噎膈证方对人表皮生长因子刺激的食管癌EC9706细胞生长信号转导的影响

目的:研究噎膈病辨证施方在不同浓度下对食管癌细胞生长的影响;从生长信号转导角度探讨启膈散等对人表皮生长因子(hEGF)刺激的食管癌EC9706细胞生长抑制机理。方法:体外培养人表皮生长因子(hEGF)刺激的EC9706食管鳞癌细胞株,分别加入启膈散等4方提取液,通过MTT染色、流式细胞技术等观察细胞增殖变化;以western blot法检测PLC-γ1介导的生长信号通路蛋白表达。结果:启膈散(Q)、沙参麦冬汤(S)、通幽汤(T)IC50值分别为849,1004,1 615μg.mL-1;可抑制PLC-γ1信号通路相关蛋白表达,抑制作用强度:TQS;结论:除补气运脾汤外,噎膈证方可抑制hEGF刺激的EC9706细胞的生长;启膈散等3方可通过抑制PLC-γ1介导的生长信号转导而抑制EC9706细胞生长。     

启膈散及其拆方抑制人食管癌细胞裸鼠移植瘤作用的机理研究

为了进一步研究启膈散及其拆方在体内的作用，我们运用裸鼠荷瘤动物模型，对启膈散及其拆方抑制肿瘤生长的作用及PLC—γ1蛋白表达进行了观     

核桃仁醇提物抑制癌细胞生长相关蛋白表达的作用

目的：探讨核桃仁醇提物抑制癌细胞生长的分子机制。方法：体外培养骨肉瘤、乳腺癌、卵巢癌和肺癌细胞,用抑制癌细胞生长的IC50药物浓度处理细胞,用免疫印迹方法检测与癌细胞生长相关的蛋白表达。结果：核桃仁提取物对癌细胞中表皮生长因子受体（EGFR）、磷脂酶C-γ1（PLC-γ1）、蛋白激酶Cα（PKCα）蛋白表达有明显抑制作用,其作用强弱依次为骨肉瘤、乳腺癌、卵巢癌、肺癌细胞。结论：核桃仁醇提物抑制癌细胞EGFR→PLC-γ1→PKCα的生长信号传导是其抑制癌细胞生长的重要机制。     

启膈散对食管癌细胞微丝骨架重排的影响

目的研究启膈散对食管癌细胞微丝骨架的影响,并探讨其抑制转移的机制。方法采用高分化人食管癌细胞TE1、Eca109及低分化人食管癌细胞TE13,将细胞分为对照组(未加药)及启膈散(100μg/mL)组。应用免疫荧光法观察各组食管癌细胞形态的变化,激光共聚焦显微镜观察启膈散对食管癌细胞微丝排列的影响。采用细胞阻抗检测技术检测启膈散对食管癌细胞同基质黏附力及细胞迁移能力的影响。结果启膈散组食管癌细胞TE1、TE13及Eca109中微丝排列更规则,伪足消失,对照组细胞中微丝排列混乱,且以细胞膜微丝排列不规则更为明显,在细胞膜上微丝排列缺乏同向性,向外伸出伪足。与对照组比较,启膈散组食管癌细胞TE1和TE13中形态规则的细胞数目明显增多(P0.05),TE1与TE13细胞经启膈散作用后细胞与基质的黏附力及迁移能力均明显降低(P0.05,P0.01)。结论启膈散能够抑制食管癌细胞发生微丝骨架重排,使食管癌细胞同基质之间的黏附力降低,从而抑制细胞的迁移。     

基于网络药理学探讨启膈散治疗食管癌的作用机制

目的:基于网络药理学方法探讨启膈散治疗食管癌的可能作用机制。方法:在中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP)及中药成分数据库(TCMID)筛选并收集启膈散的活性成分及其对应靶标。利用Uniprot数据库获取药物活性成分对应靶标的基因,并与通过人类基因组注释数据库(GeneCards)所获得的人食管癌相关基因做对比,获得启膈散与食管癌重合的潜在作用靶标基因。使用Cytoscape3.6.1软件绘制启膈散的"活性成分-作用靶标"网络图。通过String数据库获取潜在作用靶标之间的互作关系,并导入Cytoscape3.6.1软件构建靶蛋白互相作用网络图。利用DAVID数据库对启膈散治疗食管癌的潜在作用靶标进行Go分类富集分析和KEGG通路富集分析,并运行R语言得到其高级气泡图。结果:从启膈散中共得到88个候选活性成分,包括槲皮素(quercetin)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)、木犀草素(luteolin)、丹参酮ⅡA(tanshinone iia)、柚皮素(naringenin)等,142个潜在作用靶标,包括RAC-α丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(AKT1)、肿瘤抑制因子(TP53)、白细胞介素-6(IL-6)、重组人半胱天冬酶-3(CASP3)、血管内皮生长因子A(VEGFA)等,主要通路有蛋白酪氨酸激酶/信号转导转录激活因子(Jak-STAT)、磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(PI3K-Akt)、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)、核转录因子(NF-kappa B)、肿瘤抑制基因p53等信号通路。结论:启膈散治疗食管癌的作用机制可能与AKT1、TP53、IL-6、CASP3、VEGFA等靶标以及调节Jak-STAT、PI3K-Akt、MAPK、NF-kappa B、p53等信号通路有关。     

启膈散对食管癌EC9706细胞miR-133a/PI3K/Akt信号通路甲基化的影响

目的 观察启膈散乙酸乙酯提取物对食管癌EC9706细胞micoRNA-133a(miR-133a)/磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信号通路甲基化的干预作用。方法 流式细胞术检测启膈散对EC9706细胞的凋亡的影响；蛋白印迹免疫法(Westernblotting)分别检测采用Akt抑制剂、转染miR-133a模拟物及DNMT1抑制剂后启膈散对DNMT1蛋白表达的影响；实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测启膈散对miR-133a及IGF-1R mRNA表达量的影响。结果 与空白对照组比较，启膈散组可增加EC9706晚期凋亡率及总凋亡率(P<0.05),与DNMT1抑制剂组相比，启膈散组、联合用药低剂量组晚期凋亡率差异显著(P<0.05)。与空白对照组比较，启膈散及各联合用药组均能够抑制食管癌EC9706细胞DNMT1蛋白的表达(P<0.05);启膈散与PI3K/AKT信号通路抑制剂联合用药组、启膈散与转染miR-133a模拟物联合用药组均对DNMT1蛋白的抑制呈现一定程度的的协同增效作用。与空白对照组相比，启膈散组、DNMT...     

启膈散对食管癌EC9706细胞株抑制树突状细胞成熟的影响

目的观察启膈散对食管癌细胞干预树突状细胞成熟的影响。方法制备条件培养基,用Fieoll密度梯度离心法分离外周血单个核细胞,体外诱导培养树突状细胞(Dendritic Cells,DCs),流式细胞术检测DCs表面标志物,MTT法检测淋巴细胞细胞增殖;LDH释放法检测细胞毒T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)杀伤力;ELISA检测细胞因子分泌,Western blot检测STAT3蛋白表达。结果食管癌EC9706细胞条件培养基可以减少外周血单核细胞诱导的树突状细胞表达CD80、CD86、CD1a,抑制DCs刺激淋巴细胞增殖和减弱CTL的杀伤力,减少IL~(-1)2分泌,增加STAT3蛋白表达和磷酸化;与肿瘤条件培养基相比,启膈散条件培养基组DCs CD80、CD86、CD1a增加,淋巴细胞的增殖能力、CTL杀伤作用增强,IL~(-1)2分泌增加,STAT3蛋白表达和磷酸化减少。结论启膈散可以通过STAT3信号通路减弱食管癌细胞上清对树突状细胞成熟的影响。     

补肾益髓方及其拆方对星形胶质细胞胶质瘢痕中GFAP与CSPGs表达的影响

目的观察补肾益髓方及其拆方补肾方与化痰活血方对星形胶质细胞损伤后细胞活性的影响及胶质瘢痕中胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、硫酸软骨素糖蛋白(CSPGs)表达的影响。方法体外原代培养星形胶质细胞,划痕法建立胶质瘢痕模型,分别加入补肾益髓方、补肾方和化痰活血方含药血清,继续培养24 h后,用CCK-8法测定细胞存活率,高内涵法测定GFAP与CSPGs蛋白的表达。结果与正常对照组比较,模型组细胞存活率明显下降(P0.01),GFAP与CSPGs蛋白显著上调(P0.01)。与模型组相比,补肾益髓方、补肾方及化痰活血方含药血清均能够促进星形胶质细胞细胞存活率(P0.01);均能够下调CSPGs蛋白的表达(P0.01或P0.05)。补肾益髓方及补肾方升高细胞存活率优于化痰活血方(P0.05或P0.01);降低CSPGs蛋白的表达方面补肾益髓方优于化痰活血方(P0.05)。结论补肾益髓方及其拆方均能够抑制损伤后星形胶质细胞胶质瘢痕中CSPGs蛋白的表达,以促进轴突的修复与再生,以补肾益髓方效果最佳。     

启膈散对小鼠单核巨噬细胞功能的影响

目的探讨启膈散治疗食管癌作用机制。方法 100只小鼠随机分为10组,启膈散1、2、3、4、5、6、7组各10只,刀豆素A（ConA）组10只,脂多糖（LPS）组10只,磷酸缓冲液（PBS）组10只。四甲基偶氮唑盐（MTT）法、L929细胞毒生物法检测各组小鼠单核巨噬细胞代谢、吞噬功能及分泌肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的功能。结果启膈散各组在促进小鼠单核巨噬细胞增殖、增强单核巨噬细胞吞噬功能及分泌TNF-α的功能方面与ConA组、LPS组比较差异均有统计学意义（P〈0.05）,启膈散组优于ConA组和LPS组,且存在明显量效关系。结论启膈散可通过促进小鼠单核巨噬细胞增殖、增强单核巨噬细胞吞噬功能及分泌TNF-α的功能从而达到抑制肿瘤生长的作用。     

启膈散通过STAT3信号通路抑制EC-9706细胞移植瘤的生长

目的:研究启膈散对食管癌EC-9706细胞移植瘤抑制作用,并从STAT3信号通路探讨其机理。方法:收集对数期生长的EC-9706细胞,皮下注射于裸鼠右前腋下,8 d后,随机分为模型组、抑制剂组、启膈散组、抑制剂+启膈散组,每2 d测量大小,3周后处死,摘取移植瘤,称重;移植瘤组织H.E染色显微镜下观察一般病理;免疫组化检测移植瘤微血管;Western blot检测移植瘤中蛋白表达。结果:在种植肿瘤第7天,可见有粟米粒大小肿瘤产生;在种植肿瘤第14天,模型组肿瘤大小增速快于用药各组,抑制剂组、启膈散组、启膈散+抑制剂组肿瘤成长相近。与模型组比较,用药组移植瘤的重量明显变轻(P0.05)。镜下可见各组肿瘤细胞大小形态不一,异型性明显,有病理性核分裂像,部分肿瘤区域中出现肿瘤组织坏死,并有少部分淋巴细胞浸润,用药组肿瘤组织坏死区增大。与模型组相比,用药各组CD34表达面积明显下降(P0.05)。与模型组比,除启膈散+抑制剂组的STAT3下降不明显外,其它均下降明显(P0.05);与抑制剂组相比,仅启膈散和启膈散+抑制剂组的STAT3蛋白表达增高(P0.05)。结论:启膈散能有效抑制移植瘤的生长,其机制可能与抑制STAT3信号通路有关。