蟾毒灵对骨肉瘤细胞凋亡和自噬的影响及两者的交互作用

目的：探讨蟾毒灵对骨肉瘤细胞凋亡、自噬的影响及两者的交互作用。方法：蟾毒灵处理骨肉瘤细胞后使用CCK-8检测细胞活性，Annexin V/PI流式细胞术检测细胞凋亡，Western-blot检测凋亡及自噬相关蛋白表达。结果：蟾毒灵能抑制骨肉瘤细胞增殖、诱导骨肉瘤细胞凋亡，且蟾毒灵能激活骨肉瘤细胞自噬，而抑制凋亡促进了自噬的激活，阻断自噬则加重细胞凋亡。结论：蟾毒灵能诱导骨肉瘤细胞凋亡发挥抗肿瘤作用，且蟾毒灵能激活细胞自噬，自噬的激活主要是拮抗细胞的凋亡。     

载蟾毒灵Pluronic-PEI纳米微囊通过抑制miR-497介导的IGF1-R-PI3K-Akt通路抗大肠癌侵袭转移

  目的：探讨载蟾毒灵Pluronic-PEI纳米微囊通过抑制miR-497介导的IGF1-R-PI3K-Akt信号通路对大肠癌Lovo细胞体外及在裸鼠体内生长的影响及其作用机制。  方法：利用慢病毒miR-497转染大肠癌Lovo细胞,观察载蟾毒灵Pluronic-PEI纳米微囊对Lovo细胞体外增殖和侵袭转移能力的影响及miR-497介导的IGF1-R-PI3K-Akt信号通路相关基因和蛋白的调控作用。建立裸鼠原位移植瘤模型,8周后处死动物,观测对成瘤的影响。  结果：①与对照组比较,载蟾毒灵的纳米微囊对过表达miR-497的Lovo细胞的抑制率最显著并呈时间-剂量依赖性;并使其凋亡率从(28.93±0.24)%提高至(75.20±0.29)%,明显高于相同浓度作用的Lovo细胞和Lovo NC细胞(P<0.01);划痕实验中过表达miR-497的Lovo细胞的迁移率从(0.083±0.019)(25 nmol/L)降低到(-0.242±0.035)(400 nmol/L), 呈剂量依赖性;②Transwell结果提示载蟾毒灵纳米微囊在25 nmol/L就能够显著抑制过表达miR-497的Lovo细胞的侵袭作用;③免疫印迹分析提示载蟾毒灵的纳米微囊和LY 294002作用Lovo NC细胞和过表达miR-497的Lovo细胞,两种细胞的p-Akt Ser 473和p-Akt Thr 308蛋白表达明显下降,而pan-Akt变化不明显。④体内实验显示载蟾毒灵纳米微囊抑制瘤体转移优于蟾毒灵组。  结论：载蟾毒灵Pluronic-PEI纳米微囊可以通过抑制miR-497介导的 IGF1-R-PI3K-Akt信号通路,在体外、体内都可发挥抗结肠癌侵袭和转移的作用。     

蟾毒灵诱导骨肉瘤细胞株凋亡的蛋白质组学研究

目的：探索蟾毒灵诱导骨肉瘤细胞株凋亡的作用及相关分子机制。方法：利用MTT法检测蟾毒灵处理骨肉瘤细胞株U2OS,U2OS/MTX300（甲氨蝶呤耐药细胞株）,SAOS2,IOR/OS9后24,48,72 h的生长抑制作用,通过流式细胞仪检测蟾毒灵处理48 h后上述细胞凋亡率,双向凝胶电泳联合MALDI-TOF/TOF质谱技术筛选蟾毒灵处理U2OS细胞48 h后差异表达的蛋白,Western blot法验证相关蛋白表达。结果：蟾毒灵对四株骨肉瘤细胞株生长抑制作用呈时间及剂量依赖性,蟾毒灵对甲氨蝶呤敏感细胞株U2OS及耐甲氨蝶呤细胞株U2OS/MTX300的72 h IC₅₀分别为（37.43±4.1）,（32.24±5.3） nmol·L^-1。流式细胞仪检测结果证实蟾毒灵可显著诱导四株骨肉瘤细胞凋亡。蛋白质组学筛选、鉴定出蟾毒灵处理U2OS 48 h后24种差异表达蛋白,进一步Western blot验证发现凋亡相关蛋白中热休克蛋白27表达变化最为显著,并且过表达热休克蛋白27可部分逆转蟾毒灵诱导U2OS及U2OS/MTX300细胞凋亡的作用。结论：蟾毒灵具有显著诱导骨肉瘤凋亡作用,其中热休克蛋白27蛋白水平下调在蟾毒灵诱导的骨肉瘤细胞凋亡中具有重要作用。     

蟾毒灵对人大肠癌HCT116细胞增殖的影响

目的研究蟾毒灵对人大肠癌HCT116细胞增殖及细胞周期的影响。方法采用MTT法观察不同浓度蟾毒灵对人大肠癌HCT116细胞增殖的抑制作用;透射电镜观察细胞形态及超微结构;流式细胞术分析细胞周期分布情况。结果蟾毒灵对大肠癌细胞生长抑制作用呈浓度-时间依赖性,蟾毒灵可将细胞周期阻滞于S期,透射电镜观察到典型的细胞凋亡特征。结论诱导大肠癌细胞周期S期阻滞可能是蟾毒灵抑制大肠癌细胞增殖的机制之一。     

蟾毒灵对人膀胱癌T24细胞增殖及细胞凋亡的影响

目的:探讨蟾毒灵对人膀胱癌T24细胞在细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡等方面的影响及其可能的机制,为膀胱癌的治疗寻找新的策略。方法:将实验分为空白组和蟾毒灵组(蟾毒灵组分为不同浓度组)。用CCK-8法评价蟾毒灵对人膀胱癌细胞株T24细胞体外增殖的影响,流式细胞术(flow cytometry, FCM)测定各组细胞周期及凋亡率的变化。Western-blot法检测凋亡相关蛋白Caspase-3、Caspase-9、Bax及Bcl-2的表达。裸鼠成瘤实验检测蟾毒灵对人膀胱癌细胞株T24细胞体内生长的影响。结果:与空白组比较,蟾毒灵可抑制膀胱癌T24细胞生长,浓度、时间依赖性明显,并将细胞周期阻滞于G0/G1期。蟾毒灵有明显诱导膀胱癌T24细胞凋亡作用,其凋亡作用随药物浓度增加而增加。Western-blot结果显示:蟾毒灵可明显上调Caspase-3、Caspase-9、Bax蛋白的表达,下调Bcl-2蛋白的表达。裸鼠皮下瘤生长实验示:蟾毒灵不同浓度干预组细胞种植瘤的平均体积均明显低于空白组,且蟾毒灵浓度越高,其抑制瘤体生长的趋势越明显。结论:蟾毒灵可抑制人膀胱癌T24细胞增殖,并将细胞周期阻滞在G0/G1期,可显著诱导T24细胞凋亡,并能有效抑制裸鼠模型肿瘤的生长。其作用机制可能是上调凋亡蛋白Caspase-3、Casepase-9、Bax的表达并下调凋亡抑制蛋白Bcl-2的表达等。     

功能基因组学方法筛选蟾毒灵抗肝癌细胞的潜在凋亡靶点

目的：筛选中药单体蟾毒灵促进人肝癌细胞凋亡的潜在分子靶点。方法：以人肝癌细胞株PLC/PRF/5为体外模型，观察中药单体蟾毒灵对人肝癌细胞凋亡以及相关基因表达的影响。以不同浓度的蟾毒灵分别作用于PLC/PRF/5细胞24 h、48 h、72 h，检测其对人肝癌细胞增殖和凋亡的影响。通过高通量Illumina RNA测序，筛选蟾毒灵作用人肝癌细胞后基因表达的变化，并进行生物信息学分析。结果：中药单体蟾毒灵可抑制人肝癌细胞增殖并诱导其凋亡；中药单体蟾毒灵可诱导不同基因的表达；基因本体（GO）富集分析表明，中药单体蟾毒灵可以影响细胞周期、凋亡等通路的变化；京都基因和基因组百科全书（KEGG）富集分析凋亡通路表明，钙离子诱导的细胞死亡途径中的钙蛋白酶表达明显上调。结论：中药单体蟾毒灵具有明显的抗肝癌细胞凋亡作用，并可通过作用相关信号通路中的多靶点参与此过程。     

蟾毒灵联合吉非替尼对肺癌细胞H1975的影响及机制研究

目的 观察蟾毒灵联合吉非替尼对肺癌细胞H1975生长的影响,探讨蟾毒灵增强吉非替尼抗肿瘤作用的可能机制。方法 应用MTT法检测蟾毒灵（1～100 nmol/L）、吉非替尼（0.1～20 μmol/L）及两药联合干预对H1975细胞增殖的抑制作用;流式细胞术观察蟾毒灵（10 nmol/L）、吉非替尼（1 μmol/L）及联合用药对H1975细胞凋亡的影响;Western blot检测单独用药或联合用药对表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor,EGFR）、Met信号通路相关蛋白表达的影响。结果 MTT结果显示,吉非替尼浓度超过5 μmol/L时才见到其对H1975细胞生长的抑制作用;蟾毒灵与吉非替尼联合后,可明显抑制肿瘤细胞的生长。流式细胞术结果显示,蟾毒灵联合吉非替尼干预后肿瘤细胞凋亡率为（61.64±5.61）%,明显高于单用蟾毒灵的（18.34±3.42）%和单用吉非替尼的（7.32±1.08）%,差异有统计学意义（P<0.01）。Western blot结果显示,蟾毒灵联合吉非替尼能明显下调H1975细胞p-EGFR、p-Met、磷酸化蛋白激酶B（p-Akt）、磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（p-mTOR）蛋白表达。结论 蟾毒灵联合吉非替尼可显著抑制H1975细胞的增殖,促使肿瘤细胞凋亡;其抗肿瘤活性的机制可能与阻断EGFR－磷酯酰肌醇－3激酶（PI3k）/Akt信号通路有关。     

蟾毒灵抑制人白血病多药耐药K562/VCR细胞株增殖的实验研究

目的探讨蟾毒灵对人白血病多药耐药K562/VCR细胞株增殖抑制的作用及其可能的机制。方法采用MTT比色法测定蟾毒灵对多药耐药K562/VCR细胞株的增殖抑制率,倒置显微镜及Wright-Giemsa染色法观察细胞形态学改变,流式细胞术(FCM)分析蟾毒灵对K562/VCR细胞株细胞周期分布的影响,免疫细胞化学法检测耐药细胞中胸苷酸合酶(TS)表达的变化。结果蟾毒灵能够显著抑制人白血病多药耐药K562/VCR细胞株的增殖,0.01μmol/L的蟾毒灵即可诱导耐药细胞出现典型的细胞凋亡形态学特征,FCM细胞周期分析显示G2/M期细胞比率减少、"亚G1期"细胞增多,0.001μmol/L的蟾毒灵可显著下调K562/VCR多药耐药细胞中TS蛋白的表达。结论人白血病多药耐药K562/VCR细胞株对蟾毒灵无交叉耐药性,蟾毒灵可诱导耐药细胞周期阻滞和细胞凋亡,下调TS蛋白可能是蟾毒灵抑制多药耐药细胞株增殖的机制之一。     

蟾毒灵调控PI3K/Akt 通路对结肠癌HT-29 细胞凋亡及周期的影响

目的：研究蟾毒灵诱导人结肠癌HT-29 细胞凋亡及周期阻滞的能力并对其分子机制进行探讨。方法：将人结肠癌HT-29 细胞分为对照组（野生型细胞）,蟾毒灵（Bufalin） 处理组（0.25,0.5,1 μmol/L） 和顺铂（DDP） 组（1 μg/mL）。通过流式细胞术（FCM） 检测蟾毒灵诱导人结肠癌HT-29 细胞凋亡及周期阻滞的作用;使用蛋白质免疫印迹法检测经蟾毒灵处理HT-29细胞24 h 后磷脂酰肌醇-3 激酶（PI3K）、磷酸化磷脂酰肌醇-3 激酶（p-PI3K）、蛋白激酶B（Akt） 和磷酸化蛋白激酶B（p-Akt）蛋白表达的变化。通过实时荧光定量PCR 法（RT-qPCR） 检测蟾毒灵对HT-29 细胞PI3K、Akt mRNA 表达的影响。结果：FCM结果显示,与对照组比较,蟾毒灵（0.25,0.5,1 μmol/L） 组能诱导结肠癌HT-29 细胞的凋亡（P＜0.05）,并呈剂量依赖性。与对照组比较,蟾毒灵（0.25,0.5,1 μmol/L） 组能够诱导结肠癌HT-29 细胞的周期阻滞于G2/M 期,并且蟾毒灵浓度越大,周期阻滞效果越显著（P＜0.05）。蛋白质印迹实验结果表明,与对照组比较,蟾毒灵能够下调PI3K、p-PI3K、Akt 和p-Akt 的表达水平,并呈一定的剂量依赖（P＜0.05）。RT-qPCR 结果显示,与对照组比较,蟾毒灵能够显著下调PI3K 和Akt mRNA 的表达。结论：蟾毒灵能够诱导结肠癌HT-29 细胞凋亡及周期阻滞,其机制可能与抑制PI3K/Akt 信号通路有关。     

蟾毒灵对人雄激素非依赖性前列腺癌DU145细胞增殖及Bcl-2、Bax基因的影响

目的:研究蟾毒灵(bufalin,Bu)对人雄激素非依赖性前列腺癌DU145细胞增殖及凋亡相关基因Bcl-2、Bax的影响。方法:CCK-8法检测细胞抑制效应,光学显微镜观察细胞形态变化,流式细胞术检测药物诱发细胞凋亡改变,Western-blot法检测细胞凋亡相关基因Bcl-2、Bax的表达。结果:CCK-8法检测提示蟾毒灵处理细胞后有显著的增殖抑制作用;光学显微镜观察显示细胞增殖受到抑制并呈凋亡形态改变;流式细胞术检测结果表明,蟾毒灵诱导DU145细胞凋亡、凋亡率与对照组比较,差异有统计学意义(P0.05);Western-blot检测提示蟾毒灵可增强细胞Bax基因的表达,下调Bcl-2基因的表达。结论:蟾毒灵能抑制人前列腺癌DU145细胞增殖,其机制可能与蟾毒灵调控细胞凋亡效应有关。     

Cissampelos sympodialis Eichl. (Menispermaceae): oral treatment decreases IgE levels and induces a Th1-skewed cytokine production in ovalbumin-sensitized mice

The murine model of ovalbumin (OVA)-induced allergy was used to evaluate the effectiveness of oral treatment with the leaf extract of Cissampelos sympodialis Eichl. (Menispermaceae) (CS) in the modulation of immunoglobulin E (IgE) production and T cell activation. CS treatment with doses ranging from 200 to 600 mg/Kg/day for 15 days before and during OVA-sensitization promoted reduction in total and OVA-specific serum IgE. CS at 400 or 600 mg/Kg/day also reduced paw edema induced by local OVA challenge. Daily intake of up to 600 mg/Kg of oral CS by BALB/c mice did not reduce weight gain, which is indicative of a lack of systemic toxicity. To assess the effect of CS treatment on T cell proliferative response to stimuli in vitro, the mitogenic response of spleen cells of treated and control animals were evaluated. Cells from CS-treated animals showed an elevated background proliferative response to concanavalin-A (Con-A) when compared to those from control animals. Oral intake of CS increased the in vitro production of IFN-gamma and IL-10 by Con-A stimulated cells. Mice treated with 200 mg/Kg/day CS showed increasing levels of IFN-gamma. These results show that oral treatment with Cissampelos sympodialis extract has an immunomodulatory effect, reducing allergy-associated responses possibly by a preferential activation of Th1-type cytokines.     

壳聚糖的分子参数对载药壳聚糖纳米粒体外性质的影响研究

 目的研究不同脱乙酰度及不同相对分子质量的壳聚糖(CS)对壳聚糖纳米粒体外性质的影响,为载药壳聚糖纳米粒的处方优化提供实验依据。方法以去甲斑蝥素(NCD)为模型药物,以不同脱乙酰度、不同相对分子质量壳聚糖为主要膜材,采用离子交联法制备壳聚糖纳米粒(CS-NP),考察纳米粒的形态、粒径、Zeta电位、药物包封率、载药量及体外释放特征。结果该方法制备的CS-NP外观呈圆形,粒径均匀。随着CS的脱乙酰度的降低,纳米粒粒径增大,Zeta电位降低,药物包封率及载药量均下降,且体外释药速度加快;随着CS的相对分子质量降低,纳米粒粒径变小,Zeta电位、药物包封率及载药量无明显变化, 但体外释药速度增加。结论CS的脱乙酰度、相对分子质量对纳米粒的体外性质有较大的影响,可通过选用不同脱乙酰度或相对分子质量的CS,制备得到不同粒径的壳聚糖纳米粒,并达到调节药物释放速度的目的。     

Box-Behnken效应面法优化大黄素/小檗碱-壳聚糖双载药纳米粒的处方工艺研究

目的优化大黄素(Emo)与小檗碱(Ber)壳聚糖双载药纳米粒的制备工艺和处方,并考察其稳定性及溶出度。方法以壳聚糖(CS)为载体,三聚磷酸钠(TPP)为交联剂,采用离子交联法包载大黄素/羟丙基-β-环糊精(HP-β-CD)和小檗碱,得到载药纳米粒(Emo/HP-β-CD-Ber-CS NPs),以粒径和多分散指数(PDI)为自变量,运用总评归一值(OD)法进行数据处理,采用Box-Behnken效应面法优化处方并进行验证。最后对纳米粒的最佳冻干条件进行筛选,考察保护剂种类和用量。并对制剂进行表征和溶出度考察。结果优化得到的最佳制备工艺为壳聚糖与TPP质量比为3∶1,小檗碱与载体质量比为0.166∶1,Emo/HP-β-CD与载体质量比为0.2∶1。测得Emo/HP-β-CD-Ber-CS NPs的平均粒径为(178.0±2.0)nm,PDI为0.187±0.006,平均OD值为0.9536,实测值与预测值接近。大黄素和小檗碱的载药量分别为0.34%和0.95%。稳定性考察结果表明,纳米粒胶体溶液在9 d内以4℃储存物理性质稳定,以6%葡萄糖为保护剂制得的冻干制剂效果较好,复溶迅速,再分散后的平均粒径为(161.8±4.8)nm,PDI为0.263±0.047。体外释放研究表明载药纳米粒冻干粉溶解度和溶出度显著提高。结论Box-Behnken效应面法所建立的模型能较好的用于Emo/HP-β-CD-Ber-CS NPs制剂的处方优化,精度高,预测效果较好,且Emo/HP-β-CD-Ber-CS NPs制备工艺稳定可行。     

槲皮素对人骨肉瘤细胞U-2OS/MTX300增殖和凋亡的影响及其机制研究

目的:研究槲皮素(quercetin,Qu)对骨肉瘤细胞系U-2OS/MTX300增殖和凋亡的作用及其机制。方法:MTT法观察细胞增殖活性;Annexin V/PI染色检测凋亡;线粒体膜电位及细胞色素C的Western blot检测线粒体凋亡途径;持续活化Akt瞬时转染、Western blot检测Akt通路相关蛋白表达水平变化。结果:槲皮素可明显抑制耐甲氨蝶呤骨肉瘤细胞U-2OS/MTX300生长,并呈时间和剂量依赖性;Annexin V/PI可明显检测到细胞凋亡;进一步发现其作用机制是通过下调线粒体膜电位,促进细胞色素C向胞浆释放及抑制Akt磷酸化来实现。结论:槲皮素可显著抑制耐甲氨蝶呤骨肉瘤细胞系U-2OS/MTX300细胞增殖并诱导其凋亡,其机制与线粒体凋亡途径及抑制Akt活性有关。     

蟾毒灵体内外抗肿瘤作用及制剂研究进展

蟾毒灵是中药蟾酥中的一种活性单体,能抑制多种实体瘤及白血病肿瘤细胞增殖,诱导肿瘤细胞凋亡,逆转肿瘤细胞耐药,抑制肿瘤细胞迁移和浸润。该文就蟾毒灵对肝癌、肺癌、肠癌、胃癌、膀胱癌等多种肿瘤的体内外抑制作用及机制的最新研究成果进行了详尽综述,并综括了其新型制剂的研究进展,以期为其更深入的研究和应用提供参考。     

冬虫夏草菌粉对尖锐湿疣Th1/Th2免疫应答的调节

目的：探讨冬虫夏力粉对尖锐湿疣（ＣＡ）患者体内ＩＬ－２及ＩＬ－１０水平的影响,及预防电灼未后ＣＡ复发的作用;方法;采用ＥＬＩＳＡ双抗体夹心法对３４例冬虫夏草治疗组患者和２９例对照组患者治疗前后血清中ＩＬ－２及ＩＬ－１０含量检测,观察常规电灼术后ＣＡ复发情况;结果：经冬虫夏草治疗２月后ＣＡ患者血清ＩＬ－２水平明显较前升高（Ｐ〈０．０５）,ＩＬ－１０水平降低（Ｐ〈０．０１）。而对照组ＩＬ－２及ＩＬ－１     

六味地黄汤对细胞诱导的杀伤细胞体外扩增及抗骨肉瘤细胞的影响

目的:探讨六味地黄汤对不同人群来源的多种细胞诱导的杀伤细胞(cytokine-induced killer cells,CIK)细胞增殖及其对骨肉瘤细胞毒活性的作用。方法:实验分为6组,通过向10名健康男性的外周血单个核细胞(PBMC)中分别加入在白介素-2(IL-2)、干扰素-γ(IFN-γ)、白介素-1(IL-1)、抗CD3单克隆抗体(CD3McAb)及不同浓度中药血清,诱导CIK细胞,检测其形态及表型,测定CIK细胞对骨肉瘤细胞的细胞毒性作用。结果:单纯中药含药血清对CIK无诱导作用,细胞因子联合含药血清培养的CIK增殖倍数明显高于无药血清和无血清培养(P<0.05),而在联合培养中中剂量中药的CIK增殖速度高于低和高剂量血清培养(P<0.05),且对CIK细胞CD3+CD5 6+表达最为稳定;各组对骨肉瘤细胞均有一定杀伤作用,其中联合培养含药血清中剂量培养CIK细胞对骨肉瘤细胞杀伤效果最好。结论:单纯六味地黄汤含药血清对CIK细胞基本无诱导作用,联合细胞因子有促进CIK细胞的体外扩增作用,对骨肉瘤细胞有较强的杀伤活性,但与浓度相关。     

7种抗菌药物对临床常见致病菌抗菌活性的比较

 采取琼脂平析稀释法测定了泰宁（ｉｍｉｐｅｎｅｍ／ｃｉｌａｓｔａｉｎ）等７种抗菌药物对２１５株临床常见致病菌的最低抑菌浓度（ＭＩＣ），并统计了敏感率。结果表明７种抗菌药物对大多数受试菌均显示了较高的抗菌活性，其中泰宁的抗菌活性最强，金黄色葡萄球菌、变形杆菌属、大肠埃希菌、肺炎克雷白菌对泰宁的敏感率达９７．６％～１００．０％；而１７．０２％的绿脓假单胞菌对泰宁耐药；有２～６株绿脓假单胞菌和１株肺炎克雷白菌对泰宁和其它抗菌药物呈现部分交叉耐药性。而环丙沙星与其它抗菌药物对不同受试菌呈现２．３８％～１９．０５％的交叉耐药率。该结果提示对其它β－内酰胺类抗菌药物耐药的致病菌引起的严重感染，可考虑选用泰宁。