丹参酮Ⅱ_A对TGF-β_1诱导的人皮肤成纤维细胞增殖的影响及作用机制

目的研究丹参酮Ⅱ_A(TSA)对TGF-β1诱导的人皮肤成纤维细胞(HSF)的影响及作用机制。方法采用CCK-8法测定不同浓度TSA(2.5、5、10、20μmol/L)干预TGF-β1诱导HSF细胞增殖的影响;采用平板克隆形成实验分别分析不同浓度TSA处理48 h后HSF细胞的克隆形成能力的变化;Western blotting检测HSF细胞中TGF-β1/Smad通路蛋白及α-SMA、VEGFA和COLI蛋白的表达水平。结果 CCK-8和平板克隆形成实验结果表明,TSA显著抑制了HSF细胞的增殖和克隆形成能力(P0.01);Westernblotting结果显示,TSA各浓度组能够显著抑制p-Smad2和p-Smad3蛋白水平,下调p-Smad2/Smad2的比值(P0.01)。5、10、20μmol/L TSA组明显下调p-Smad3/Smad3的比值;另外,HSF细胞中α-SMA、VEGFA和COLI蛋白表达水平随着TSA浓度的升高而显著降低(P0.01)。结论 TSA具有抑制HSF细胞增殖的能力,其作用机制可能与TGF-β1/Smad通路有关。     

温阳化浊通络方含药血清对系统性硬化病皮肤成纤维细胞TGF-β1/Smad 信号通路的影响

目的探讨温阳化浊通络方含药血清对系统性硬化病(systemic sclerosis,SSc)皮肤成纤维细胞TGF-β_1/Srnad信号通路的影响。方法将36例SSc患者按随机数字表分为中药组、西药组和中西药纽,每组12例,中药组予口服温阳化浊通络方汤剂(每日1剂),西药组予口服青霉胺片(每次0.125 g,每日2次)和醋酸泼尼松片(每次20 mg,每日1次),中西医组予口服青霉胺片、醋酸泼尼松片及温阳化浊通络方汤剂,治疗1个月制备含药血清;另取10例未治疗的SSc患者血清作为对照组。健康皮肤成纤维细胞来源于2例女性整形外科患者上臂外侧健康皮肤组织。各组血清分别加入SSc患者和健康皮肤成纤维细胞培养体系中。Western blot法测定皮肤成纤维细胞转化生长因子-β_1Ⅰ型受体(transforming growth factorβ_1 receptor typeⅠ,TGF-β_1 RⅠ)、TGF-β_1Ⅱ型受体(TGF-β_1 RⅡ)、p-Smad2/3及Smad7蛋白表达,RT-PCR法检测SSc皮肤成纤维细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原(Col-Ⅰ、Col-Ⅱ)mRNA的表达,E LISA法测定SSc皮肤成纤维细胞培养上清液中MMP-9及TIMP-1含量。结果与对照组比较,西药组、中药组和中西药组SSc患者和健康皮肤成纤维细胞TGF-β_1 RⅠ、p-Smad2/3蛋白水平降低,Smad7蛋白水平升高(P0.05,P0.01),同时中西药组TGF-β_1RⅡ蛋白表达降低(P0.05,P0.01);与西药组比较,中药组和中西药组TGF-β_1 RⅠ、p-Smad2/3表达降低,中西药组Smad7蛋白表达升高(P0.01)。SSc患者皮肤成纤维细胞中,与对照组比较,西药组、中药组和中西药组Col-Ⅰ、Col-ⅢmRNA表达水平降低(P0.05,P0.01),且中西药组Col-ⅢmRNA表达水平明显低于西药组(P0.01)。与对照组比较,西药组、中药组和中西药组MMP-9水平及MMP-g/TIMP-1比值明显升高(P0.05,P0.01),而中药组和中西药组TIMP-1表达水平降低(P0.01);与西药组比较,中西药组MMP-g水平和MMP-9/TIMP-1比值升高,中药组和中西药组TIMP-1水平降低(均P0.01)。结论温阳化浊通络方含药血清可能通过调控SSc皮肤成纤维细胞TGF-β_1/Smad信号通路中关键分子TGF-β_1 RⅠ、pSmad2/3及Smad7的表达,抑制rGF-β_1/Smad信号通路传导,减少Col-Ⅰ、Col-Ⅲ表达。     

半夏泻心汤人含药血清对HP感染GES-1细胞TGF-β/Smad信号通路的影响

目的:探讨半夏泻心汤人含药血清对幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,HP)感染人胃黏膜上皮GES-1细胞转化生长因子-β(TGF-β)/信号转导蛋白(Smad)信号通路的影响,以揭示该方治疗消化性溃疡可能的作用机制。方法:GES-1细胞分为空白组,HP感染模型组,健康人血清组,雷贝拉唑血清组,用药前血清组,10%半夏泻心汤血清组,20%半夏泻心汤血清组。除空白组外,其余各组均接种HP造成幽门螺杆菌感染模型,采用雷贝拉唑、半夏泻心汤含药血清及用药前、健康人血清进行干预,24 h后收集细胞及其上清液,噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞增殖情况;蛋白质免疫印迹法(Western blot)检测Smad2/3,Smad7,TGF-β1及磷酸化Smad2/3(p-Smad2/3),磷酸化Smad7(p-Smad7)蛋白的表达。结果:与空白组比较,HP可明显抑制GES-1细胞的增殖,降低GES-1细胞内Smad2/3,TGF-β1及p-Smad2/3蛋白表达,增加Smad7及p-Smad7蛋白表达(P0.05,P0.01);与HP感染模型组比较,雷贝拉唑血清组及10%,20%半夏泻心汤血清组可明显降低HP对GES-1细胞增殖的抑制,增加GES-1细胞内Smad2/3,TGF-β1,p-Smad2/3蛋白表达,并明显降低Smad7,p-Smad7蛋白表达(P0.05,P0.01);与用药前血清组比较,加入雷贝拉唑、半夏泻心汤含药血清后均可降低HP对GES-1细胞增殖的抑制,其中雷贝拉唑血清组及20%半夏泻心汤血清组可增加GES-1细胞内Smad2/3,TGF-β1,p-Smad2/3蛋白表达,降低Smad7,p-Smad7蛋白表达(P0.05,P0.01)。结论:半夏泻心汤能够减轻HP诱导GES-1细胞的损伤,促进GES-1细胞增殖,治疗HP相关性消化性溃疡,提高溃疡愈合质量,其机制可能与其调控TGF-β/Smad信号通路有关。     

钩藤碱固体脂质纳米粒对小鼠气道平滑肌细胞增殖及TGF-β1/Smad通路的影响

目的：观察钩藤碱固体脂质纳米粒（Rhy-SLN）对小鼠气道平滑肌细胞(ASMC)的增殖细胞核抗原（PCNA）表达以及TGF-β1/Smad信号通路的影响。方法：将小鼠ASMC体外分离培养,用Rhy-SLN干预ASMC,用免疫荧光法测定小鼠ASMC的PCNA的表达;Western Blotting法检测小鼠ASMC中Smad2、p-Smad2、Smad3、p-Smad3、Smad4、Smad7蛋白表达。结果：Rhy-SLN在一定程度上可以降低小鼠气道平滑肌细胞中PCNA的表达1.80±0.12比1.50±0.15（P<0.05),显著下调Smad2蛋白1.09±0.20、p-Smad2蛋白1.97±0.70、p-Smad3蛋白4.47±0.35、p-Smad4蛋白1.42±0.20相对表达(P<0.05),显著上调Smad7蛋白0.65±0.15相对表达(P<0.05),效果与通路阻滞剂SB431542组相似。结论：Rhy-SLN可以抑制小鼠ASMC的增殖,其机制可能与调节TGF-β1诱导的Smad信号通路有关。     

丹参酮ⅡA对血管紧张素Ⅱ诱导的大鼠心肌间质成纤维细胞α-平滑肌动蛋白表达的影响

目的研究丹参酮ⅡA(TanⅡA)对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的大鼠心肌间质成纤维细胞α-平滑肌动蛋白(SMA)表达的影响。方法体外培养大鼠心肌间质成纤维细胞,分为正常对照组、AngⅡ刺激组和TanⅡA干预组。免疫荧光法和Western免疫印迹法检测各组转分化肌成纤维细胞中标志蛋白α-平滑肌动蛋白(α-SMA)的表达。结果免疫荧光检测显示,细胞培养24 h后对照组胞浆中仅有少量α-SMA表达,而经AngⅡ作用后,α-SMA表达量明显增多。AngⅡ干预心肌间质成纤维细胞不同时间点,Western免疫印迹法显示α-SMA表达量逐渐增加。AngⅡ的这种诱导心肌间质成纤维细胞发生肌成纤维细胞转分化作用可被含TanⅡA的培养液所抑制,且呈剂量和时间依赖性。结论 TanⅡA能有效地抑制大鼠心肌间质成纤维细胞的转分化,此作用可能与其能下调AngⅡ诱导的α-SMA过表达有关。     

丹皮酚与三七总皂苷配伍应用对血管紧张素Ⅱ诱导增殖的心脏成纤维细胞Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白表达的影响

目的:探讨丹皮酚与三七总皂苷配伍应用对血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ,AngⅡ)诱导增殖的心脏成纤维细胞胶原合成的调节作用。方法:选取原代培养的乳鼠心脏成纤维细胞,随机分为6组,分别为空白组,模型组,丹皮酚(45 mg·L~(-1))组,三七总皂苷(50 mg·L~(-1))组,丹皮酚与三七总皂苷配伍的高、低剂量(丹皮酚45,30 mg·L~(-1)+三七总皂苷50,30 mg·L~(-1))组。药物干预48 h,采用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)法检测Ⅰ型胶原,Ⅲ型胶原的mRNA表达水平,蛋白质免疫印迹(Western blot)法检测各组细胞的Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原的蛋白表达水平。结果:与空白组比较,模型组Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原的mRNA及蛋白表达明显升高(P0.01);与模型组比较,AngⅡ可刺激心脏成纤维细胞(cardiac fibroblasts,CFs)的增殖,丹皮酚,三七总皂苷及其配伍的高、低剂量均可抑制Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原的mRNA及蛋白表达(P0.05),其中配伍组的抑制作用较优,且配伍高剂量作用时抑制效果更佳。结论:丹皮酚和三七总皂苷配伍组方可抑制血管紧张素Ⅱ诱导增殖的心脏成纤维细胞Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原蛋白的基因表达,显示明显的协同效应。     

丹参酮ⅡA对肝癌细胞MHCC97-H Smad3/Smad7蛋白及上皮间质转化的影响

目的:探讨丹参酮ⅡA对肝癌细胞MHCC97-H Smad3、Smad7蛋白及上皮间质转移标志蛋白Ecadherin/N-cadherin表达水平及侵袭转移能力的影响。方法:10μM丹参酮ⅡA处理MHCC97-H细胞,实时定量PCR检测细检测Smad3、Smad7和snail的m RNA表达;用不同浓度丹参酮ⅡA及10%小牛血清对照组培养肝癌细胞MHCC97-H,48 h后,Western blot检测Smad3、p-Smad3、Smad7、Snail、E-cadherin和N-cadherin蛋白表达水平。划痕法和Transwell小室检测肝癌细胞侵袭/迁移能力。结果:10μM丹参酮ⅡA处理MHCC97-H细胞,不同时间点检测Smad3、Smad7和snail的m RNA表达:结果显示,与0 h相比,48 h及72 h Smad7的表达量明显升高,差异有统计学意义(P0.05);Smad3及snail的差异无统计学意义。不同浓度丹参酮ⅡA处理MHCC97-H细胞48 h,Western blot检测Smad3、p-Smad3、Smad7、snail、E-cadherin、Ep CAm、N-cadherin和Vimentin蛋白表达:结果显示,与对照组相比,高浓度丹参酮ⅡA组(20μM)48 h的p-Smad3、Snail和N-cadherin、Vimentin明显降低,Smad7、E-cadherin和Ep CAM明显升高(P0.05)。中浓度丹参酮ⅡA组(10μM)48 h的Smad7、E-cadherin和Ep CAM升高;p-Smad3、snail、Ncadherin和Vimentin降低(P0.05)。低浓度丹参酮ⅡA组(5μM)48 h的E-cadherin升高,N-cadherin降低(P0.05);而Smad3、p-Smad3及snail的结果与对照组无明显差异(P0.05)。不同浓度的丹参酮ⅡA组和对照组(DMSO)Smad3的蛋白表达无影响。不同浓度的丹参酮ⅡA组均可以减少p-Smad3和增加E-cadherin的表达,且随着丹参酮ⅡA浓度增高p-Smad3的表达逐渐减少,E-cadherin的表达逐渐增加。划痕法结果显示,与对照组比较,24 h后中浓度和高浓度丹参酮ⅡA组肝癌细胞的划痕愈合较慢,差异均有统计学意义(P0.05);48 h后中浓度和高浓度丹参酮ⅡA组与对照组相比,肝癌细胞的划痕愈合明显减慢,差异有统计学意义(P0.01);且同等浓度丹参酮ⅡA组肝癌细胞的划痕愈合与24 h相比较,48 h肝癌细胞的划痕愈合减慢。transwell显示,与对照组相比,中浓度和高浓度丹参酮ⅡA处理细胞48 h可明显减少细胞的侵袭,差异有统计学意义(P0.05)。而低浓度丹参酮ⅡA无明显影响,差异无统计学意义。结论:丹参酮ⅡA能抑制肝癌细胞侵袭转移,可能与与抑制Smad3蛋白磷酸化、上调Smad7蛋白,并抑制上皮间质转化有关。     

丹参酮Ⅱ_A对AngⅡ诱导的心肌成纤维细胞增殖及Ⅰ型胶原合成的影响

目的:通过观察丹参酮ⅡA(TSN)对AngⅡ诱导的心肌成纤维细胞(CFs)增殖及Ⅰ型胶原合成的影响,探讨其抗心肌纤维化的作用机制。方法:差速贴壁法提取原代CFs,采用四氮唑盐(MTT)比色法测定细胞数目,ELISA法检测Ⅰ型胶原合成,RT-PCR法半定量检测Ⅰ胶原mRNA表达。结果:①AngⅡ组OD值高于空白对照组,两者比较有显著性差异(P<0.01);AngⅡ+TSN组OD值低于AngⅡ组,两者比较有显著性差异(P<0.01)。②AngⅡ组有促进心肌成纤维细胞分泌Ⅰ型胶原的作用,与空白对照组比较,有显著性差异(P<0.01);AngⅡ+TSN组Ⅰ型胶原含量低于AngⅡ组,两者比较,有显著性差异(P<0.01)。③AngⅡ组Ⅰ型胶原mRNA表达高于空白对照组,两者比较有显著性差异(P<0.05);AngⅡ+TSN组Ⅰ型胶原mRNA表达低于AngⅡ组,两者比较有显著性差异(P<0.05)。结论:AngⅡ可直接诱导CFs的增殖,促进其分泌Ⅰ型胶原,并能显著增加Ⅰ型胶原mRNA的表达;TSN对AngⅡ诱导的CFs增殖及Ⅰ型胶原分泌增加,及Ⅰ型胶原mRNA表达增强均有抑制作用。提示:TSN抗心肌纤维化作用的产生可能与丹参酮ⅡA抑制心脏局部的RAS系统有关。     

姜黄素对血管紧张素Ⅱ诱导新生大鼠心肌细胞肥大的保护作用

目的研究姜黄素(Cur)对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导新生大鼠心肌细胞肥大的保护作用并探讨其可能作用机制。方法 AngⅡ刺激新生大鼠心肌细胞,制备心肌细胞肥大模型,用Cur2.5×10-5mol/L进行预防性治疗。采用相差显微镜测量细胞大小及测定心肌细胞总蛋白含量作为心肌细胞肥大的指标;fura-3/AM孵育心肌细胞,利用荧光显微镜及Felix软件分析测定细胞内钙离子浓度((Ca2+)i);Western blot检测钙调神经磷酸酶(CaN)蛋白表达。结果 AngⅡ组细胞直径增大,总蛋白含量增加,与对照组相比有显著性差异(P均<0.01);Cur 2.5×10-5mol/L能够降低心肌细胞肥大程度(P<0.01)、(Ca2+)i(P<0.01)及CaN蛋白表达(P<0.05)。结论 Cur对AngⅡ诱导心肌细胞肥大有明显的保护作用,其机制可能与抑制Ca2+/CaN信号转导通路有关。     

丹皮酚联合三七总皂苷对AngⅡ诱导的心脏成纤维细胞增殖及TGF-β/Smads信号通路的影响

目的探讨丹皮酚联合三七总皂苷应用对血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ,AngⅡ)诱导新生大鼠的心脏成纤维细胞(cardiac fibroblasts,CFs)增殖及TGF-β/Smads信号通路的影响。方法采用胰酶消化法分离培养的CFs随机分为6组:正常对照组,模型组,三七总皂苷组,丹皮酚组,丹皮酚与三七总皂苷联合用药大、小剂量组。采用MTT比色法测定各组培养液中CFs增殖情况,免疫细胞化学法检测α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的蛋白表达水平,RTPCR法检测转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,Tgfb1)的mRNA表达水平,Western blot法检测TGF-β1、磷酸化的Smad2/3(p-Smad2/3)的蛋白表达水平。结果与正常对照组比较,模型组大鼠CFs增殖明显增高,Tgfb1的mRNA表达显著增加,α-SMA及TGF-β1、p-Smad2/3的蛋白表达显著增加;与模型组比较,丹皮酚组、三七总皂苷组、联合用药的大剂量和小剂量组均可抑制由AngⅡ诱导的CFs的增殖,Tgfb1的mRNA表达显著减少,α-SMA及TGF-β1、p-Smad2/3的蛋白表达显著减少;与丹皮酚组、三七总皂苷组比较,联合用药大、小剂量组在抑制CFs增殖的作用上显著增强,抑制Tgfb1的mRNA表达效果显著增强,抑制α-SMA及TGF-β1、p-Smad2/3的蛋白表达效果显著增强;与联合用药小剂量组比较,联合用药大剂量组对以上指标的抑制效果更佳,显示一定的剂量依赖性。结论丹皮酚与三七总皂苷联合应用对抑制CFs增殖,呈现明显的协同作用。其作用机制与抑制TGF-β/Smads信号通路的传导有关。     

姜黄素对血管紧张素Ⅱ诱导的乳鼠心肌细胞细胞外信号调节激酶表达的影响

目的从细胞外信号调节激酶1/2（ERK1/2）激活角度研究姜黄素（curcumin）对血管紧张素Ⅱ（angiotensinⅡ,AngⅡ）诱导的心肌肥大反应的作用。方法体外培养新生大鼠心肌细胞,分为AngⅡ组（10-6mol/L AngⅡ）、姜黄素组（10-6mol/L AngⅡ＋2.5×10-8g/L姜黄素）及对照组（正常培养的心肌细胞）。3组分别培养24h,收集心肌细胞,[3H]-亮氨酸掺入法测定心肌细胞蛋白合成速率,免疫印迹法测定ERK1/2表达。应用SPSS11.0软件进行统计学分析。结果①3组间心肌细胞蛋白合成速率比较有统计学意义（F=20.68,P〈0.01）,AngⅡ（10-6mol/L）处理24h,心肌细胞[3H]-亮氨酸掺入率明显增加,姜黄素能明显抑制AngⅡ介导心肌细胞[3H]-亮氨酸掺入率的增加;②AngⅡ（10-6mol/L）处理心肌细胞10min,磷酸化ERK1/2蛋白（p-ERK1/2）表达明显增加,预先以姜黄素2.5×10-8g/L处理心肌细胞30min,发现姜黄素可明显抑制AngⅡ诱导的心肌细胞磷酸化ERK1/2蛋白表达。结论姜黄素可抑制AngⅡ诱导的心肌细胞ERK1/2的表达,这可能是姜黄素治疗心肌肥厚的重要机制之一。     

强心通脉颗粒对慢性心衰大鼠心肌组织AngⅡ及TXB_2影响的实验研究

目的:研究强心通脉颗粒对慢性心衰大鼠心肌组织AngⅡ与血栓烷素B2(TXB2)的影响。方法:以结扎大鼠冠状动脉致其急性心肌梗死后,再进行饥饿及力竭式游泳造成大鼠慢性心衰模型。并在用药6周后,用彩色超声多普勒心动图测量大鼠的心功能,以免疫组化方法测定心肌组织中AngⅡ的含量并用ELESA法测定各组TXB2的数值。结果:大鼠模型组与正常对照组比较,心功能明显降低(P<0.01);AngⅡ、TXB2含量远远高于正常组(P<0.01);中药组和西药组AngⅡ、TXB2含量均低于模型组(P<0.01)。结论:强心通脉颗粒能抑制慢性心衰大鼠RAS系统的激活,降低血清中TXB2的水平,从而能改善慢性心衰大鼠的心功能,为慢性心衰防治及实验研究提供客观依据。     

丹参酸乙对大鼠心脏成纤维细胞增殖和c-fos基因表达的影响

目的探讨丹参酸乙(SA-B)对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)孵育的新生大鼠心脏成纤维细胞的影响。方法将培养的心脏成纤维细胞分组加药后,采用 Alamar blue 荧光分析法和逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)技术分别测定细胞增殖和 c-fos 基因的转录水平。结果 10μmol/L SA-B 和100μmol SA-B 可有效抑制由 AngⅡ引起的心脏成纤维细胞增殖(P<0.05)。1μmol/L SA-B 和10μmol/L SA-B 也可有效抑制 c-fos 基因 mRNA的表达(P<0.05)。结论一定浓度的丹参酸乙可抑制由 AngⅡ引起的心脏成纤维细胞的增殖和 c-fos 基因的表达水平。     

清眩降压汤对自发性高血压模型大鼠肾脏的保护作用

目的研究清眩降压汤对自发性高血压(SHR)大鼠血压的影响和肾脏保护作用。方法 40只SHR大鼠随机分为清眩降压汤高剂量组(5.372g/d)、低剂量组(1.7g/d),替米沙坦组(2.4mg/d)和模型组(予矿泉水),每组10只;另设10只Wistar大鼠为正常组(正常饲养);连续给药8周。给药前,单次给药2h、6h、12h、24h,给药3天、1周、4周、8周,分别检测各组大鼠收缩压和舒张压;最后一次检测血压后10%水合氯醛麻醉取血,酶联免疫法和放射免疫法检测大鼠血清中血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)和血管紧张素1-7(Ang1-7)的含量;HE染色观察大鼠肾脏组织的病理改变;免疫组织化学方法检测AngⅡ在肾脏的表达。结果清眩降压汤给药1次,各时间点大鼠血压未出现明显变化,替米沙坦组大鼠给药后2h收缩压、舒张压均明显下降(P<0.05);连续治疗8周后,未发现清眩降压汤高、低剂量组大鼠血压明显变化,替米沙坦组大鼠收缩压显著下降(P<0.05),而模型组大鼠收缩压升高显著(P<0.05或P<0.01),AngⅡ和Ang1-7在血压升高大鼠中较血压正常大鼠水平要低(P<0.05),各给药组大鼠肾脏肾小球和肾小管增生程度较模型组大鼠均得到明显抑制。结论清眩降压汤可以控制SHR收缩压的进一步升高,抑制由于血压升高导致的大鼠肾小球和肾小管增生,对SHR有潜在的肾脏保护作用。     

扶正祛风方通过TGF-β1/Smad信号通路抑制膜性肾病大鼠足细胞转分化的机制

目的:研究扶正祛风方对膜性肾病(MN)模型大鼠转化生长因子-β1(TGF-β1)/Smad信号通路及足细胞上皮间充质转化(EMT)的影响,探讨其保护足细胞的分子机制。方法:大鼠随机分为正常组和造模组,造模组经阳离子化牛血清白蛋白(C-BSA)诱导构建MN模型后分为模型组、氯沙坦钾组(0.05 g·kg^-1)及扶正祛风方高、中、低剂量(41,20.5,10.25 g·kg^-1)组,给药4周。给药0,2,4周检测24 h尿蛋白(24 h-Upro)水平;给药4周后检测尿素氮(BUN)及血肌酐(SCr)水平,肾组织经苏木素-伊红(HE),马松(Masson),过碘酸-六胺银(PASM)染色后光镜观察病理改变,透射电镜观察肾小球基底膜(GBM),足突改变;免疫组化(IHC)观察足细胞EMT标志物结蛋白(Desmin)的分布及表达强度;蛋白免疫印迹法(Western blot)及实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)分别检测肾组织TGF-β1,Smad2/3,磷酸化Smad2/3(p-Smad2/3),Smad7,Desmin mRNA及蛋白表达水平。结果:与正常组比较,模型组24 h-Upro,BUN,SCr水平显著升高(P<0.01),免疫复合物沉积升高,GBM增厚和足突融合明显,Desmin mRNA及蛋白表达显著升高(P<0.01),TGF-β1,Smad2,Smad3 mRNA及蛋白表达水平明显升高(P<0.05),Smad3 mRNA及蛋白表达水平明显降低(P<0.05,P<0.01);与模型组比较,扶正祛风方各组及氯沙坦钾组24 h-Upro,BUN水平降低(P<0.05),扶正祛风方中剂量组血SCr水平降低(P<0.05),扶正祛风方各组及氯沙坦钾组肾小球上皮下免疫复合物沉积减少,GBM增厚和足突融合减轻,扶正祛风方高、中剂量组和氯沙坦钾组Desmin在基底膜的表达强度降低;扶正祛风方中剂量组肾组织TGF-β1和p-Smad2/Smad2 mRNA及蛋白表达降低,Smad7 mRNA及蛋白表达升高(P<0.05),扶正祛风方高剂量组p-Smad3/Smad3 mRNA及蛋白表达降低(P<0.05),扶正祛风方高、中剂量组及氯沙坦钾组肾组织Desmin mRNA及蛋白表达降低(P<0.05)。结论:扶正祛风方可能通过抑制TGF-β1/Smad信号通路激活介导的足细胞EMT实现MN足细胞保护的作用。     

Fuzheng Huayu recipe and vitamin E reverse renal interstitial fibrosis through counteracting TGF-β1-induced epithelial-to-mesenchymal transition

Aim

To investigate the mechanism of action of Fuzheng Huayu recipe (FZHY) and vitamin E (Vit E) against renal interstitial fibrosis related to transforming growth factor-beta1 (TGF-β1) mediated tubular epithelial-to-mesenchymal transition.

Materials and methods

Renal interstitial fibrosis was induced by administration of HgCl₂ at a dose of 8 mg/kg body weight once a day for 9 weeks. Rats were randomly divided into four groups: normal, model, FZHY, and Vit E group. Rats in the latter two groups were treated with the FZHY recipe and Vit E respectively. HK-2 cells were treated with TGF-β1 for 24 h, followed by incubation with either SB-431542 (a potent and specific inhibitor of TβR-I kinase) or FZHY drug-containing serum for another 24 h. Hyp content in rat kidney tissue was assayed with Jamall's method and collagen deposition in kidney was visualized using Masson stain. Protein expression of TGF-β1, TβR-I, Smad2, p-Smad2, Smad3, and p-Smad3 was analyzed by Western blotting. Protein expression and the location of Smad3 in kidney was assayed by immunohistochemistry, E-cadherin, cytokeratin 18 (CK-18), α-SMA and TGF-β1 by immunofluorescent stain.

Results

FZHY and Vit E inhibited renal collagen deposition and reduced Hyp content significantly. They upregulated E-cadherin protein expression and down-regulated the protein expression of α-SMA, TGF-β1, p-Smad2, p-Smad3, and TβR-I. Lastly, they inhibited the nuclear translocation of Smad3 in fibrotic kidney tissue. FZHY drug-containing serum significantly upregulated the expression of CK-18 and down-regulated the expression of α-SMA, TβR-I, p-Smad2/3 in TGF-β1 stimulated HK-2 cells.

Conclusion

The mechanism of action of FZHY and Vit E against renal interstitial fibrosis is related to the reversal of tubular EMT induced by TGF-β1.     

二仙汤对去卵巢大鼠心功能和血压动态演变的干预作用

目的:探讨大鼠去卵巢后心功能、血压的演变规律及二仙汤对其的影响及机制。方法:选用健康10周龄雌性SPF级SD大鼠,随机分为假手术组、模型组、雌激素组(戊酸雌二醇,0.18 mg·kg^-1)、二仙汤组(7.5 g·kg^-1)。大鼠去卵巢后2周开始灌胃给药,1次/d,连续12周。二仙汤组及雌激素组分别给予二仙汤或戊酸雌二醇灌胃,假手术组和模型组灌胃等体积纯净水。给药4,8,12周末以无创超声心动图(UCG)及尾动脉检测技术、放免法检测心功能、血压(BP),血清雌二醇(E2)含量;给药12周末采用酶联免疫吸附测定(ELISA)检测血清内皮素-1(ET-1),血管紧张素2(AngⅡ)含量,苏木素-伊红(HE)染色、电镜技术、原位末端标记法(TUNEL)检测心肌形态学和凋亡情况。结果:与假手术组比较,给药4周末模型组射血分数(EF)减小、左室收缩末期容积(LVVols)增大(P<0.05),8周末各组心功能无显著差异,12周末模型组左室收缩末期内径(LVIDs),LVVols,左室舒张末期内径(LVIDd),左室舒张末期容积(LVVold)均显著增大(P<0.01),4,8,12周末模型组收缩压(SBP)增高(P<0.05),并呈不断升高趋势,舒张压(DBP)变化不明显,12周末模型组血清E2水平降低(P<0.05),ET-1,AngⅡ升高(P<0.01),心肌肌原纤维不规则、部分肌丝断裂,线粒体嵴紊乱、断裂或消失,细胞凋亡增多(P<0.01);与模型组比较,二仙汤组心肌收缩、舒张功能明显改善,血压降低;血清E2含量明显升高(P<0.05),血清ET-1含量明显降低(P<0.05),血清AngⅡ含量显著降低(P<0.01);心肌、线粒体形态结构改善,心肌细胞凋亡指数显著降低(P<0.01)。结论:大鼠去卵巢后出现心功能降低、血压增高等一系列病理改变,与心功能下降比较血压升高的变化出现更早,二仙汤通过调节E2,血液活性物质及心肌凋亡等途径发挥对去卵巢大鼠心功能、血压的干预作用。     

毛茛总苷对肾性高血压大鼠血压、NO、AngⅡ及A7r5细胞内钙的影响

目的:探讨毛茛总苷对肾性高血压大鼠的血压、血清一氧化氮(NO)、血浆和心肾组织中血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)以及血管平滑肌细胞内钙的影响。方法:采用二肾一夹(2K1C)肾性高血压大鼠模型,连续灌胃给药5 w,5w末测定血压,检测血清中一氧化氮、血浆和心、肾组织中AngⅡ含量;采用新一代Ca2+荧光探针Fluo-3/AM标记培养的血管平滑肌细胞内钙,荧光倒置显微镜观察荧光成像和荧光分光光度计测量细胞内钙荧光强度,观察毛茛总苷对大鼠血管平滑肌细胞内Ca2+水平的影响。结果:毛茛总苷高、中剂量能降低肾性高血压大鼠血压水平(P0.05),其各剂量均能显著的升高大鼠血清中NO含量(P0.01),但对大鼠体内的AngⅡ含量无显著影响;毛茛总苷各剂量均能降低由AngⅡ引起的细胞内钙离子浓度升高。结论:毛茛总苷能降低肾性高血压大鼠的血压,其降压作用可能与其能显著的升高大鼠NO水平及拮抗AngⅡ引起的血管平滑肌细胞内钙升高有关。     

息肿胶囊对心力衰竭大鼠RAS的影响

目的观察息肿胶囊对心力衰竭大鼠心功能的影响。方法80只大鼠随机分为正常对照组10只,余70只随机分为模型组、双氢克尿噻组10 mg/(kg.d)组、息肿胶囊3.75 g/(kg.d)组、息肿胶囊7.5 g/(kg.d)组、息肿胶囊15 g/(kg.d)组。正常对照组和模型组给予生理盐水10 mL/k g,其余各组腹腔注射盐酸阿霉素15 mg/kg,每周一、四和周日各给药1次,2周内注射完毕。各组在造模的同时给予治疗药物,每天给药1次,连续用药14 d。给药结束后次日,用放射免疫法测定血浆中AngⅠ、AngⅡ和ALD的含量。结果模型组血浆中AngⅠ、AngⅡ和ALD浓度明显升高,与对照组比较有极显著性差异(P均<0.01)。双氢克尿噻组与息肿胶囊组均能降低由阿霉素所致的血浆中AngⅠ、AngⅡ和ALD的浓度,与模型组比较有显著性差异(P<0.05),特别是息肿胶囊高剂量组血浆AngⅠ、AngⅡ含量与模型组比较有极显著性差异(P均<0.01)。结论息肿胶囊能降低由阿霉素所致心力衰竭大鼠血浆中AngI、AngII和ALD的浓度,为其抗充血性心力衰竭的机制之一。     

人参强心滴丸对慢性心衰大鼠AngⅡ及其受体信号PKC的影响

目的:观察人参强心滴丸对慢性心衰大鼠血浆AngⅡ含量与心肌组织AngⅡ受体AT1 mRNA、PKC表达的影响,揭示人参强心滴丸治疗慢性心衰的作用机制。方法:采用腹主动脉缩窄法复制慢性心衰大鼠模型,随机分为假手术组、模型组、阳性药对照组和人参强心滴丸高、低剂量组。检测大鼠血浆AngⅡ的含量和心肌组织PKC以及AT1 mRNA的表达变化。结果:模型组大鼠血浆AngⅡ含量明显增加,心肌组织中AT1 mRNA和PKC的表达明显增多;给药后,各治疗组大鼠AngⅡ的含量明显减少,AT1 mRNA和PKC的表达明显降低。结论:人参强心滴丸能降低AngⅡ的含量,抑制AT1 mRNA和PKC的表达,可能是其治疗慢性心衰的分子机制之一。