细粒棘球蚴线粒体CO1基因的克隆与序列分析

目的 研究细粒棘球蚴(Echinococcus granulasus)种间遗传标记特点,为该虫种的分子分类学研究提供基础。方法 在内蒙古地区从羊肝脏采集细粒棘球蚴,肝包虫病患者手术剥离囊包后,签署知情同意书,采集细粒棘球蚴。提取虫体DNA,扩增线粒体细胞色素氧化酶1(CO1)基因,将其克隆到PGM-T载体后,用PCR技术鉴定阳性菌落,并进行测序,运用DNAstar5.0 软件计算序列间的相似性,计算遗传距离,同时,应用MEGA4.0软件的最大似然法(ML-Maximum Likelihood)和邻接法(NJ-Neighbor Joining)构建系统发育树,进行聚类分析。结果 细粒棘球蚴DNA扩增出的羊株、人株CO1基因序列片段长度为936 bp。同其他亲缘关系较近的属CO1基因序列比对:羊株、人株细粒棘球蚴CO1序列与黄花棘球绦虫的同源性最高,分别为91.9%、91.2%;羊株、人株细粒棘球蚴CO1序列与黄花棘球绦虫位于同一分支,自展值(Boostrap)最高,均为100%。羊株、人株细粒棘球蚴CO1序列所属分支与原头目的Proteocephalus macrocephalus所属分支相隔较远。结论 CO1基因序列稳定保守,无宿主特异性,可作为细粒棘球蚴理想的种间遗传标记。     

青海天峻地区人和羊源细粒棘球蚴流行株基因分型及基因多态性研究

目的 解析青海天峻地区人和绵羊细粒棘球蚴流行株的基因型及基因多态性。方法 根据GenBank公布的细粒棘球绦虫线粒体基因组序列,分别针对cox1和nad1基因设计特异性引物,对16份绵羊源和2份人源细粒棘球蚴分离株样品进行PCR扩增、测序及cox1和nad1基因核苷酸序列多态性和单倍型分析。结果 18株细粒棘球蚴分离株均属于G1型。其中cox1基因单倍型共有9种,变异位点16个,单倍型序列之间碱基差异0~5个,变异率达0.31%;nad1基因单倍型共有7种,涉及变异位点共15个,单倍型序列之间碱基差异1~8个,变异率达0.89%。结论 青海天峻地区人和绵羊细粒棘球蚴流行株为G1型,其cox1基因多态性较nad1基因多态性丰富;cox1基因用于细粒棘球蚴分离株间核苷酸多态性分析的分辨率较高。     

西藏阿里地区细粒棘球蚴人体分离株nad1基因多态性分析

目的了解西藏阿里地区细粒棘球蚴人体分离株的优势基因型及遗传变异情况,为细粒棘球绦虫的溯源及阿里地区棘球蚴病预防控制策略的制定提供支持。方法收集阿里地区某医院2017年棘球蚴病患者病灶切除样品,提取DNA,PCR扩增线粒体NADH脱氢酶1(nad1)基因,扩增产物测序后用BLAST、ClustalX 1.83和MEGA 7.0软件进行同源性和系统进化分析。下载全国细粒棘球蚴人体分离株的nad1基因,利用DnaSP6分析单倍型;利用NetWork软件制作中国细粒棘球绦虫nad1基因的单倍型网络图。结果共收集80例细粒棘球蚴病患者病灶切除样品,其中38份样品PCR扩增出约550 bp的特异性条带。测序分析结果显示,4份样品为细粒棘球绦虫G6基因型,与蒙古人来源的序列(MH300971.1)一致性为99.8%;其余34份样品均为细粒棘球绦虫G1基因型,与标准序列(AF297617.1)相比,其535位的C碱基突变为G碱基,与阿尔及利亚人来源序列(MG672293.1)的一致性为100%。MEGA 7.0软件分析38份样品的序列,结果显示,T、C、A和G碱基占比依次为44.3%~46.5%、7.7%~9.1%、19.8%~21.5%和25.7%~26.0%。我国已报道的细粒棘球绦虫nad1基因共有9个单倍型,单倍型多样性为0.47,核酸多样性为0.19。单倍型网络图显示,H4为我国细粒棘球绦虫nad1基因主要的单倍型。结论细粒棘球绦虫G1、G6基因型是西藏阿里地区的主要基因型,资料分析表明H4为我国流行的细粒棘球绦虫nad1基因的主要单倍型。     

基于线粒体ND6基因检测犬感染细粒棘球绦虫的粪便PCR方法

目的 旨在了解动物包虫病流行区内犬细粒棘球绦虫的感染情况。方法 本研究利用Qiagen DNeasy Powersoil试剂盒对犬粪提取DNA,并从细粒棘球绦虫线粒体全基因组中筛选出完整线粒体ND6基因作为靶基因,建立一种可对犬粪中细粒棘球绦虫同时进行检测及基因分型的PCR方法。结果 该法特异性很高,仅能扩增出细粒棘球绦虫的目的条带而对照组均无条带扩增。其灵敏度达到4 pg的DNA含量。当犬人工感染约50 000只原头蚴时,该法最早可以扩增出感染第13 d粪便中的ND6目的基因。同时,对40份随机采自包虫病流行区的待检犬粪进行PCR检测,共有6份样品可扩增出目的条带且其基因型均属G1型,其检测及分型结果均与经典基因分型依据(COX1基因片段)的结果一致。结论 本研究建立的粪便PCR方法具有很高的特异性和灵敏度,并可用于检测犬的细粒棘球绦虫早期感染情况。对于PCR检测阳性者,其产物经测序分析后也可用于细粒棘球绦虫的基因分型及种群遗传结构的分析研究。     

细粒棘球蚴和多房泡球蚴在人体内蛋白质表达谱初步分析

目的 初步掌握流行于青海省细粒棘球绦虫幼虫棘球蚴(原头节、囊壁、囊液)和多房棘球绦虫幼虫泡球蚴在中间宿主人体内蛋白质表达情况。方法 利用SDS-PAGE和 Western-blot分析棘球蚴原头节、囊壁、囊液蛋白质和泡球蚴总蛋白表达谱。结果 细粒棘球蚴原头节的蛋白质浓集在分子量72 kDa处,囊壁的蛋白质浓集在72 kDa、26 kDa和17 kDa 处,囊液的蛋白浓集在72 kDa、43~55 kDa、26 kDa和17 kDa;泡球蚴总蛋白质浓集在分子量72 kDa、55~72 kDa和26 kDa处。结论 不同地区细粒棘球蚴在人体内蛋白的表达存在差异;不同亚种泡球蚴原头节蛋白的表达存在差异。     

细粒棘球绦虫体外不同发育时期EgM9基因差异表达研究

目的 探究EgM9基因在细粒棘球绦虫体外不同发育时期的表达情况。方法 体外培养细粒棘球绦虫原头蚴(protoscoleces,PSCs)向成虫方向发育;收集不同发育时期的虫体,通过H&E染色进行虫体形态学观察;运用荧光定量PCR方法,以β?Actin作为内参基因,使用2-ΔΔCt法计算虫体不同发育时期EgM9基因的表达情况,用SPSS 17.0软件进行单因素方差分析。结果 最终成功建立了细粒棘球绦虫原头蚴向成虫方向发育的体外培养模型,培养虫体至50 d;体外培养的虫体在第50 d时可产生3个节片;体外培养第50 d的虫体EgM9基因的表达量最高,与其他时期虫体表达量差异有统计学意义(F=11.32,P<0.05)。结论 EgM9基因是细粒棘球绦虫成虫阶段高表达的基因,可能与虫体性器官发育有关。     

细粒棘球蚴(Echinococcus granulosus)CO1与ND1基因序列分析

目的 为了明确内蒙古锡林郭勒盟西乌旗羊株和锡林浩特市人株细粒棘球蚴之间的基因型及其遗传变异情况。方法 利用分子生物学技术对采自两地区细粒棘球蚴的线粒体CO1基因与ND1基因进行了克隆和测序,并运用DNAStar5.0中的MegAlign工具对已测出的序列进行了分析。结果 西乌旗羊株细粒棘球蚴与锡林浩特市人株细粒棘球蚴CO1基因片段和ND1基因片段大小分别均为936 bp和895 bp。西乌旗羊株细粒棘球蚴CO1基因序列与新疆羊株细粒棘球蚴的CO1基因序列同源性为99.3%;锡林浩特市人株细粒棘球蚴CO1基因序列与新疆人株细粒棘球蚴的CO1基因序列同源性为98.6%;且西乌旗羊株和锡林浩特市人株细粒棘球蚴ND1基因与国内外已报道的G1型ND1基因序列完全相同。结论 表明内蒙古上述两地区细粒棘球蚴的同源性很高,且基因型均为G1型,这为内蒙古某些地区细粒棘球蚴流行虫株的确定提供了重要依据,同时也对当地细粒棘球蚴病的预防和控制具有重要意义。     

4种猪绦虫蚴的多重PCR鉴别

目的 建立一种多重聚合酶链式反应(multiplex polymerase chain reaction,mPCR)方法,用于快速鉴别猪囊尾蚴等4种猪的绦虫蚴。方法 比较猪带绦虫(Taenia solium)、亚洲带绦虫(Taenia asiatica)、细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus)和泡状带绦虫(Taenia hydatigena)的线粒体基因组,选取tRNA-Val、tRNA-Ala、tRNA-Asp和nad1基因作为分子检测靶标,设计4条种特异性上游引物(TaF、EgF、ThF、和TsF)和1条下游通用引物(TR),通过优化反应条件和体系,建立了在一个PCR体系中即可完成对4种猪绦虫蚴的快速鉴别的mPCR 方法。结果 4种猪绦虫蚴的特异性PCR引物等比例混合后,在退火温度为50℃的条件下,该mPCR方法可同时扩增出C. cellulosae、T. asiatica、E. granulosus和C. tenuicollis的特异性基因片段,其大小分别为478 bp、710 bp、619 bp和542 bp。PCR产物测序后经BLAST比对,与同种虫体的基因序列相似性在99%以上。结论 本研究建立的mPCR方法具有很高的种间特异性,并且可通过扩增片段的大小对4种猪绦虫蚴进行快速、准确的鉴别。     

巢式PCR在鉴别多房棘球绦虫及细粒棘球绦虫基因亚型中的应用

目的 探索巢式PCR在鉴别多房棘球绦虫及细粒棘球绦虫基因亚型中的应用价值.方法 将水泡带绦虫、犬弓首蛔虫、多房棘球绦虫、细粒棘球绦虫羊株和骆驼株等样本的DNA用巢式PCR扩增.结果 巢式PCR可以扩增出多房棘球绦虫和水泡带绦虫,而对细粒棘球绦虫羊株和骆驼株及其他寄生虫均不能扩增出.结论 在鉴别细粒棘球绦虫和多房棘球绦虫方面,巢式PCR有一定的诊断意义,但不能用于鉴别细粒棘球绦虫基因亚型.     

辽宁省朝阳市细粒棘球病的基因型分析

目的分析本院分离到的人源性棘球蚴的基因型,为辽宁省棘球蚴病的分子流行病学提供资料。方法经外科手术方法从患者肝内获取棘球蚴囊,将囊内容物离心沉淀提取DNA,以细粒棘球绦虫线粒体细胞色素氧化酶(cox1)基因为靶基因设计引物进行PCR扩增,对PCR产物进行测序,测序结果应用Blast进行分析,并与GenBank数据库中序列进行比对。结果 cox1扩增产物及测序的结果提示,本例样本与细粒棘球幼的cox1基因型(AF297617)高度相似,差异性为0.1%,基因型属于G1亚型。并与其他国家的25个分离株序列一致。结论线粒体基因组的cox1基因分析是棘球蚴病诊断和分型的有力工具。辽宁地区首次报道了细粒棘球绦虫的基因型为G1亚型,其序列与国内外的多个分离株保持一致,为棘球蚴病的分子流行病学补充了资料。     

细粒棘球绦虫EG95基因的克隆和序列分析

目的：获得细粒棘球蚴EG395基因序列资料，进行序列分析，为研究包虫病疫苗候选抗原基因奠定基础。方法：从包囊内获取细粒棘球蚴原头蚴(protoscoleces)，提取RNA和DNA，用特异引物分别以基因组DNA和cDNA为模板扩增EG95基因；并将其克隆到T载体后进行序列测定和分析。结果：以基因组为模板获得一个基因。长度为1253bp，以cDNA为模板获得两个基因，长度分别为1121bp和833bp；同源性比较结果表明：来自新疆羊源EG95基因序列和澳大利亚羊源EG395-2基因同源性为98％，有13个碱基变异；从cDNA获得的EG95基因(EG95-like)和DNA来源的EG95相同，只是EG95序列的一部分；从cDNA获得的另一个EG95基因(mEG95)和澳大利亚源EG395-2同源性为99％，有2个碱基不同。分析表明EG95是一个基因家族，可能是虫体发育到六沟蚴阶段特定表达的基因。结论：EG95是一个基因家族，进一步研究该基因家族的结构和功能对包虫病的免疫预防具有重要意义。     

Molecular characterization of Echinococcus granulosus in paraffin-embedded human tissues from Southwest Iran

Objective: To investigate Echinococcus(E.) granulosus genotypes as the causative agents of hydatidosis in humans in the southwest of Iran(Khuzestan province). Methods: In this study, isolates of 80 archived human paraffin embedded hydatid cysts were collected from pathology laboratories in Ahvaz city, Khuzestan province. DNA was extracted and examined by nested-PCR of ribosomal DNA(rDNA) internal transcribed spacer 1(ITS1), and PCR-RFLP. In addition, the sequences of fragments of genes coding for Cox space1 and NADH dehydrogenase 1(ND1) were also examined.Results: Of the 80 paraffin samples, 44(55.0%) were from the liver, 27(33.8%) from the lung, and the rest from other organs. The amplified hydatid genomic DNA showed that the cysts were E. granulosus strains. The results of PCR-RFLP and sequencing analysis revealed the presence of G1 genotype(sheep strain) in all human isolates. Furthermore, no camel strain(G6) was detected among all samples in the regions studied.Conclusions: The molecular findings indicate that the predominant genotype involved in E. granulosus transmission in southwest of Iran is the common sheep strain(G1), which occurs in human populations. These results may have important implications for hydatid disease control in the studied areas.     

Short report: Echinococcus granulosus from Xinjiang,PR China: cDNAS encoding the EG95 vaccine antigen are expressed in different life cycle stages and are conserved in the oncosphere

The EG95-based vaccine protects sheep from infection with the dog tapeworm Echinococcus granulosus. The EG95 encoding gene is a member of a multigene family, several members of which are expressed in the oncosphere, believed to be the target of immunity induced by the vaccine. E. granulosus exhibits extensive intraspecific (strain) variation, and variability of the eg95 gene in different isolates of E. granulosus may directly impact the effectiveness of the EG95-based vaccine. We analyzed the eg95 gene from E. granulosus collected in Xinjiang, in northwest China, where hydatid disease is hyperendemic. The gene is expressed in oncospheres, protoscoleces, and immature and mature adult worms, and the eg95 gene family was shown to comprise two basic sequence types. Very limited sequence variation was evident in the EG95 protein from oncospheres. This high degree of sequence conservation predicts that the vaccine will continue to be effective in China and elsewhere.     

Evaluation of three PCR assays for the identification of the sheep strain (genotype 1) of Echinococcus granulosus in canid feces and parasite tissues

The performance of 3 PCR assays for the identification of the G1 sheep genotype of Echinococcus granulosus was evaluated using tissue and canid fecal samples. The "Dinkel" and "Stefani?" primers were the most sensitive in detecting E. granulosus DNA in feces of necropsied dogs (73.7% and 100%, respectively). The "Abbasi" primers detected 52.6% of E. granulosus infected dogs but were the most species-specific, cross-reacting only with Echinococcus shiquicus (tissue 90.9%; feces 75%). The Stefani? primers were the least specific (tissue, 27.3%; feces, 25%) for E. granulosus. The Dinkel primers also showed inter-species cross-reactivity (tissue, 63.6%; feces, 100%) but were found to be strain-specific for the E. granulosus G1 sheep genotype. Improvement of PCR tests for Echinococcus species and subspecific variants should rely on the use of less-conserved genes and development of protocols that improve the quality and quantity of DNA extracted from feces.     

细粒棘球绦虫原头蚴发育调控基因Ral基因的克隆及序列分析

目的克隆和分析细粒棘球绦虫原头蚴发育调控基因Eg Ral基因。方法根据多房棘球绦虫Em Ral基因序列设计引物,用RT-PCR方法从细粒棘球绦虫原头蚴中克隆Eg Ral基因并将其克隆至pMD19-T载体,经测序后,与线虫、多房棘球绦虫、果蝇和人类等物种Ral基因进行比对分析。结果从细粒棘球绦虫原头蚴cDNA中克隆获得Eg Ral基因,长度为603 bp,编码200个氨基酸,等电点为8.85。经比对,Eg Ral与Em Ral同源性为99%,与线虫、果蝇和人等其他种类Ral基因同源性在47.89%～50.72%之间。进化树分析表明Eg Ral与Em Ral相聚集,与其他物种同源性较低。结论成功从细粒棘球绦虫原头蚴中克隆出Eg Ral基因,其序列具有较高的保守性。     

Short report: Identification of Echinococcus species from a yak in the Qinghai-Tibet plateau region of China

The species identification of an echinococcal lesion in the liver of a yak in the Qinghai-Tibet plateau region of China, where both Echinococcus granulosus and E. multilocularis are present, was difficult to determine because of the atypical appearance of the lesion. Polymerase chain reaction-based mitochondrial genotyping allowed us to discriminate the Echinococcus species. Nucleotide sequences of the cytochrome c oxidase subunit 1 (cox1) and cytochrome b (cytb) genes amplified from the echinococcal lesion demonstrated that the yak was infected with the E. granulosus G1 genotype (sheep strain).