F型、H型居群的铁皮石斛rDNAITS区序列差异及SNP现象的研究

目的 :研究铁皮石斛主产区F型和H型居群rDNAITS碱基序列的差异。方法 :运用PCR直接测序法对广西、贵州、云南铁皮石斛主要居群的rDNAITS区 (包括ITS1,5 .8SrDNA ,ITS2 )碱基序列进行了序列测定。结果 :在铁皮石斛各居群中 ,F型居群与H型居群植株的rDNAITS区碱基序列有 2个位点差异 ,且变异分别发生在ITS1区及 5.8S区内。研究表明 :铁皮石斛居群内部rDNAITS区的差异与植物生活型的差异呈一定的相关性 ,H型居群的铁皮石斛是F型的变种。在F型与H型居群间 ,其 5.8SrDNA区存在单核苷酸多态 (SNP)现象。首次报道了铁皮石斛ITS区的碱基序列 ,ITS区总长度为 634bp ,其中ITS1为 231bp ,5.8S为 163bp ,ITS2为 240bp。结论 :rDNAITS区碱基序列的比较分析进一步证明铁皮石斛F型居群与H型居群间具有显著的差异性。     

基于ITS序列分析铁皮石斛与近缘类群的亲缘关系

目的:采用分子系统学方法分析铁皮石斛及其近缘种的遗传多样性,为准确进行基源鉴定、阐明属内的种间关系提供分子证据。方法:采集25种40个石斛样品分离提取DNA,PCR扩增ITS区及5.8S rDNA完整序列并测序,用Mega3.1软件进行分子遗传进化分析。采用邻接法和最大简约法分析铁皮石斛亲缘关系构造系统树。结果:对25种石斛类植物的ITS区序列进行分析,两种方法得到的系统树基本一致。ITS序列在石斛种间存在极其显著的差异,铁皮石斛与其它各种石斛均有各自特异性的序列位点。结论:ITS序列作为石斛属植物种间的分子鉴定标记是可行的。     

基于ITS序列的中国药用石斛及其混伪品的分子鉴定

目的:通过测定17种药用石斛的rDNA ITS全序列,构建分子系统树,在分子水平对待检种进行鉴别,为石斛的分子鉴定提供依据.方法:采用改良的CTAB法提取石斛叶片DNA,PCR扩增rDNA ITS区全序列,产物回收纯化后直接测序,运用Bioedit,MEGA 4.0等软件分析石斛属植物的rDNA ITS序列的特征.结果:建立了17种药用石斛rDNA ITS区碱基全序列数据库,其中,ITSl的长度为228～234 bp,GC量为45.7%～53.0%,变异位点167个,占总位点67.34%,信息位点106个,占总位点42.74%;ITS2长度为241～247 bp,GC量为44.8%～55.7%,变异位点165个,占总位点66.27%,信息位点115个,占总位点46.18%.属间的遗传距离为0.295,石斛种间的平均遗传距离为0.142,种内各居群间的平均遗传距离为0.002.结论:利用17种石斛的全序列数据库及遗传分析软件,通过对待检种rDNA ITS区进行序列测定,可以在分子水平对石斛不同种质进行鉴别,为石斛的分子鉴定提供依据.     

基于ITS序列鉴别石斛类药材

获得高质量的DNA是中药石斛分子鉴别的关键所在。研究比较DNA提取方法(试剂盒提取、CTAB法),从石斛类药材中提取可用于PCR扩增的基因组DNA,基于ITS序列分析进行药材基原鉴别。结果表明,采用改良CTAB法(大量提取),从22批石斛类药材中富集并提取到基因组DNA,通过克隆测序获得ITS序列,同研究积累的石斛属植物ITS序列资料与Genbank序列数据库进行比对分析,根据序列相似性程度从12批黄草药材中鉴定石斛14种,近似种5种;从10批枫斗中鉴定石斛6种,近似种3种。该方法弥补了传统生药学鉴定方法在石斛类药材鉴别上的局限性,具有一定的应用前景。     

不同产地菊苣的ITS序列分析及模式识别研究

目的 通过分析不同产地菊苣Cichorium intybus和毛菊苣C.glandulosum核糖体基因内部转录间隔区(ribosomal DNA internal transcribed spacer,rDNA-ITS)序列,为菊苣药材鉴定和品种鉴别提供DNA分子标记.方法 采用广谱植物基因组DNA快速提取试剂盒提取14个产地的菊苣和毛菊苣样本的总DNA,利用ITS序列扩增通用引物PCR扩增rDNA-ITS序列并测序.运用DNAMAN V6软件比较两品种菊苣样品ITS序列的差异.所有样品ITS序列上的差异碱基经数学处理后使用SPSS 17.0软件对其进行聚类分析.结果 菊苣ITS序列种内相似度基本上在99.2％以上,毛菊苣ITS序列种内相似度在99.8％以上,而两品种间ITS序列相似度在99.2％以下.两品种菊苣的ITS序列上分别有多个特异性信息位点.聚类分析实现了两品种菊苣ITS序列差异的识别.结论 rDNA-ITS序列是菊苣和毛菊苣药材鉴定和品种鉴别的有效分子标记.     

3种石斛药材氢核磁共振谱特征图谱的研究

目的建立3种石斛药材的氢核磁共振谱(1HNMR)特征图谱。方法首先采用溶剂萃取法或硅胶色谱分离法获得3种石斛(束花石斛D.chrysanthum Wall.,铁皮石斛D.candidum Wall.ex Lindl和金钗石斛D.nobile Lindl.)的特征提取物及其主要成分,然后利用FT-1HNMR(300MHz)技术测定得1HNMR特征图谱并对特征信号进行归属。结果束花石斛、金钗石斛的SCE-B和铁皮石斛的SCEA特征提取物的1HNMR特征图谱可作为该药材基源鉴定的相对标准图谱。结论建立的1HNMR特征图谱方法在鉴别中药石斛上具有指导意义。     

牛膝的rDNAITS序列分析

目的 探讨不同产地牛膝的ITS的序列变异，为鉴别牛膝提供DNA分子标记。方法 利用特异性PCR技术对牛膝的rDNA ITS区碱基序列进行测定，报道了牛膝的rDNA ITS区的碱基序列。结果 得到核糖体DNA中的ITS及5．8S rDNA完全序列，18S和26S rDNA部分序列，共约650bp。牛膝与川牛膝及土牛膝碱基序列有明显差异，不同产地、不同栽培品种牛膝碱基序列无差异。结论 此法可用于牛膝种间及真伪品鉴别。     

石斛属RAPD分析及鉴定铁皮石斛的特异性引物设计

目的 :对石斛属植物亲缘关系进行分析 ,并设计一对能方便准确地鉴别铁皮石斛的特异性引物。方法 :用随机扩增多态性DNA(RAPD)技术对石斛属内 26个种和金石斛属的1个种进行了基因组DNA多态性分析 ,并构建聚类树状图。根据筛选到的DNA片段序列 ,将Sangon18引物从 3’端延长至 20bp ,得到所要的特异性引物。结果和结论 :设计成的特异性引物能方便快捷地鉴别出铁皮石斛。此技术为药材的分子鉴定提供了一个新思路。     

基于rDNA-ITS序列及相似度分析的中药赤芍分子鉴别研究

目的:分析中药赤芍正品及混伪品ITS序列的种内相似度及特定位点序列碱基差异,为建立中药赤芍的分子鉴别标准提供思路。方法:采用PCR扩增产物直接测序的方法对市场上购得的未知来源赤芍样品S1、S2的ITS序列(包括ITS1,ITS2,5.8S)进行测定,测定结果进行BLAST比对、相似度分析、序列特异性碱基位点差异比较;用DNAMAN对GenBank上已注册的正品赤芍和混伪品赤芍的ITS序列进行分析。结果:建立了赤芍药材分子鉴别的3个指标,即根据BLAST结果定属,种内相似度缩小属内范围并定种,再通过特异性碱基位点差异最终确定并证实样品的物种;确定了样品S1来源于芍药属植物芍药Paeonia lactiflora Pall.,样品S2来源于芍药属植物川赤芍Paeonia veitchii Lynch.。结论:本文为赤芍的分子鉴别提供较为有效的思路与方法,同时为基于rDNA-ITS相似度及序列分析进行其他中药品种鉴别提供依据。     

金钗石斛的位点特异性PCR鉴别研究

目的建立一种简便、实用的金钗石斛的DNA分子鉴别方法。方法根据金钗石斛及其他黄草类、枫斗类石斛的rDNA ITS序列数据库,寻找金钗石斛特异性的序列位点,设计专用于金钗石斛鉴别的PCR引物,用该引物在不同条件下扩增石斛属植物的模板DNA,建立只有金钗石斛具有阳性扩增的PCR鉴别条件。结果在66℃、40 s的复性条件下进行鉴别PCR,金钗石斛的模板DNA扩增出约300 bp的阳性扩增带,而其他39种石斛的模板DNA在同样条件下无扩增产物。结论运用位点特异性PCR能有效地从其他石斛属植物中鉴别出金钗石斛,该方法具有高效、准确、简便、省时的特点,应用前景广泛。     

中药南五味子及其混淆品绿叶五味子果实的ITS序列分析

目的 :比较研究不同产地南五味子的基源植物华中五味子及混淆品绿叶五味子的rDNAITS碱基序列的差异及其规律 ,寻找南五味子和绿叶五味子果实之间的分子鉴别方法。方法 :PCR直接测序 ,PAUP 4.0b10软件进行对位排列分析 ,采用邻接法 (neighbor joiningmethod)构建邻接 (NJ )系统树。 结果 :华中五味子ITS长度范围为 691～692bp ,ITS1和ITS2分别为 282bp和 246～247bp ;绿叶五味子ITS长度范围为 694～695bp ,ITS1和ITS2分别为 285～286bp和 246～247bp。不同产地华中五味子与绿叶五味子在ITS1有 3个稳定的信息位点。NJ树中 ,产于鸡公山 3个居群的绿叶五味子和天目山的1个居群及引用的 2条绿叶五味子ITS序列聚为一支 ,bootstrap支持率为 68%。 结论 :rDNAITS序列可作为中药南五味子与混淆品绿叶五味子的一种良好的分子标记。     

基于ITS2的竹节参及其近缘物种和混伪品鉴定评估

目的对竹节参及其近缘物种和混伪品进行分子鉴定,为竹节参现代化鉴定提供科学依据和保证临床疗效与用药准确性。方法对竹节参样品进行ITS2基因片段扩增和正向测序,并从Gen Bank数据库下载竹节参、近缘物种和混伪品的ITS2序列,通过ITS2 database剪切最终共获得24个物种102条序列,使用DAMBE软件进行序列替代饱和度检测,利用MEGA 6.06软件进行比对、分析变异位点、计算GC含量、种内和种间遗传距离、构建NJ系统发育树,并预测ITS2二级结构。结果竹节参ITS2序列长度均为230 bp,平均GC含量63.7%,ITS2序列平均遗传距离分析、NJ树、二级结构特征均显示竹节参与非同属混伪品和部分近缘物种(屏边三七、假人参、三叶参、野三七和越南人参)存在极大差异,能有效区分,而鉴定近缘物种西洋参、人参、三七、珠子参、羽叶三七、Panax assamicus、Panax variabilis和狭叶竹节参序列分辨率较低,具有一定局限性。结论 ITS2序列可作为鉴定竹节参与其非同属混伪品DNA条形码之一,对非同属混伪品鉴定分辨率极高,而对于鉴定其近缘物种的通用性仍有待考证,这为后续竹节参及其近缘物种种间遗传关系和亲缘关系鉴定、非同属混伪品鉴别区分和临床安全用药提供重要参考。     

一种钩藤属植物的分子鉴定

目的:以核糖体转录间隔区(rDNA ITS)序列为分子标记,对1种钩藤属植物归类到种提供分子证据.方法:改良CTAB法提取钩藤植物材料总DNA,通过引物对rDNA ITS区序列进行PCR扩增,经过克隆、测序后,与GenBank中已有的钩藤属植物rDNA ITS区序列进行比对,并应用Clustal X,BioEdit等软件计算分析,用PAUP软件构建系统发育树.结果:测序得到该钩膝植物的rDNA ITS区序列长度为719bp,序列分析结果显示该钩藤植物与Genbank中已有的华钩藤Uncaria sinensis rDNA ITS区序列之间相似性达99.7%,并且在系统发育树中并排聚类成一支.结论:基于rDNA ITS区序列的测序分析和系统发育树构建的分子生物学方法,能够对该钩藤属植物进行准确的分子鉴定,为钩藤属中药材的种类鉴定和种间的分类地位提供分子生物学理论依据.     

乌头霜霉病病原菌rDNA-ITS和28S rDNA D1/D2区序列分析

目的明确四川江油地区栽培乌头霜霉病病原菌乌头霜霉Peronospora aconiti rDNA-ITS和28 S rDNA D1/D2区序列,为病害诊断和防治提供理论基础。方法从病株收集病原菌分生孢子及菌丝,提取DNA,扩增rDNA-ITS和28 S rDNA D1/D2片段序列,进行测序分析,并构建邻接(neighbor-joining,NJ)发育树分析病原菌种类。结果检测出的病原菌rDNA-ITS序列与NCBI数据库中霜霉属P.pulveracea、P.aparines相似度为94%,28 S rDNA D1/D2区序列与霜霉属P.pulveracea、P.ficariae、P.bulbocapni相似度达97%。结论分子rDNA-ITS和28 S rDNA D1/D2区序列鉴定的结论和形态学鉴定的结论一致,乌头霜霉病病原菌为霜霉科霜霉属乌头霜霉Peronospora aconiti Yu,其rDNA-ITS和28 S rDNA D1/D2区序列可用于该病原物的鉴定。     

基于ITS2序列的茅苍术及其近缘种DNA分子鉴定

目的 应用ITS2条形码鉴定茅苍术Atractylodes lancea及其近缘种药材.方法 提取不同产地29份茅苍术、北苍术A. chinesis及白术A. macrocephala基因组DNA,通过PCR扩增ITS2序列并进行双向测序,测序结果提交至GenBank;从GenBank下载茅苍术及其菊科近缘种10种45条ITS2序列;对提交与下载的73条序列,应用MEGA 5.1软件进行序列比对,计算种内和种间距离,采用相似性搜索法、最近距离法进行鉴定分析,并构建Neighber-jioning(NJ)系统进化树直观反映鉴定结果.结果 茅苍术药材ITS2序列长度均为229 bp,是1个单倍型;与菊科近缘种苍术属药材距离较近,与菊科其他属近缘种之间遗传距离较远,NJ树结果显示茅苍术及其近缘种药材均可明显区分,表现出良好的单系性,依据ITS2二级结构,也可以直观地将茅苍术与菊科近缘种药材区分.结论 ITS2序列作为DNA条形码能稳定、准确鉴别茅苍术药材,为保障临床安全用药提供了新的技术手段.     

基于ITS2序列的苍术属植物遗传关系

目的:应用内部转录间隔区2(ITS2)序列鉴定东北产栽培和野生苍术及其近缘种药材,明确其种间遗传关系远近,并对东北产朝鲜苍术的栽培起源进行初步探索。方法:提取不同栽培区包括北苍术、朝鲜苍术在内的五种苍术属40份样本以及朝鲜苍术7份野生种质样本的基因组DNA,通过聚合酶链式反应(PCR)扩增ITS2序列并进行双向测序,所得所有序列用MEGA5. 0软件进行比对分析(clustal W),去除两端5. 8S和28S序列,获得完整的ITS2序列,构建系统聚类树(NJ树)。结果:苍术属5种药材ITS2序列长度均为232 bp。根据NJ树和ITS2二级结构结果,除北苍术和朝鲜苍术未被区分开,其余几种药材均可明显区分,表现出良好的单系性。根据NJ树结果可知,朝鲜苍术的栽培品系和野生种质也能很好的聚在一起。结论:ITS2序列能稳定、准确鉴别苍术属5种药材。朝鲜苍术与北苍术亲缘关系很近,可认为是苍术北方分支中的一种变种,建议将朝鲜苍术并入北苍术。且在辽宁有大规模栽培的朝鲜苍术可能起源于辽宁本地的野生群体,种源可能来自于辽宁岫岩等地的野生种。     

甘松属资源遗传多样性及其ITS二级结构系统发育信息分析

目的 基于ITS1和ITS2序列,对来自四川、青海、甘肃和西藏不同地区的甘松属植物甘松Nardostachys chinensis、匙叶甘松N. jatamansi遗传多样性进行研究及分子鉴定。方法 通过PCR扩增获得甘松ITS1、ITS2序列,采用MEGA软件进行多重序列比对,用DNA EditSeq软件进行剪切、拼接和统计等分析,运用Kimura two-parameter(K2-P)模型进行遗传距离分析,运用DNASTAR软件进行同源性和差异性分析,利用邻接法（neighbor joining,NJ）构建系统发育树,采用DNAsp V5软件进行遗传多样性分析。结果 ITS1序列长度范围为687～689 bp,仅2 bp差异;ITS2序列长度高度保守,均为468 bp。ITS1与ITS2序列G/C含量均达66.00%以上。系统发育分析发现,ITS序列可将甘松属20个样本分为2支,甘松与匙叶甘松各自为一支,但二者亲缘关系很近。遗传多样性分析发现,匙叶甘松综合遗传多样性水平指标大于甘松。结论 据形态学及遗传学分析,甘松属应分为甘松与匙叶甘松2种,且遗传多样性较低,种内遗传变异相对稳定。...     

蝙蝠蛾拟青霉及金水宝胶囊的DNA条形码鉴定

目的:由于传统方法对发酵菌丝体鉴定困难,采用DNA条形码技术对金水宝胶囊原料菌种蝙蝠蛾拟青霉及相关产品进行快速鉴定。方法:采用内转录间隔区(ITS)序列对收集的蝙蝠蛾拟青霉及其易混淆物种共8种168份样品进行条形码鉴定,并基于ITS序列设计蝙蝠蛾拟青霉特异引物对相关产品进行快速鉴定。结果:44份不同来源蝙蝠蛾拟青霉的ITS序列长度均为499 bp,无变异位点。基于ITS序列可对蝙蝠蛾拟青霉及其7种易混伪品进行区别;通过ITS序列设计的蝙蝠蛾拟青霉特异性引物(ITS-BF/ITS-BR)可特异扩增得到长度102 bp的短片段,采用该片段可快速鉴别蝙蝠蛾拟青霉与其他虫草菌,并可区分市场上相关产品。结论:通过ITS序列及特异性引物可以实现蝙蝠蛾拟青霉及其相关产品的快速鉴定,为金水宝胶囊的生产及质量控制提供参考。     

基于ITS2条形码鉴定藏柴胡及其易混品

目的 采用DNA条形码分子鉴定技术鉴定藏柴胡（又名窄竹叶柴胡）Bupleurum marginatum及其易混品，以确保柴胡药材质量及临床用药安全。方法 收集柴胡药材共50份，对其ITS2序列进行PCR扩增并双向测序，所得序列用CodonCode Aligner软件校对拼接后，利用MEGA 6.0对序列进行分析比对，计算种内、种间遗传距离，利用邻接法（NJ）构建系统聚类树，并应用ITS2数据库网站预测其ITS2二级结构。结果 藏柴胡种内遗传距离明显小于它与其同属的种间遗传距离，基于ITS2建立的NJ树和网站预测的ITS2二级结构，均能准确将藏柴胡药材与其易混药材区分。结论 基于ITS2序列可以科学准确地鉴别藏柴胡药材及其易混品，为确保临床用药安全提供更多先进可靠的技术手段。