维甲酸诱导基因-I诱导干扰素的产生在乙型肝炎病毒感染清除中的作用

目的探讨维甲酸诱导基因-I(RIG-I)在诱导HBV感染IFN产生中的影响,以期对阐明乙型肝炎慢性化机制,寻找新的治疗靶点提供新的思路。方法以RIG-I表达载体flagRIG-l-ful1转染培养6孔板中的HepG2、HepG2.2.15,24h后用水疱性口炎病毒(VSV)感染细胞,然后在0、8、16和24h收集细胞及培养上清液,采用quantitive RT-PCR、Western印迹检测RIG-I、MDA5、IPS-1、ISG54等基因的表达,ELISA检测培养上清液中分泌的IFN-β水平。结果 HepG2.2.15细胞在VSV感染后IFN-β分泌水平(11.18±1.34)pg/mL明显低于HepG2细胞(275.50±22.97)pg/mL(P<0.01);通过质粒flagRIG-I-ful1转染高表达RIG-I后,HepG2.2.15分泌IFN-β的能力恢复至(548.78±57.99)pg/mL与HepG2细胞(532.10±39.34)pg/mL接近的水平(P=0.7013)。结论 HepG2.2.15细胞感染VSV后IFN产生障碍,高表达RIG-I后IFN表达水平得到恢复,提示RIG-I功能缺陷导致抗病毒免疫应答降低,RIG-I可能在HBV感染清除中起重要作用。     

香烟烟雾对小鼠肺泡巨噬细胞 RIG-I 样受体功能影响的研究

目的：探讨吸烟对肺泡巨噬细胞 RIG-I 样受体介导的信号传导功能。方法制备香烟烟雾提取物(cigarette smoke extract,CSE),用病毒模拟物 Poly(I∶C)及不同浓度 CSE 单独或者联合刺激小鼠肺泡巨噬细胞(MH-S)。收集细胞并抽提 RNA,用实时荧光定量 PCR 检测 RIG-I、MDA-5、干扰素β(IFN-β)、IL-1及 IL-6 mRNA 表达水平。结果单独的 CSE 刺激能引起 IL-1、IL-6 mRNA 等炎症细胞因子的水平升高,而对 RIG-I、MDA-5及 IFN-βmRNA 几乎无影响;CSE 能够抑制 Poly(I∶C)刺激引起的 RIG-I、MDA-5受体及分子 IFN-β、IL-1、IL-6增高现象,尤其对 IFN-β mRNA 的抑制最为明显,并且CSE 的这种抑制作用与其浓度呈正相关。结论单独 CSE 刺激 MH-S 细胞可以引起炎症因子的表达水平升高,Poly(I∶C)刺激引起的 RIG-I 样受体抗病毒信号通路中相关受体、IFN 及炎症因子表达水平增高现象可以被 CSE 抑制,巨噬细胞对病毒防御功能的减低可能与吸烟抑制 RIG-I 样受体信号通路功能有关。     

e抗原阳性慢性乙型肝炎患者外周血树突状细胞Toll样受体3的表达及意义

目的探讨Toll样受体3（TLR3）的表达与HBV感染后宿主免疫清除障碍的关系。方法选取轻度CHB患者50例,健康对照者48名,其外周血用免疫磁珠细胞分选法获得纯化的CD14^＋单核细胞,用RPMI 1640培养基培养,并且用人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和hIL-4诱导单核细胞成为未成熟的髓样树突状细胞（mDC）,加入聚肌胞刺激后获得成熟的mDC。分别在剌激后0、12、24、48h用流式细胞仪检测TLR3、CD86、HLA-DR和CD1a的表达,实时PCR检测TLR3的表达变化。结果健康对照组中mDC在刺激后24h,TLR3表达较0 h时上调显著（P〈0.05）,48h时TLR3的表达与0h相比差异无统计学意义（P〉0.05）;患者组在刺激后12、24h TLR3的表达与0h时相比,上调不明显,48h时TLR3的表达显著上调（P〈0.05）。实时PCR检测mDC上TLR3 mRNA结果发现,对照组TLR3 mRNA在刺激后12h的表达水平较0h显著上升（P〈0.05）,也显著高于患者组刺激后0、12、24h的表达水平;患者组刺激后48h的TLR3 mRNA表达水平较0h显著上升（P〈0.05）。与0h比较,健康对照组在刺激后12、24h和48h,CD86的表达水平显著高于患者组（P〈0.05）。患者组与对照组间CD1a和HLA-DR的表达差异无统计学意义。结论慢性HBV感染者mDC受聚肌胞刺激后TLR3表达异常,协同刺激因子CD86表达低下,可能造成宿主对HBV感染的免疫清除障碍,导致疾病慢性化。     

乙型肝炎肝硬化患者外周血单个核细胞Toll样受体4的变化

目的探讨乙型肝炎肝硬化患者外周血单个核细胞TLR4的变化及意义。方法用流式细胞仪检测30例健康人、40例乙型肝炎肝硬化和30例慢性HBV携带者外周血单个核细胞表面TLR4的表达,采用ELISA法检测血清IL-6水平。结果乙型肝炎肝硬化患者TLR4及IL-6水平分别为13.5±4.6 MFI和80.5±36.5ng/L,均高于正常人（P〈0.01）;慢性HBV携带者TLR4水平为3.8±1.8MFI,与正常人无显著性差异（P〉0.05）,IL-6水平为45.6±36.8ng/L,明显升高（P〈0.01）;乙型肝炎肝硬化患者TLR4表达与IL-6水平呈正相关（γ=0.768,P〈0.01）,而HBV携带者TLR4表达与IL-6水平无显著性相关（γ=-0.775,P〉0.05）;乙型肝炎肝硬化患者TLR4表达及IL-6水平随着Child分级升高而依次升高。结论 TLR4可能与乙型肝炎肝硬化的发病及进展相关。     

e抗原阳性慢性乙型肝炎患者外周血树突状细胞干扰素β的表达

目的探讨慢性乙型肝炎患者树突状细胞干扰素β（IFN—β）表达与乙型肝炎病毒（HBV）感染后宿主免疫清除障碍的关系。方法选择e抗原阳性慢性乙型肝炎患者52例，健康对照48例，用免疫磁珠细胞分选乙型肝炎e抗原（HBeAg）法从外周血获得纯化的CD14^＋单核细胞，并用hOMCSF、hIL-4诱导单核细胞成为未成熟的髓样树突状细胞（mDC），加入polyI：C（25ug／ml）刺激后获得成熟的mDC，在刺激后0h、12h、24h、48h用流式细胞仪检测细胞表面分化抗原CD86、HLA-DR、CD1a，real—time PCR检测IFN8的表达变化。用ELISA方法检测mDC细胞上清液中IFN-β、IL-12、IL-10的浓度变化。结果两组mDC上0h IFN-β mRNA表达水平及细胞上清液中IFN—β浓度差异无统计学意义（P〉0．05）。健康对照组mDC在12hIFN—β mRNA表达水平及IFN-β浓度与0h相比显著升高（P〈0．05），较患者组0h、12h、24h、48h IFN—β表达显著升高（P〈0．05）。而患者组mDC刺激后12h、24h和48hIFN—β mRNA及IFN-β表达水平与0h相比无显著变化。与0h比较，健康对照组12h、24h、48hCD86表达水平较患者组显著上升（P〈0．05）。两组之间CD1a、HLA—DR表达差异无统计学意义。二组IL-10及IL-120h表达水平差异无统计学意义（P〉0．（15），患者组IL-10表达24h及48h与0h相比明显上升（P〈0．05）。而对照组12h、24h、48hIL-10表达水平没有明显上升。与之相反，患者组12h、24h、48hIL-12表达与0h相比表达水平没有明显上升，对照组在12hIL-12表达水平与0h相比差异有统计学意义（P〈0．05），24h、48hIL-12表达水平继续升高（P〈0．05）。结论慢性HBV感染者mDC受polyI：C刺激后IFN-β表达异常，协同刺激因子CD86表达低下，可能造成宿主对HBV感染的免疫清除障碍，导致疾病慢性化。     

脂多糖对大鼠肺泡巨噬细胞Toll样受体4和髓样分化蛋白-2基因表达及炎性因子分泌的影响

目的 探讨脂多糖刺激大鼠肺泡巨噬细胞株NR8383细胞Toll样受体4(TLR4)、髓样分化蛋白-2(MD-2)mRNA表达和炎性因子分泌的影响,以及MD-2小干扰RNA(MD-2 siRNA)对脂多糖刺激下NR8383细胞炎性因子分泌的作用.方法 体外培养NR8383细胞,以不同浓度脂多糖(0.01～10 mg/L)刺激2 h,以1 mg/L脂多糖刺激2～24 h.运用脂质体Lipofectamine 2000将MD-2siRNA转染至细胞.半定量RT-PCR方法检测细胞TLR4和MD-2 mRNA的表达,酶联免疫吸附法检测细胞培养上清中肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-6和IL-1β的含量.统计学处理采用单因素方差分析、独立样本t检验和Pearson相关分析.结果 对照组NR8383细胞TLR4和MD-2mRNA的相对表达量分别为0.52±0.05和0.44±0.09,0.01 mg/L浓度脂多糖刺激前后表达量无明显改变,0.1 mg/L浓度时表达增加,随脂多糖浓度的升高表达量进一步增加,10 mg/L刺激后相对表达量分别为0.72±0.06和0.65±0.10(F=17.26、6.04,P<0.01);TNF-αIL-6和IL-1β含量具有类似改变趋势,对照组分别为(25.8±3.4)ng/L、(62.4±4.7)ng/L和(31.6±1.7)ng/L;在10 mg/L脂多糖刺激下分别增加至(58.9±5.3)ng/L、(96.5±3.9)ng/L和(55.4±5.4)ng/L(F=29.55、54.47、31.45,P<0.01).在1 mr/L脂多糖刺激下,TLR4和MD-2 mRNA的表达量在2 h后明显增加,6 h达高峰,8 h开始回落,至24 h时仍高于基础值(F=5.28、4.11,P<0.01);TNF-α、IL-6和IL-1β含量具有类似变化(F=10.64、11.23、17.58,P<0.01),其中TNF-α和IL-1β含量在6 h达高峰,持续至8 h,IL-6含量在8 h达高峰,持续至12 h.TLR4和MD-2 mRNA表达呈正相关(r=0.513,P<0.01).MD-2 siRNA对NR8383细胞MD-2基因的干扰效率为67%,在脂多糖刺激下干扰组细胞培养上清液中TNF-α、IL-1β和IL-6水平未见明显升高.结论 高浓度脂多糖可较长时间上调大鼠肺泡巨噬细胞株NR8383细胞TLR4和MD-2基因的表达,并促进TNF-α、IL-6和IL-1β的分泌.MD-2 siRNA可抑制脂多糖刺激下NR8383细胞分泌TNF-α、IL-1 β和IL-6.     

慢加急性肝衰竭患者Toll样受体3触发后DC分泌细胞因子的变化

目的探讨慢加急性肝衰竭（ACLF）患者外周血单核细胞衍生的树突状细胞（MoDC）上TLR3触发后细胞因子的分泌情况。方法选择ACLF患者60例,慢性乙型肝炎（CHB）患者40例,20例健康者作对照组（NC组）,取其抗凝全血,通过密度梯度法离心及免疫磁珠阳性选择法分离单核细胞,体外诱导培养为MoDC,经poly（I︰C）刺激后,实时荧光定量PCR检测TLR3及核因子κB和干扰素调节因子3的表达,液相蛋白流式检测促炎性因子IL-6、IL-8、IL-10、IL-12p70、IL-1β和TNF-α的分泌水平,均数间两两比较采用t检验。结果 poly（I︰C）刺激后,ACLF组患者NF-κBmRNA显著高于CHB组和NC组（P〈0.01）,而其IRF3mRNA低于CHB和NC组（P〈0.01）。3组研究对象MoDC分泌的IL-6及TNF-α差异有统计学意义（P〈0.005）,其分泌水平为ACLF组〉CHB组〉NC组。分泌的IL-10在ACLF组低于CHB组（P=0.021）,但与NC组差异无统计学意义。IL-12p70的分泌水平在ACLF组显著低于CHB组和NC组（P〈0.001）。IL-8分泌水平为ACLF组     

乙型肝炎病毒感染者单核细胞来源的树突状细胞中维甲酸诱导基因-Ⅰ的表达及功能

目的 探讨HBV感染后维甲酸诱导基因-Ⅰ(RIG-Ⅰ)在单核细胞来源的树突状细胞(MoDC)中的表达和功能,并了解RIG-Ⅰ和MoDC在HBV感染疾病进程中的作用.方法 采集28例HBV感染者外周血,21例为慢性乙型肝炎(CHB)患者,7例为急性乙型肝炎(AHB)患者;18例健康志愿者作为对照.采用CD14免疫微珠分离纯化外周血CD14~+单核细胞,用粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和IL-4联合诱导培养7 d成为树突状细胞(DC),用水泡性口炎病毒(VSV)感染刺激RIG-Ⅰ活化.在不同时间点收集细胞抽提RNA,实时定量PCR检测RIG-Ⅰ、干扰素启动子刺激基因1(IPS-1)和IFN-β的表达.正态分布数据采用方差分析,连续性变量两组间比较采用Mann-Whitney U检验,多组间比较采用Kruskal-Wallis检验.结果 VsV感染活化RIG-Ⅰ后,CHB、AHB组和健康对照组的RIG-Ⅰ mRNA表达水平在16 h(2.44±2.03,19.54±3.15.21.48±8.39;F=7.451.P=0.002)和24 h(2.68±2.93,10.31±3.88,14.01±5.04;F=7.908,P=0.001)时差异均有统计学意义;IPS-1在CHB和AHB组中的表达在16 h(2.05±1.08,1.99±1.56)和24 h(2.27±2.16,3.24±1.21)均高于健康对照组(16 h:0.60士0.31,F=7.246,P=0.003;24 h;1.08±0.73,F=13.598,P=0.01).CHB组中IFN-β水平在16 h和24 h均低于AHB组和健康对照组,差异有统计学意义.结论 RIG-Ⅰ和IPS-1在HBV感染者MoDC中的表达明显异常,提示RIG-Ⅰ信号通路可能被HBV干扰,RIG-Ⅰ和MoDC的功能缺陷在HBV感染和慢性化中发挥重要作用.     

HBV对健康产妇脐带血浆细胞样树突状细胞Toll样受体9、干扰素调节因子7、干扰素α表达的影响

目的观察HBV对体外培养的健康产妇脐带血浆细胞样树突状细胞(pDC)Toll样受体(TLR)9、干扰素调节因子(IRF)7、干扰素(IFN)α表达的影响。方法体外培养Hep G 2.2.15细胞,收集各孔Hep G 2.2.15培养上清,超离心HBV病毒颗粒,PCR荧光探针法检测HBV DNA浓度。将培养第7天的pDC与不同载量的HBV(1×105拷贝/ml、1×106拷贝/ml、1×107拷贝/ml和空白对照)共培养24 h。随后每组均加入终浓度为2μg/ml的Cp G ODN 2216继续培养24 h。Real Time-PCR检测pDC中TLR9、IRF7mRNA的表达,Western Blot检测TLR9、IRF7蛋白表达,ELISA法测IFNα水平。计量资料多组间比较采用方差分析,进一步两两比较采用SNK-q检验;对HBV DNA拷贝数取常用对数,相关指标与HBV DNA的常用对数值用Pearson直线相关分析法。结果HBV 1×106拷贝/ml组和1×107拷贝/ml组TLR9 mRNA、IRF7 mRNA、pDC TLR9和IRF7蛋白、IFNα的表达水平明显低于空白对照组及HBV 1×105拷贝/ml组,差异均有统计学意义(P值均0.05)。HBV对pDC TLR9 mRNA、IRF7 mRNA的表达和对pDC TLR9、IRF7蛋白的表达以及对pDC培养上清液IFNα的表达均呈浓度依赖性,HBV DNA载量越高,对TLR9 mRNA、IRF7 mRNA、TLR9和IRF7蛋白、IFNα表达的抑制效果越强(r值分别为-0.729、-0.761、-0.657、-0.703、-0.803,P值均0.05)。结论 HBV体外干预后,正常pDC TLR9、IRF7 mRNA及蛋白表达下降,从而导致其下游IFNα的分泌减少。HBV能抑制正常pDC功能,导致HBV持续感染。     

乙型肝炎病毒干预后小鼠肝脏树突状细胞P-干扰素调节因子3表达的研究

目的 研究HBV干预后小鼠肝脏树突状细胞P-干扰素调节因子3及其下游Ⅰ型干扰素表达的变化.方法用免疫磁珠分选法分离肝脏树突状细胞,并用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和白细胞介素4在24孔板中诱导培养.用超离心技术获得HBV,并用实时荧光定量PCR检测.第5天将培养的树突状细胞分为2组:HBV组与HBV共同培养,对照组加入等量的细胞培养液.24 h后,两组均加入聚肌胞刺激,收集0、1、2、6、24 h的细胞和上清液,用Western blot检测P-干扰素调节因子3的表达情况,用酶联免疫吸附法检测上清液中干扰素β的浓度.组间比较用t检验.结果 0h时HBV组培养液上清液干扰素β浓度[(12.38 ±3.71)pg/ml]与对照组[(10.83±4.11)pg/ml]比较,差异无统计学意义(P>0.05).聚肌胞刺激后6 h,HBV组培养液上清液干扰素β浓度[(88.67±9.01)pg/ml]与对照组[(137.68±12.28)pg/ml]比较,t=9.653,P<0.01,差异有统计学意义.聚肌胞刺激后24h,HBV组培养液上清液干扰素β浓度[(69.89±5.80)pg/ml]与对照组[(72.25±8.61)pg/ml]比较,差异无统计学意义(P>0.05).聚肌胞刺激小鼠肝脏树突状细胞后P-干扰素调节因子3表达逐渐增强.经HBV干预在感染时病毒与细胞数量的比值为25,24 h后再用聚肌胞刺激2 h,HBV组P-干扰素调节因子3表达较对照组减弱.结论 HBV干预后小鼠肝脏树突状细胞P-干扰素调节因子3及其下游Ⅰ型干扰素表达均下调.

Abstract：

Objective To detect the secretions of type Ⅰ interferon and the expressions of phospho-IRF3 in murine liver dendritic cells intervened by HBV.Methods The murine liver dendritic cells were isolated via anti-CD11c microbeads and were incubated in the presence of GM-CSF and IL-4 to induce the DC generation and proliferation in 24-well cell culture plates.HBV virions were isolated via ultracentrifugation and were detected by quantitative Realtime-PCR.The DCs were divided into two groups:one group was cultured with HBV virions for 24 hours,the other group was cultured without HBV as control group.The cells were harvested at Oh,1h,2h,6h and 24h after being stimulated with poly I:C and the expressions of pIRF3 and the concentration of IFN β in supematants were detected with western blot and ELISA respectively.Results The IFN β concentrations at 0h,6h and 24h in the supernatants of the RBV group and the control group were(12.38±3.71)pg/ml,(88.67±9.01)pg/ml and(69.89±5.80)pg/ml vs(10.83±4.11)pg/ml,(137.68 ± 12.28) pg/ml and (72.25 ± 8.61) pg/ml,respectively. No statistical differences found at 0 h (t =0.8398,P > 0.05) and 24 h (t = 0.6820,P > 0.05) between the two groups except that at 6 h (t = 9.653,P <0.01). The expressions of phospho-IRF3 in HBV group were lower than that in control group. Conclusions The type Ⅰ interferon secretion and the phospho-IRF3 expression were decreased in murine liver dendritic cells when intervened by HBV.     

呼吸道合胞病毒感染巨噬细胞活化Toll样受体3介导的抗病毒作用研究

目的探讨呼吸道合胞病毒(RSV)感染巨噬细胞(RAW264.7细胞)后,Toll样受体3(TLR3)的水平变化及其介导产生的I型干扰素的抗病毒作用。方法 RSV感染体外培养的小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞,并给予TLR3特异性抗体处理,分别于感染的4、8、12、16和24h后收集各组细胞。以未感染病毒的细胞为对照组。用Trizol提取细胞总RNA,半定量RT-PCR法检测TLR3、干扰素α(IFN-α),干扰素β(IFN-β),RSVF蛋白的mRNA表达量变化。结果 (1)RSV感染RAW264.7细胞后,TLR3、IFN-α、IFN-β、RSVF蛋白的mRNA表达量均升高且有时间依赖性,TLR3mRNA24h表达量是基础表达量的6倍多,IFN-α,IFN-βmRNA24h表达量是基础表达量的4倍多,RSVF蛋白mRNA是基础表达量的近1.8倍。(2)预先给予TLR3抗体处理以抑制TLR3受体后,再行RSV感染,IFN-α和IFN-β的mRNA表达量虽有升高,但较感染组相比均有下降,mRNA表达在12h后显著降低,且IFN-β的mRNA表达量下调更明显。但RSVF基因的mRNA表达在12h后升高有统计学差异,24h升高有显著性差异。结论 RSV感染RAW264.7巨噬细胞后可上调TLR3表达,其活化细胞介导产生的I型干扰素起抗病毒作用,在一定程度上可抑制病毒的增殖水平。     

TLR4/NF-κB信号通路在ox-LDL诱导的血管平滑肌细胞分泌MCP-1中的作用

目的:探讨Toll样受体4/核因子-κB(TLR4/NF-κB)信号通路在氧化性低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导的血管平滑肌细胞(VSMCs)分泌单核细胞趋化因子-1(MCP-1)中的作用。方法:取SD大鼠胸主动脉中膜培养血管平滑肌细胞,以2.5mg/L、5.0mg/L、10.0mg/L的TLR4中和抗体(TLR4阻断剂)、5μmol/L、10μmol/L、、20μmol/LPDTC(NF-κB特异性阻断剂)分别进行干预,并分别设置空白对照组和ox-LDL组,观察其对血管平滑肌细胞中ox-LDL诱导的MCP-1表达的影响。结果:与空白对照组比较,ox-LDL组VSMCs MCP-1mRNA及蛋白的表达明显升高(P<0.05);与ox-LDL组比较,用TLR4中和抗体预孵育后Anti-TLR4三组MCP-1mRNA[(1.23±0.21)比(0.81±0.02)、(0.75±0.01)、(0.49±0.01)]及其蛋白的表达[(0.64±0.05)ng/ml比(0.41±0.12)ng/ml、(0.32±0.07)ng/ml、(0.21±0.02)ng/ml]明显降低(P均<0.01),且呈浓度依赖性;用PDTC预孵育后PDTC三组MCP-1mRNA[(1.37±0.19)比(1.02±0.08)、(0.87±0.01)、(0.56±0.02)]及其蛋白的表达[(0.65±0.07)ng/ml比(0.51±0.07)ng/ml、(0.30±0.08)ng/ml、(0.19±0.02)ng/ml]亦明显降低(P均<0.01),且呈浓度依赖性。结论:氧化性低密度脂蛋白是TLR4的内源性配体;氧化性低密度脂蛋白通过或部分通过TLR4/NF-κB信号通路介导血管平滑肌细胞单核细胞趋化因子-1的表达。     

干扰素-α/β受体基因多态性与HBV感染结局的关系

目的：探讨IFN-α/β受体基因多态性与HBV（乙肝病毒）感染不同临床转归之间的相关性。方法：应用基因测序检测80例自限性HBV感染者（SR组）和220例慢性持续性HBV感染者（PC组）[包括无症状HBV携带者（AsC组）88例和进展性肝病者132例（慢性乙型肝炎76例、肝硬化56例）]的IFN（干扰素）-α/β受体基因-568G→C、-408C→T两个位点的多态性,比较各组间基因型和等位基因频率。结果：①-568G→C位点多态性中,PC组总GG基因型频率比SR组显著升高,差异有显著性意义（P〈0.05）。等位基因G的频率,进展性肝病组均显著高于SR组（P〈0.05）。②-408C→T位点多态性中,进展性肝病组总CC基因型显著高于SR组（P〈0.05）,而肝硬化组和慢性乙型肝炎组之间,SR组和AsC组之间差异均无显著性。结论：IFN-α/β受体基因-568G→C、-408C→T两个位点的多态性,与HBV感染不同结局之间有关,携带-568G→C GG基因型和G等位基因的HBV感染者容易发展为慢性,G等位基因更趋向于进展性肝病,而携带-408C→T CC基因型患者则容易进展为慢性乙型肝炎甚至肝硬化。     

A synthetic double-stranded RNA, poly I:C, induces a rapid apoptosis of human CD34(+) cells

Toll-like receptor 3 (TLR3), retinoic acid-inducible gene I, and melanoma differentiation-associated antigen 5 (RIG-I/MDA-5) helicases are known to sense double-stranded RNA (dsRNA) virus and initiate antiviral responses, such as production of type-I interferons (IFNs). Recognition of dsRNA by TLR3 or RIG-I/MDA-5 is cell-type-dependent and recent studies have shown a direct link between TLRs and hematopoiesis. We hypothesized that viral dsRNA recognized by either TLR3 or RIG-I/MDA-5, affects the growth of human hematopoietic stem/progenitor cells. Here we show that polyinosinic polycytidylic acid (poly I:C)-mediated very rapid apoptosis occurs within 1 hour in CD34(+) cells in a dose-dependent manner. Polyadenylic-polyuridylic acid, another synthetic dsRNA that signals only through TLR3, had no effect. Poly I:C-LMW/LyoVec, a complex between low molecular-weight poly I:C and the transfection reagent LyoVec, which signals only through RIG-I/MDA-5, induces apoptosis of CD34(+) cells. A strong and sustained upregulation of messenger RNA and protein levels of Noxa, a proapoptotic BH3-only protein that can be induced by RIG-I/MDA-5 pathway, is found in CD34(+) cells treated by poly I:C. Although poly I:C upregulates type-I IFNs in CD34(+) cells, neither exogenous IFN-α nor IFN-β induces rapid apoptosis in CD34(+) cells and neutralization or blocking of type-I IFN receptor does not rescue CD34(+) cells, whereas Z-VAD, a pan-caspase inhibitor, rescues the cells from apoptosis. These results suggest that RIG-I/MDA-5, but not TLR3, signaling triggers poly I:C-induced rapid apoptosis of human CD34(+) cells, which will provide an insight into the mechanisms of dsRNA virus-mediated hematopoietic disorders.     

长期吸入糖皮质激素对慢性阻塞性肺疾病患者诱导痰Toll样受体2表达的影响

目的:评价长期吸入糖皮质激素的治疗对重度慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者诱导痰巨噬细胞Toll样受体2(TLR2)的表达是否产生影响。方法:收集2010年3月到2011年8月上海交通大学医学院附属瑞金医院呼吸科门诊就诊的有长期吸烟史的男性稳定期重度COPD患者,根据是否长期使用吸入型激素(≥500μg/d丙酸氟替卡松,疗程≥1年)分为使用吸入激素组和未使用吸入激素组。通过流式细胞检测技术测定2组患者诱导痰巨噬细胞表面和细胞内TLR2的表达,并将痰细胞抽提mRNA转录cDNA后进行实时定量PCR检测,检测TLR2和肿瘤坏死因子(TNF)αmRNA的表达情况。比较2组间的差异。结果:诱导痰巨噬细胞细胞表面TLR2的表达在规律使用吸入激素组显著低于未用吸入激素组(5.35±1.67比12.81±4.89,P=0.019)。实时定量PCR检测TLR2 mRNA、炎症介质TNF-αmRNA水平在2组患者间的差异无显著意义。而TLR2细胞内与细胞表面表达水平之间(r=0.654,P=0.017),TNF-αmRNA与TLR2细胞表面蛋白表达水平之间(r=0.716,P=0.012)均有显著相关性。结论:长期吸入糖皮质激素治疗重度COPD可能会导致呼吸道局部TLR2的表达下降,这可能是患者局部抗感染免疫降低的原因之一。     

乙型肝炎病毒感染者外周血单个核细胞内IL-2、IL-4和IFN-γ检测及意义

目的研究辅助性T淋巴细胞Th1/Th2细胞与乙型肝炎病毒（HBV）感染状态的关系。方法 25例慢性乙型肝炎患者（CHB组）、5例健康志愿者（健康对照组）、5例HBV感染后自然痊愈者（既往感染组）及5例CHB抗病毒治疗后完全应答者（完全应答组）的外周血单个核细胞（PBMC）经PMA诱导后,用流式细胞术检测其Th1和Th2细胞分泌IL-2、IL-4和IFN-γ的水平。结果慢性乙型肝炎患者Th1细胞分泌的细胞因子IFN-γ（0.1602±0.0657）、IL-2（0.1616±0.0639）,明显低于健康对照IFN-γ（0.4680±0.0377）、IL-2（0.5000±0.0625）和既往感染者IFN-γ（0.336±0.2908）、IL-2（0.256±0.17799）（P〈0.001）。CHB抗病毒治疗完全应答患者Th1细胞分泌的细胞因子IFN-γ（0.1620±0.0396）、IL-2（0.1940±0.0416）,亦明显低于健康对照（P〈0.001）,Th2细胞分泌的细胞因子IL-4（0.5096±0.1329）,明显高于健康对照IL-4（0.2820±0.0622）（P〈0.001）。既往感染者Th1细胞分泌的细胞因子IFN-γ（0.336±0.29082）、IL-2（0.256±0.17799）低于健康对照（P〈0.001）,Th2细胞分泌的细胞因子IL-4（1.29±0.16778）明显高于健康对照组、CHB患者组和HBV感染完全应答患者组（0.2820±0.0622、0.5096±0.1329、0.5740±0.06693）（P〈0.001）。结论 Th1/Th2细胞的功能与HBV感染的发展过程相关。     

人参皂甙Rbl对阿霉素心力衰竭大鼠心肌细胞Toll样受体的影响

目的：探讨人参皂甙Rbl （Gs-Rb1）减轻阿霉素所致的慢性心力衰竭（CHF）效应是否与抑制 Toll样受体（TLRs）有关。方法：阿霉素慢性心力衰竭（CHF）大鼠随机分为阿霉素组（15例）和Gs-Rbl组（70 mg/kg · d ,17例）,另设正常对照组（10例）。乳鼠心肌细胞亦随机分为对照组、阿霉素组（1μmol/L ）和 Gs-Rbl组（1μmol/L阿霉素＋200μmol/L Gs-Rbl）。干预完毕后,评定心脏超声, Toll样受体2和 Toll样受体4蛋白和基因。结果：（1）体内、体外研究均显示,阿霉素组TLR2蛋白和mRNA表达较对照组显著升高, Gs-Rbl组TLR2蛋白[（0.593±0.018/0.344±0.024）比（0.975±0.022/0.564±0.031）]和mRNA [（0.349±0.015/0.401±0.021）比（0.576±0.029/0.853±0.043）]表达较阿霉素组显著下降, P均＜0.01;（2）不管是体内抑或是体外研究,阿霉素组TLR4蛋白和mRNA表达较对照组显著升高, Gs-Rbl组 TLR4蛋白[（0.371±0.013/0.254±0.027）比（0.654±0.032/0.519±0.013）]和mRNA [（1.140±0.021/0.503±0.022）比（1.602±0.013/0.838±0.021）]表达较阿霉素组显著下降, P均＜0.01。结论：阿霉素可能通过TLR2和TLR4促发慢性心力衰竭进程,人参皂甙Rbl改善阿霉素慢性心力衰竭效应与抑制T L R2和T L R4有关。     

慢性乙型肝炎患者血清磷脂酰肌醇-4-磷酸酶的表达与HBV DNA载量的相关性

目的探讨慢性乙型肝炎患者血清磷脂酰肌醇-4-磷酸酶(PI4KA)表达与HBV载量的关系。方法收集2012年6月-2013年4月在青岛市立医院就诊的180例慢性乙型肝炎患者的血清,利用荧光定量PCR检测其HBV DNA的载量,根据其HBV DNA载量的高低,分为3组,每组60例:高病毒载量组(HBV DNA1×107拷贝/ml)、中病毒载量组(1×105拷贝/ml≤HBV DNA≤1×107拷贝/ml)及低病毒载量组(HBV DNA1×105拷贝/ml),同时以60名健康人作对照。采用ELISA法,检测各组外周血清中的PI4KA的浓度。多组间血清HBV DNA定量的比较采用单因素方差分析,进一步两两比较采用LSD-t检验。PI4KA水平与HBV DNA载量之间的相关性分析采用Spearman检验。结果健康人血清PI4KA的浓度为(2.29±0.75)ng/ml;低、中、高病毒载量组血清PI4KA的浓度分别为(2.73±0.71)、(3.52±0.78)及(4.72±0.77)ng/ml。慢性乙型肝炎患者不同病毒载量组与健康对照组间血清PI4KA的浓度差异有统计学意义(F=119.958,P0.01),并且不同病毒载量组都显著高于对照组。随着HBV DNA载量的升高,PI4KA的浓度增加,两者呈正相关(r=0.758,P0.01)。结论慢性乙型肝炎患者血清PI4KA的浓度与HBV DNA载量密切相关,这一结果提示PI4KA可能在HBV DNA的复制中起到重要作用。     

γ干扰素和转化生长因子β水平与支气管结核治疗效果的关联性研究

目的 探讨血清和支气管灌洗液中γ干扰素(IFN-γ)和转化生长因子β(TGF-β)水平与支气管结核（EBTB）治疗效果之间的关联性。 方法 采用酶联免疫吸附（ELISA）方法测定78例EBTB患者支气管镜下介入治疗前后血清和支气管灌洗液中IFN-γ和TGF-β的水平,以及50名健康对照血清中IFN-γ和TGF-β的水平。EBTB患者被分成2组:一组治疗后表现为支气管狭窄,另一组治疗后未表现为支气管狭窄。 结果 研究显示：（1）与对照组相比,EBTB患者组支气管灌洗液中IFN-γ和TGF-β水平升高。（2）78例EBTB患者治疗后,27例患者显示有支气管的纤维狭窄,51例患者没有支气管狭窄。支气管狭窄组治疗前血清TGF-β水平［（783.21±478.67）pg/ml］比无支气管狭窄组［（1258.60±573.29）pg/ml］低（U=3.8905,P＜0.01）,而支气管灌洗液中TGF-β ［（1219.54±439.27）pg/ml］和IFN-γ ［（2152±1594.33）pg/ml］水平明显高于无狭窄组［（779.24±395.91）pg/ml,（1006.30±752.57）pg/ml］（U值分别为4.3553和3.5315,P值均＜0.01）。 结论 （1）EBTB患者支气管灌洗液中IFN-γ和TGF-β水平升高可能与支气管结核发病机制有关。（2）初始血清TGF-β低水平和支气管灌洗液IFN-γ和TGF-β高水平与治疗后支气管纤维狭窄有关。