主动外排泵外膜蛋白编码基因hefA在幽门螺杆菌多重耐药中的重要作用

目的: 研究幽门螺杆菌(H pylori)分离株的多重耐药机制.方法:用氯霉素对临床分离株H pylori和标准株H pylori进行体外诱导,琼脂稀释法测定诱导后菌株对甲硝唑、四环素、琥乙红霉素、环丙沙星和青霉素G的耐药性,从而筛选出多重耐药株;实时定量PCR检测多重耐药株和敏感株中编码主动外排泵外膜蛋白的结构基因hefA的mRNA水平.通过构建hefA基因敲除株,测定敲除前后菌株对10种抗生素的敏感性.PCR扩增20株H pylori临床分离株主动外排泵结构基因hefA和hefC.结果:经氯霉素诱导后,筛选出的耐药菌株均表现出相似的多重耐药性,6株多重耐药株hefA基因mRNA水平显著高于敏感株(5.8466±2.9370 vs 2.6356±1.7245,P=0.033);成功构建了HefA基因敲除株(△HpLZ1026),△HpLZ1026对4种抗生素的敏感性明显增加;所有20株临床分离株中均检测出hefA和hefC基因,未发现hefABC基因缺失株.结论:主动外排系统hefA基因高表达导致体外人工诱导H pylori多重耐药的产生;hefABC基因在H pylori中普遍存在,且在H pylori多药耐药机制中起重要作用.     

外排泵抑制剂对幽门螺杆菌多重耐药性的影响

目的:探索多种外排泵抑制剂对H.pylori多重耐药性的影响.方法:临床分离培养H.pylori,对分离敏感株进行氯霉素耐药性诱导,筛选出多重耐药(MDR)株;琼脂二倍稀释法对敏感菌株和MDR株进行9种抗生素的药敏试验,分别加入外排泵抑制剂碳酰氰基-对-氯苯腙(CCCP)、利血平、泮托拉唑后再次进行药敏试验,比较分析外排泵抑制剂对H.pylori耐药性的影响;同样方法检测泮托拉唑、雷贝拉唑、奥美拉唑、兰索拉唑和埃索美拉唑对MDR-H.pylori株抗生素最小抑菌浓度(MIcs)值的影响.结果:诱导出4株MDR-H.pylori;CCCP及泮托拉唑能够部分恢复MDR-H.pylon株对抗生素的敏感性,而利血平对MDR-H.pylori耐药性无明显影响;这三种外排泵抑制剂对敏感株的MICs值影响不大;5种质子泵抑制剂中,雷贝拉唑能使甲硝唑和阿莫西林的MIC值分别降低至1/4和1/3,泮托拉唑能使其均降低至1/2左右.结论:外排泵抑制剂能够在体外提高多重耐药H.pylori株的药物敏感性;在所有质子泵抑制荆中雷贝拉唑对降低MDR-H.pylori对抗生素的耐药性作用最强,其次为泮托拉唑.     

贵阳地区儿童感染幽门螺杆菌的分离培养及耐药性检测

目的:了解贵阳地区儿童感染幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)临床分离株对常用抗H.pylori抗生素甲硝唑、克拉霉素、阿莫西林等的体外敏感性,以指导临床用药根除H.pylori感染.方法:收集2011-10/2014-06贵阳市儿童医院行胃镜检查的患儿胃黏膜标本进行H.pylori分离培养,对分离鉴定后的菌株采用界值法进行甲硝唑、克拉霉素、阿莫西林、左氧氟沙星的敏感性试验.结果:从434例患儿胃黏膜中培养出H.pylori63株(14.5%),63例H.pylori菌株中3株为敏感菌株,60株为耐药菌株,其对甲硝唑、克拉霉素、阿莫西林、左氧氟沙星的耐药率分别为57.1%、85.7%、38.1%、90.5%.二重、三重、四重耐药率分别为90.5%(57/63)、57.1%(36/63)、38.1%(24/63).结论:贵阳地区儿童感染H.pylori对阿莫西林敏感性高于对其他常用药物的敏感性;对左氧氟沙星和克拉霉素的耐药率较高,并且多重耐药率较高.     

广西地区幽门螺杆菌CagA基因表达及其耐药性

目的:了解广西地区上消化道疾病患者幽门螺杆菌(H pylori)细胞毒素相关蛋白(CagA)基因的表达情况及其对常用抗生素的敏感性.为临床诊Hpylozi感染提供理论依据.方法:从上消化道疾病患者胃黏膜中分离出50株H pylori,用特异性引物扩增H pyloriCagA基因到297 bP片段,经聚合酶链反应(PCR)检测,同时采用E-test法对这50株Hpylori进行抗生素敏感试验.结果:50株H pylori 中有76%(38/50)的有CagA基因,其表达在消化性溃疡患者与慢性胃炎患者以及男性与女性患者间差异无显著性.50株H pylori对甲硝唑的耐药率为86.0%(43/50),克拉霉素的耐药率为6.0%(3/50),四环素的耐药率为4.0%(2/50),未发现对阿莫西林耐药的菌株.甲硝唑的耐药率明显高于四环素和克拉霉素的耐药性(P<0.01).CagA阳性菌株耐药性为89.5%(34/38).CagA阴性菌株的耐药率为75.0%(9/12),两者比较差异无显著性.结论:广西地区CagA阳性菌株是上消化道疾病发生的主要因素.H pylori对阿莫西林、克拉霉素和四环素的敏感性较高,可作为抗H pylod的首选药物,甲硝唑的耐药率高,临床上治疗H pylari感染时应尽量避免使用甲硝唑.     

幽门螺杆菌耐药性及三种耐药检测方法的比较

目的分析浙江地区幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)耐药情况,并比较不同耐药检测方法的一致性.方法选择2017-06/2017-09进行胃镜检查的305例患者,取胃黏膜组织进行H.pylori菌株分离鉴定,对分离的127个菌株进行6种抗生素的药敏实验,提取菌株的DNA,以荧光定量PCR法和测序法对克拉霉素耐药相关基因23S rRNA和左氧氟沙星耐药相关基因gyrA进行扩增和测序.结果在305份胃黏膜活检标本中,分离出H.pylori 127株.127株H.pylori中124株为耐药菌株,3株为敏感菌株.阿莫西林、盐酸四环素、呋喃唑酮无耐药菌株;克拉霉素、左氧氟沙星、甲硝唑耐药率分别为33.86%(43/127)、44.88%(57/127)、91.34%(116/127)、三重耐药率为18.90%(24/127);克拉霉素和左氧氟沙星相关的主要耐药基因及其突变位点分别为23S rRNA(A2143G)、gyrA(C261A/G),突变频率分别为42.5%(54/127)和15.0%(19/127).不同耐药检测方法的一致性比较:荧光定量PCR法与测序法检测耐药突变一致性较高,与药敏培养法一致性相对较差.结论浙江地区对克拉霉素、左氧氟沙星耐药率均达到很高,在临床应用这些抗生素需结合耐药性,选择敏感的抗生素个体化地用药,提高根除效率.     

基于全基因组测序对双重耐药幽门螺杆菌外排泵基因变异的研究

背景世界上50%以上的人口感染幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, H. pylori).随着抗生素的广泛使用,抗生素耐药成为H. pylori感染患者根除失败的主要原因.目前有不少研究报道外排泵基因过表达和耐药的产生相关.目的为了未来的H. pylori感染治疗有更多方法,探索外排泵基因的变异与双重耐药菌株耐药性产生的内在联系.方法使用13C呼气试验及药物敏感试验进行双重耐药菌株及敏感菌株的筛选,用特异性PCR的常规方法进行耐药基因突变位点的验证,基于Mi Seq平台,对10例临床菌株进行全基因组测序,以鉴定双重耐药表型与敏感表型的外排泵基因的单核苷酸变体(single nucleotide variants, SNV)并分析,参考菌株使用ATCC26695.结果H.pylori药敏试验结果显示,丽水地区H.pylori对克拉霉素及左氧氟沙星都具有较高的耐药率.采用特异性PCR法在5株临床双重耐药菌株中检测到23S r RNA基因及gyr A的点突变,在5株临床敏感菌株中未检测到.全基因测序检测了涉及多耐药性的Tol C同源物的四个基因簇(HP0605-HP0607, HP0971-HP0969,HP1327-HP1329和HP1489-HP1487)的遗传变异.在双重耐药性H. pylori菌株中发现一个突变的SNV.结论丽水地区抗生素使用应严格监控,避免滥用. Tol C同源基因的基因簇与H. pylori菌株的抗生素耐药性相关.全基因组测序对基因型与表型的关系有了新的认识.     

新疆地区维、汉族幽门螺旋杆菌临床分离菌株对左氧氟沙星耐药分析

目的 调查研究新疆地区汉维两族幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)临床分离菌株对左氧氟沙星耐药现状.方法 应用E-test法检测60株H.pylori菌株(汉维各30株)对左氧氟沙星耐药率.结果 新疆地区H.pylori临床分离菌株对左氧氟沙星耐药率为41.67%.汉维两族H.pylori对左氧氟沙星耐药率差异无统计学意义(P＞0.05);不同性别、年龄、疾病的H.pylori对左氧氟沙星耐药率的差异无统计学意义(P＞0.05).结论 新疆地区H.pylori对左氧氟沙星耐药率相对较高,在H.pylori的根除方案中尽量避免选择左氧氟沙星.在选择H.pylori根除治疗的抗生素时可以忽略汉维两族之间的差异.     

贵州省黔南州幽门螺杆菌克拉霉素的耐药性及23S rRNA基因突变的特征

目的:了解贵州省黔南州幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)克拉霉素耐药相关基因突变情况.方法:采用改良琼脂稀释法检测分离自黔南州人民医院的74株H.pylori对克拉霉素的敏感性,选取H.pylori克拉霉素耐药菌株22株、敏感株10株,以及NCTC11637进行23S rRNA基因功能区V区片段的PCR扩增和测序,与GenBank中收录的H.pylori敏感菌株U27270相关序列进行比对和分析.结果:74株H.pylori克拉霉素耐药率为29.7%(22/74).共发现10种突变类型,其中在耐药菌株及敏感菌株23S rRNA V区均存在的基因突变包括:T2183C、T2245C和T2321C;仅在耐药株(22株)中检测到的突变包括:A2144G(4/22)、A2224G(4/22)、C2196T(1/22)、C2289 T(1/22)、A2435G(1/22)、C2695A(1/22)、T2712C(1/22).结论:黔南州医院分离的H.pylori克拉霉素耐药率较高;与耐药性相关的23S rRNA基因突变主要为A2144G和A2224G;本院菌株存在A2435G、C2695A、T2712C 3种尚未见报道的突变.     

光滑念珠菌临床分离株对氟康唑耐药的分子机制

目的 明确光滑念珠菌临床分离株对氟康唑耐药的主要分子机制.方法 采用实时荧光定量RT.PCR技术对光滑念珠菌临床分离株ERG11、CDR1和CDR2基因表达的mRNA进行相对定量,比较氟康唑耐药株与敏感株基因表达水平的差异.结果 在光滑念珠菌氟康唑耐药株、剂量依赖性敏感株及敏感株中,ERG11基因mRNA相对表达量分别为:121.4±96.8、102.9±78.8、51.2±20.7:CDR1基因mRNA相对表达量分别为:3.1±1.4、1.9±0.7、1.1±0.4;CDR2基因mRNA相对表达量分别为:3.7±2.2、3.4±2.4、1.9±0.9.耐药株ERGll基因mRNA表达量高于敏感株(P=0.041);耐药株(P<0.001)和剂量依赖性敏感株(P=0.009)CDR1基因mRNA表达量均高于敏感株;耐药株CDR2基因mRNA表达量高于敏感株(P=0.018).随着光滑念珠菌对氟康唑敏感性的降低,ERG11、CDR1及CDR2基因mRNA的表达量均不同程度上升.结论 ERG11、CDR1及CDR2基因mRNA的上调表达与光滑念珠菌临床分离株对氟康唑的耐药性有关,ERG11、CDR1及CDR2基因上调表达是光滑念珠菌临床分离株对氟康唑耐药的主要分子机制.     

幽门螺杆菌对呋喃唑酮的耐药状况及耐药机制的研究

目的了解福建省福州地区上消化道疾病患者幽门螺杆菌（Helicobacter pylori,H．pylori）对呋喃唑酮的耐药情况,探讨H．pylori对呋喃唑酮的耐药机制。方法分离培养获得63株H．pylori,用琼脂稀释法进行体外抗生素敏感试验,检测H．pylori对呋喃唑酮的耐药率,挑选出耐药菌株,提取细菌DNA,PCR扩增porD、oorD基因,PCR产物扩增后测序,比较耐药菌株和标准菌株的基因序列。结果共检测出4株耐药菌株,福州地区H．pylori对呋喃唑酮的耐药率为6．35％,呋喃唑酮耐药与年龄无关。PCR从H．py—lori基因组DNA中扩增出592bp的H．pyloriporD基因和465bp的H．pylorioorD基因,与标准菌株的基因序列比较,耐药H．pylori的porD基因和oorD基因出现点突变。结论福州地区H．pylori对呋喃唑酮的耐药率较低,porD和oorD基因突变可能与H．pylori对呋喃唑酮的耐药有关。     

胃癌和消化性溃疡患者幽门螺杆菌临床菌株硫氧还蛋白1表达量分析

背景：幽门螺杆菌（H．pylori）与胃部疾病密切相关,多种H．priori毒力因子参与其致病,前期研究发现分离自不同胃部疾病的Hpylri临床菌株硫氧还蛋白（亿）表达水平存在明显差异。目的：比较分离自不同胃部疾病的H．pvlori临床菌株的TrxlmRNA表达情况。方法：胃镜获取胃窦黏膜组织,分离培养获得15例慢性胃炎、13例消化性溃疡、13例胃癌患者的H．pylori临床菌株。实时荧光定量RT—PCR检测各组H．priori临床菌株的Trx1mRNA表达量．并筛选Trx1高、低表达量界值。结果：胃癌组和消化性溃疡组H．priori临床菌株的Trx1mRNA表达量明显高于慢性胃炎组（P〈0．05）,胃癌组与消化性溃疡组间比较差异无统计学意义（P〉0．05）。△Ct的90％CI为8．86～28．05．即ACt〈8．86为Trx1高表达．ACt〉28．05为Trx1低表达。结论：分离自胃癌和消化性溃疡患者的H．pylori临床菌株高表达Trx1mRNA,提示其可能与H.pylori以的致病性有关。筛选的Trx1高低表达量界值可用于后续研究。     

细菌DNA图谱分析幽门螺杆菌阳性病人治疗后的复发和再感染

目的：分析和比较幽门螺杆菌（Ｈｐ）感染病人前和治疗后胃内分离到的细菌ＤＮＡ图谱。方法：用随机扩增多形态ＤＮＡ技术（ＲａｎｄｏｍａｍｐｌｉｆｉｅｄｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃＤＮＡ，ＲＡＰＤ）检测９对Ｈｐ菌株，多聚酶链反应采用１０个碱基对的随机引物。结果：不同Ｈｐ菌株ＤＮＡ图谱显示极大差异性。６对细菌ＤＮＡ图谱治疗前与治疗后相同，提示病人感染同一细菌，１对细菌ＤＮＡ图谱治疗前与治疗后相似，提示病人体内Ｈｐ的ＤＮＡ经抗生素治疗后可能发生变异，２对细菌ＤＮＡ图谱治疗前与治疗后显著不同，提示病人感染不同细菌。结论：Ｈｐ感染病人经抗生素治疗转阴后若又重复感染，多数情况是病人感染同一Ｈｐ菌株，有少数病人再感染不同株Ｈｐ。     

Determination of mutations of the 23S rRNA gene of Helicobacter pylori by allele specific primer-polymerase chain reaction method

BACKGROUND AND AIMS: Susceptibility to clarithromycin of Helicobacter pylori (H. pylori) is caused by single nucleotide polymorphisms (SNPs) of the 23SrRNA gene. Allele specific primer-polymerase chain reaction (ASP-PCR) is one of the methods for determining SNPs, which can measure SNPs easily within a short period by PCR amplification alone without digestion with restriction enzymes. The aim of the present study was to develop the ASP-PCR assay for determining SNPs at positions 2,142 and 2,143 of the 23S rRNA gene of H. pylori. METHODS: In total, 112 patients with H. pylori infection based on positive results of a rapid urease test (RUT) were enrolled in the study. Thirty-five had failed to eradicate H. pylori by a clarithromycin-based regimen. DNA was extracted from the RUT-positive gastric tissue samples. SNPs from adenine to guanine at positions 2,142 and 2,143 of the 23S rRNA of H. pylori (A2,142G and A2,143G) were determined by the ASP-PCR method. Minimum inhibitory concentrations (MICs) of clarithromycin for H. pylori were also measured. RESULTS: Forty-nine of 112 patients were infected with wild-type strains of H. pylori. Thirty-nine patients were infected with strains with A2,143G mutations. Twenty-three patients were infected with both wild-type strains and those with A2,143G mutations. Only one patient was infected with the strain with A2,142G mutation. H. pylori strains with A2,143G or A2,142G mutation had significantly higher MICs for clarithromycin. CONCLUSION: The ASP-PCR assay for 23S rRNA mutation of H. pylori is a useful method to detect clarithromycin-resistant strains of H. pylori easily.     

幽门螺杆菌感染个体中菌株基因多态性的研究

幽门螺杆菌(H.pylori)感染的临床结局与宿主易感性、环境因素和菌株的基因多态性相关。了解感染个体中菌株的基因多态性，有助于阐明H.pylori感染的影响因素、致病机制和治疗后复发等问题。目的：研究同-H.pylori感染个体中的菌株是否存在基因多态性。方法：分别从14例临床H.pylori感染者的胃窦活检标本中分离、培养H.pylori,从每例菌株中分离出10个单克隆菌株。从分离自另7例患者胃窦和胃体活检标本的配对菌株中各分离出1个单克隆菌株。采用随机扩增多态性DNA(RAPD)指纹分析方法检测H.pylori菌株的基因多态性。结果：分离自不同感染个体的H.pylori菌株的RAPD指纹图有显著差异。大多数来自同一胃活检部位或同一感染个体的单克隆菌株的RAPD指纹图相同或十分相似，仅少数单克隆菌株的指纹图存在差异。结论：不同H.pylori感染个体所携带菌株的基因型存在显著多态性，同一个体携带的H.pylori菌株基因型相对均一。     

Phenotypic and genotypic characterization of Helicobacter pylori from patients with and without peptic ulcer disease

BACKGROUND: Helicobacter pylori plays an important role in peptic ulcer disease, although not all H. pylori-infected persons will develop a peptic ulcer. Currently, H. pylori strains cannot be divided into commensals and pathogens. METHODS: Fifty H. pylori strains were cultured from patients divided into five groups on the basis of upper endoscopic findings: gastric ulcer, duodenal ulcer, gastritis, esophagitis, or normal. The ultrastructural adherence pattern in vivo, autoagglutination, hemagglutination, adhesion to human gastric adenocarcinoma (AGS) cells, and the lipopolysaccharide (LPS) profile of H. pylori strains were recorded; randomly amplified polymorphic DNA (RAPD) and urease gene typing were performed and correlated with diagnostic groups. RESULTS: Electron micrographs showed that H. pylori strains from patients with gastric ulcers adhered more frequently through filamentous strands and were less frequently found free in mucus than any other diagnostic group (P < 0.0001). Neither median hemagglutination titer nor median adhesion capacity to a human gastric adenocarcinoma cell line was related to endoscopic findings. Nevertheless, H. pylori strains from patients with gastric ulcers were more prone to autoagglutinate than were strains from the other diagnostic groups (P = 0.03). H. pylori strains from gastric ulcer patients were found to be more homogeneous, as determined by RAPD and urease gene typing, than strains from the other diagnostic groups (P < 0.01). In addition, a positive correlation was found between a patient's age and the adhesion to AGS cells of the patient's H. pylori strain (P = 0.006). CONCLUSION: A combination of an H. pylori autoagglutination test, RAPD, and urease gene typing may be useful in separating gastric ulcer-related strains from duodenal ulcer-related and non-ulcer dyspepsia-related strains.     

不同疾病来源的幽门螺杆菌菌株对AGS细胞动力学的影响

体内外研究发现，幽门螺杆菌(H.pylori)感染可促进胃黏膜上皮细胞增殖或触发细胞凋亡，从而引起细胞动力学改变，而菌株的差异可导致不同的结果。目的：通过体外实验观察不同疾病来源的H.pylori菌株对人胃癌细胞株AGS的细胞活力、细胞凋亡和细胞周期的影响，以确定不同疾病来源H.pylori菌株的细胞毒性是否存在差异。方法：采用聚合酶链反应(PCR)鉴定分离自胃癌和胃炎患者的H.pylori菌株的毒力基因和相关亚型。将AGS细胞分别与H.pylori菌株共培养，采用四唑蓝(MTT)比色法检测细胞活力，流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期。结果：cagA、uacA、iceA和babA2基因和相关亚型在胃癌和胃炎H.pylori菌株中呈均匀分布。不同菌株抑制AGS细胞活力和促进细胞凋亡的能力虽有强弱差别，但胃癌菌株与胃炎菌株之间不存在整体上的差别。多数H.pylori菌株能抑制AGS细胞周期的G1/S期转换。结论：不同H．pytori菌株对共培养的AGS细胞动力学的影响存在差异，但胃癌菌株与胃炎菌株的细胞毒性无整体上的差别。     

广东地区幽门螺杆菌cagA基因与细菌定植及其致病性关系的研究

目的：分析广东地区细胞毒素相关基因（cagA）在幽门螺杆菌（H.pylori)中的分布情况及其与患者性别、年龄的关系；探讨H.pylori cagA在不同胃肠疾病发生中的作用及其与胃粘膜慢性炎症程度及H.pylori定植密度的关系。方法：采用改良Skirrow培养基分离培养得到191株H.pylori，用特定引物对各株细菌的cagA 3′端行聚合酶链反应（PCR）扩增鉴定；对其中83例患者再各取胃窦粘膜2块，经HE及Giemsa染色后观察胃粘膜慢性炎症程度及H.pylori定植密度。结果：广东地区H.pylori cagA阳性者占85.3%(163/191)；H.pylori cagA阳性率与患者的性别、年龄无关；消化性溃疡及胃癌患者的H.pylori cagA阳性率显著高于慢性胃炎患者；cagA阳性H.pylori菌株在胃粘膜表面的定植密度较cagA阴性菌株更高，引起的胃粘膜慢性炎症也更为严重；H.pylori的定植密度与其引起的慢性炎症程度呈正相关。结论：广东地区cagA阳性H.pylori感染者占绝大多数；cagA阳性菌株较cagA阴性菌株具有更强的致病力，可能引起更为严重的胃肠道损害。