘草鲨烯合成酶基因(GuSQS1,GenBank登录号为:AM182329)通过发根农杆菌Agrobacterium rhizogenes A4的介导,转化甘草下胚轴并诱导毛状根的形成.建立的毛状根系经0.8 mg·L~(-1)的除草剂(PPT)抗性筛选、PCR和Southern blotting检测分析后,得到的转基因毛状根系经HPLC检测甘草酸(GA)含量.结果与结论:转基因毛状根中甘草酸的最高含量约为野生型毛状根的3.6倍.     

桑遗传转化体系的建立及槲皮素合成的研究

目的:建立桑的遗传转化体系,并对其毛状根生长特性和次生代谢产物槲皮素含量进行探索。方法:利用卸甲型根癌农杆菌Agrobacterium tumefaciensC58C1侵染桑的黄化无菌苗,建立毛状根的诱导与培养体系;优化毛状根的扩大培养条件并测定其生长曲线,对桑毛状根T-DNA转化结果进行PCR检测;利用RP-HPLC检测槲皮素的含量。结果:用C58C1侵染无菌苗外植体,侵染10 min、分别预培养、共培养2 d及添加质量浓度为100 mg.L-1的乙酰丁香酮(AS)可得最高转化率;PCR检测结果表明,发根农杆菌Ri质粒的rolB,rolC基因片段已整合入桑的毛状根基因组中;C58C1侵染桑黄化无菌苗茎段10 d后,茎段伤口处陆续产生毛状根,30 d后幼茎上产生毛状根的外植体达92%;在1/2MS+0.05 mg.L-1IBA液体培养基中培养50 d后,由HPLC检测结果表明,毛状根中槲皮素含量相比于原植株增加了8.5倍。结论:成功建立桑科毛状根诱导与离体培养体系,为其他木本植物毛状根培养的研究提供了参考,并进一步为槲皮素等药用活性成分的工业化生产奠定了基础。     

甘草Ri质粒转化及不同理化因子对甘草毛状根生长的影响

目的:研究甘草毛状根的诱导及外界因子对其生长的影响。方法:用发根农杆菌Agrobacterium rhizo-genesLBA9402和R1601感染甘草Glycyrrhiza uralensis外植体。结果:2种发根农杆菌均能诱导甘草产生毛状根,LBA9402比R1601表现出较强的对甘草的感染能力,下胚轴的转化率高于子叶。在WP培养基上毛状根生长最快。光照对毛状根生长有抑制作用。毛状根中5种黄酮类化合物的总量比愈伤组织中高1.5倍,其中甘草查耳酮含量是愈伤组织中的15.5倍。结论:本实验所建立的甘草毛状根培养系统,为研究甘草毛状根大量培养生产黄酮类化合物奠定了基础。     

杜仲毛状根培养条件优化及其桃叶珊瑚苷药用成分的研究

目的:诱导杜仲毛状根的发生及筛选优良毛状根系.方法:利用发根农杆菌C58C1诱导杜仲不同外植体产生毛状根,并利用HPLC测定桃叶珊瑚苷含量.结果:采用杜仲无菌苗胚轴经菌液浸染20 min,共培养3 d可得到最佳转化效果.液体培养的生长量优于固体培养,最有利于毛状根生物量和药用成分的积累,并筛选到桃叶珊瑚苷高产根系E_1.结论:可通过毛状根的培养来获得桃叶珊瑚苷药用成分.     

王不留行毛状根的诱导及培养

目的:利用4种发根农杆菌R15834,R1601,R1000,A4诱导药用植物王不留行产生毛状根,建立王不留行的毛状根培养体系。方法:采用共培养法研究不同外植体、菌株、外源激素、侵染时间、预培养时间和共培养时间对王不留行毛状根诱导率的影响。结果:用王不留行叶片作为外植体,外植体预培养60 h,共培养48 h,发根农杆菌R1601侵染10 min,培养基中添加0.1 mg.L-1吲哚丁酸(IBA)转化率最高。结论:王不留行毛状根诱导成功,为其遗传转化提供了依据。     

RiT-DNA对四倍体菘蓝的遗传转化及其植株再生

目的：建立一套利用发根农杆菌转化四倍体菘蓝的有效方法。方法：利用发根农杆菌R1601,ASTCC15834和A4感染四倍体菘蓝的子叶外植体诱导出毛状根,再将毛状根置于含不同激素的培养基上诱导再生植株。结果：3种农杆菌具有不同的诱导能力,毛状根在不含激素的MS固体培养基上快速生长并表现出典型的毛根性状：多分枝、多根毛且无向地性,经冠瘿碱分析证明确已被转化。毛状根在无激素的MS增养基中悬浮培养两周后其生物量增加近35倍,在含BA的MS固体培养基上不经愈伤组织阶段直接分化出不定芽,所有不定芽都可在生根培养基上生根长成再生植株。冠瘿碱检测表明Ri质粒的T-DNA部分已转化到再生植株基因组中。结论：发根农杆菌可以诱导四倍体菘蓝长出毛状根,经诱导出的毛状根具有再生完整植株的能力。     

甘草毛状根诱导培养及其黄酮含量检测的研究

 目的 探讨影响甘草毛状根的诱导培养的因素及其总黄酮含量。方法 利用发根农杆菌的遗传和液体培养技术,研究了甘草（Glycyrrhiza uralensis毛状根的诱导和离体培养及其黄酮的产生情况。结果 不同发根农杆菌中,A4菌株侵染效果最好,约96%的子叶节外植体产生毛状根;不同外植体中,子叶节的转化效果最高,毛状根产生只需3~4 d;在毛状根的液体培养过程中,接种量为0.3 g,培养容积为500 mL时生长速率最快,毛状根湿重增长41倍;毛状根能产生药用成分甘草黄酮,根系中最高黄酮含量高于商品甘草,达干重的2.042%,约为未转化植株根的4.3倍;毛状根中的黄酮还分泌到培养液中,最高量为每100 mL培养液1.36 mg。结论 较为系统地研究了甘草毛状根的诱导培养条件和总黄酮量,为今后规模培养甘草毛状根生产药用甘草黄酮提供了可能性。     

野葛毛状根的诱导及离体培养

目的; 野葛毛状根的诱导和无激素离体培养。 方法：用含超强毒性基因的发根农杆菌R1601与野葛离体叶片共培养。 结果：经感染的野葛叶片表面直接形成大量生长快、分枝多、负向地性的毛状根,毛状根离体培养具有抗卡那霉素特性和激素自给特征。 结论：建立了发根农杆菌诱导野葛毛状根的方法和野葛毛状根的离体培养系统。     

Transformation of Withania somnifera (L) Dunal by Agrobacterium rhizogenes: Infectivity and phytochemical studies

Three different strains of Agrobacterium rhizogenes, namely A₄, LBA 9402 and LBA 9360 were used for infection to induce hairy root formation in W. somnifera. Strain specificity of the bacterium and frequency of transformation events were analysed. Significant differences were observed between the transformation ability of the different strains of Agrobacterium. The best response in terms of transformation ability and growth of the hairy roots was obtained with A. rhizogenes strain A₄, followed by LBA 9402, whereas LBA 9360 strain failed to induce a transformation event. The production of withanolides with special reference to withaferin A was studied through HPLC in the A₄ induced hairy root lines and their respective media at different growth phases (i.e. 4, 10 and 24 weeks). The presence of withaferin A in the media as well as in the hairy roots of 10-week-old cultures highlights the importance of the present study for the commercial prospects of this plant.