中国莱姆病螺旋体流行菌株的蛋白分析

本文利用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ．ＤｏｔＥＬＩＳＡ等分子流行病学方法分析了２１株不同地区、不同来源的中国莱姆病螺旋体菌株的蛋白组成及单克隆抗体反应性。研究发现中国菌株主要蛋白呈现高度多态性和异质性，主要外膜蛋白ＯｓｐＡ、ＯｓｐＢ及ＰＣ蛋白有数种不同的表型，并呈现出紧密的相关性。所有的菌株均与单克隆抗体Ｈ９７２４（抗４１ＫＯ鞭毛抗原）呈阳性反应。除几株菌株外，绝大多数中国菌株均不与Ｈ６８３１（抗ＯｓｐＢ单克隆抗体）反应。中国菌株与单克隆抗体Ｈ５３３２（抗ＯｓｐＡ单克隆抗体）呈现不同的反应性，有强、弱和无反应等。根据中国菌株的蛋白组成及单克隆抗体反应性可大致将其分成三组，其中第Ⅰ组菌株具有与北美代表株Ｂ３１完全一致的蛋白组成及单克隆抗体反应性。第Ⅱ、Ⅲ组蛋白组成及单克隆抗体反应性更接近欧洲菌株。     

中国莱姆病螺旋体PD91外膜蛋白C表达载体的构建及序列分析

目的　构建莱姆病螺旋体PD91菌株外膜蛋白C(OspC)的表达载体 ,克隆表达OspC以便用于莱姆病诊断研究。方法　设计引物 ,用PCR从PD91扩增出ospC基因 ,定向克隆到表达载体PGEX - 5X - 1,构建重组质粒。通过PCR、酶切分析及序列测定等方法鉴定重组质粒。结果　ospC基因被正确克隆到表达载体PGEX - 5X - 1中。序列测定结果证实与国外已报道的ospC基因序列同源性在 6 5 %～ 92 %。 结论　OspC的编码基因在不同菌株间的同源性存在较大的差异。PGEX -5X - 1-ospC重组质粒的成功构建 ,为我国莱姆病特异性诊断试剂的研究奠定了基础。     

莱姆病螺旋体83kD原浆柱蛋白特异性区段的基因克隆与表达研究

目的　为莱姆病血清学诊断和基因工程亚单位疫苗研制提供靶抗原。方法　根据莱姆病螺旋体 83kD原浆柱蛋白 (p83)特异性区段的基因序列 ,设计一对引物 ,采用PCR技术从莱姆病螺旋体B31株基因组DNA中扩增p83特异性区段的基因片段 ,纯化扩增产物 ,用BamHI和EcoRI双酶切后定向克隆入质粒载体pBK -CMV ;转化大肠杆菌筛选重组克隆。用BamHI和EcoRI双酶切、PCR扩增和DNA序列测定对重组质粒进行鉴定 ,将重组质粒转化大肠杆菌 ,IPTG诱导表达后进行SPS -PAGE和Western -blotting分析。结果　 1)从莱姆病螺旋体B31株基因组DNA中扩增出p83特异性区段的基因片段 ;2 )将扩增所得的目的基因片段正向插入pBK -CMV的BamHI和EcoRI位点 ,获得重组质粒pBX1。 3)pBX1在大肠杆菌中诱导表达后获得 2 9kD含 β -半乳糖苷酶氨基末端片段的重组抗原。 结论　成功构建了莱姆病螺旋体 83kD原浆柱蛋白特异性区段的基因重组表达载体 ,并在大肠杆菌中获得了稳定的表达 ,为进一步研究该重组抗原在莱姆病血清学诊断和基因工程亚单位疫苗研制中的应用奠定了基础     

莱姆病螺旋体83kD原浆柱蛋白特异性区段的基因克隆与表达 …

目的 为莱姆病血清学诊断和基因工程亚单位疫苗研制提供靶抗原。方法 根据莱姆病螺旋体８３ｋＤ原浆栓蛋白（ｐ８３）特异性区段的基因序列,设计一对引物,采用ＰＣＲ技术从莱姆病螺旋体Ｂ３１株基因组ＤＮＡ中扩增ｐ８３特异性区段的基因片段,纯化扩增产物,用ＢａｍＨＩ和ＥｃｏＲＩ双酶切后定向克隆入质粒载体ｐＢＫ－ＣＭＶ;转化大肠杆菌筛选重组克隆,用ＢａｍＨＩ和ＥｃｏＲＩ双酶切、ＰＣＲ扩增和ＤＮＡ序列测定对重组质     

莱姆病螺旋体优势抗原BmpA分子克隆、高效表达与亚细胞地位

目的以伯氏疏螺旋体标准株B31株基因组DNA为模板,PCR扩增bmpA全基因序列,定向克隆和高效表达重组BmpA并纯化。方法 1)以伯氏疏螺旋体标准株B31株基因组DNA为模板,设计定向克隆引物,PCR扩增bmpA全基因序列,定向克隆入表达载体pGEX-6p-1,酶切鉴定后转化大肠埃希菌BL21菌株,获得bmpA重组菌;2)从重组菌培养温度,诱导时间,诱导剂的剂量,菌密度(A600)等方面优化诱导条件,确定高效表达重组BmpA的最佳方案;3)用GSH柱纯化重组BmpA,探索纯化BmpA的最佳条件。结果 1)在基因水平和蛋白水平上均得到目的条带和目标峰,确定表达载体bmpA-pGEX-6p-1构建成功并表达重组BmpA;2)重组质粒在37℃,IPTG诱导浓度为0.1mmol/L,诱导时间为6h,菌液的A600值为0.5～1.0以及在LB培养基上培养GST-bmpA融合蛋白表达量达到最大;3)在最佳表达条件下1L重组菌能得到2.9～3.1mg纯化BmpA蛋白。结论成功构建了表达重组蛋白BmpA的大肠埃希菌原核表达系统,确定了高效表达重组BmpA的最佳方案,并证明用GSH柱纯化重组BmpA效果较好。     

空肠弯曲菌AhpC蛋白的克隆表达及抗原性分析

目的构建空肠弯曲菌烷基过氧化氢还原酶（ahpC）基因的原核表达系统,克隆表达AhpC蛋白,用Western blot以及ELISA方法检测表达蛋白的抗原性,为筛选空肠弯曲菌感染后特异性抗体检测试剂的制备奠定基础。方法用PCR方法从中国分离菌株ICDCCJ07001的染色体DNA中扩增出ahpC基因,将目的基因插入表达载体pGEX-4T-1后转化入大肠杆菌E.coliBL21（DE3）,IPTG诱导重组质粒pGEX-ahpC的表达。SDS-PAGE分析表达产物,采用GST标签亲和层析柱纯化表达蛋白。应用兔免疫血清、临床感染者血清以及健康无感染者血清,利用Western blot以及ELISA的方法分析AhpC蛋白的抗原性并初步评价其在ELISA检测方法中的应用。结果 PCR扩增及双酶切鉴定证实重组质粒构建成功。重组表达蛋白经飞行质谱鉴定为空肠弯曲菌AhpC蛋白,Western blot及ELISA检测结果显示AhpC具有特异抗原性。结论成功构建了ahpC重组表达载体pGEX-4T-1/ahpC,并在大肠杆菌中高效表达。空肠弯曲菌AhpC蛋白具有抗原性,可以作为空肠弯曲菌感染后血清抗体检测的特异抗原。     

空肠弯曲菌外膜蛋白rOMP18的克隆表达及抗原性分析

目的构建空肠弯曲菌omp18基因的重组表达质粒、克隆表达rOMP18重组蛋白、对表达产物进行鉴定并评价其抗原性。方法PCR扩增空肠弯曲菌的omp18基因片段,将其连接到表达载体pET32a(+)中并转化至大肠杆菌(E.coliBL21(DE3)),诱导表达后SDS PAGE分析其表达产物并纯化目的蛋白。应用空肠弯曲菌感染免疫血清,利用Western blot方法分析其抗原性。结果与结论单、双酶鉴定结果显示已成功构建rOMP18的重组表达载体pET32a omp18,IPTG诱导表达产物的相对分子质量与理论相符34kD（HIS16kD）。Western blot检测结果表明重组蛋白rOMP18具有抗原性,为空肠弯曲菌感染的特异抗体的检测提供候选抗原。     

伯氏疏螺旋体鞭毛蛋白特异性区段的基因克隆和表达

Aim Expressing the specific fragment of flagellin from Borrelia burgdorferi,in order to evaluate the feasibility of this recombinant protein as a diagnostic antigen.Methods By using PCR method,to obtain the gene coding the Borrelia burgdorferi flagellin from 409bp to 786bp that exhibit low homology with related gene from other bacterial specise.Verified by DNA sequence detection,cloning and thansforming it was expressed in E.coli BL₂₁(DE₃)and evaluated by westernblot.Results The expressing of recombinant protein in host bacteria is effective and stable.Western-blot assay verified the immunological response to monoclone antidody to flagellin.Conclusion It showed the feasibility of recombinant protein as a diagnostic antigen.     

螺旋体传染病

梅毒螺旋体嵌合抗原的克隆表达及其临床应用；梅毒螺旋体Tp0453重组蛋白的表达纯化及免疫活性研究；钩端螺旋体疫苗鉴别试验及其国家参考品的建立；中国莱姆病螺旋体PD91重组外膜蛋白A的动物免疫效果分析；两种检测梅毒螺旋体抗体方法的比较；重庆市钩端螺旋体病流行因素监测分析。[编按]     

Changes in the protein profile and antigenicity of different Borrelia burgdorferi strains after reintroduction to Ixodes ricinus ticks

Eight Swiss strains of Borrelia burgdorferi, with various protein profiles and the North-American strain B31 were artificially introduced into Ixodes ricinus ticks and reisolated 10 days later. All isolates were subsequently examined by SDS-PAGE analysis. Comparing initial isolates with the reisolates, we observed that 7 out of 9 strains changed their protein pattern with respect to the major proteins OspA, OspB and the 22 kDa protein after passage in the tick. The strains NE2, NE4 and NE83 with the initial phenotype of OspA and 22 kDa proteins changed to the phenotype of OspA and OspB, the strains B2 and NE202 with the initial phenotype of OspA acquired an additional protein of 22 kDa and the strain NE58 with the initial phenotype of OspA also acquired a protein of 22 kDa. Examination of these isolates by Western blot analysis demonstrated that the reaction with the monoclonal antibody H5332 and a monospecific polyclonal antibody PoAb/anti-22 kDa differed between the initial isolates and the reisolates.     

细粒棘球绦虫EG95基因的克隆和序列分析

目的：获得细粒棘球蚴EG395基因序列资料，进行序列分析，为研究包虫病疫苗候选抗原基因奠定基础。方法：从包囊内获取细粒棘球蚴原头蚴(protoscoleces)，提取RNA和DNA，用特异引物分别以基因组DNA和cDNA为模板扩增EG95基因；并将其克隆到T载体后进行序列测定和分析。结果：以基因组为模板获得一个基因。长度为1253bp，以cDNA为模板获得两个基因，长度分别为1121bp和833bp；同源性比较结果表明：来自新疆羊源EG95基因序列和澳大利亚羊源EG395-2基因同源性为98％，有13个碱基变异；从cDNA获得的EG95基因(EG95-like)和DNA来源的EG95相同，只是EG95序列的一部分；从cDNA获得的另一个EG95基因(mEG95)和澳大利亚源EG395-2同源性为99％，有2个碱基不同。分析表明EG95是一个基因家族，可能是虫体发育到六沟蚴阶段特定表达的基因。结论：EG95是一个基因家族，进一步研究该基因家族的结构和功能对包虫病的免疫预防具有重要意义。     

贝氏柯克斯体热休克蛋白B基因的克隆与表达

目的克隆贝氏柯克斯体(Coxiellaburnetii)热休克蛋白B(HspB)基因并在大肠杆菌细胞内高效表达。方法采用PCR方法,从贝氏柯克斯体新桥株基因组DNA中扩增出HspB的基因片段,鉴定后将目的片段与原核表达载体pQE30连接,构建重组表达质粒pQE30/hspB,IPTG诱导该重组质粒转化的大肠杆菌产生HspB重组蛋白。结果(1)PCR扩增获得长约1556bp的hspB基因片段。(2)SDS-PAGE证明,HspB重组蛋白的分子量为53.7kDa。(3)经薄层扫描分析,表达蛋白约占全菌体蛋白的71.2%。结论贝氏柯克斯体hspB基因在大肠杆菌中获得了高效表达,为Q热疫苗的研制提供了一易于获得的候选蛋白分子。     

吉林林区动物莱姆病螺旋体感染的调查研究

目的了解吉林珲春林区的蜱、野鼠及牛、绵羊感染莱姆病的情况。方法对蜱和野鼠进行莱姆病螺旋体的PCR扩增,阳性标本RFLP分型,应用间接免疫荧光法检测家畜血清中的IgG抗体。结果PCR检测全沟硬蜱和森林革蜱的带菌率为36.0%和30.9%;在五种鼠中检测到莱姆病螺旋体的特异性片段,带菌率分别为14.0%、8.3%、13.0%、25.0%和33.3%。阳性标本RFLP分型结果属于B.garinii和B.afzelii型;牛、羊血清学检测阳性率为27.5%和31.5%。结论野鼠、蜱和牛羊中都检测到伯氏疏螺旋体的感染,证实吉林珲春林区存在莱姆病的自然疫源地。     

弓形虫GJS株表面抗原1基因的原核细胞表达及其抗原性分析

目的构建弓形虫GJS株表面抗原1（SAG1）重组表达质粒,研究SAG1蛋白疫苗诱导的保护性免疫作用。方法根据RH株弓形虫SAG1基因序列设计1对引物,利用PCR方法获得SAG1基因,克隆入pMD18-T载体,测序后进行序列分析;重新设计引物将其亚克隆至原核表达载体pET-30a中,在大肠杆菌中经IPTG诱导表达;重组抗原经纯化和复性后免疫小鼠,ELISA法测定其抗体滴度的变化,并用弓形虫速殖子攻击检测免疫保护力。结果与已知的SAG1基因核苷酸序列（$76248）及其编码氯基酸序列的同源性分别为99％、97％;表达的SAG1蛋白以包涵体形式存在,该重组抗原能被羊抗弓形虫阳性血清所识别;经间接ELISA检测,小鼠免疫后产生了较高的抗体;动物保护性实验表明,虽然与对照组相比免疫组小鼠存活时间有一定的延长,但差异无显著性。结论成功构建了弓形虫SAG1重组表达质粒,SAG1蛋白疫苗诱导小鼠的免疫保护力不强。     

恙虫病东方体Gilliam株56kDa外膜蛋白基因的克隆与表达

目的　表达恙虫病东方体 (Orientiatsutsugamushi)Gilliam株 5 6kDa外膜蛋白 ,探索其作为诊断抗原的可能性。方法　采用PCR方法 ,从Ot Gilliam株菌种基因组DNA中扩增出 5 6kDa外膜蛋白基因片段 ,将目的基因片段定向插入原核表达载体pQE30 ,再用重组质粒转化大肠杆菌 ,最后用IPTG诱导转化菌 ,SDS -PAGE和Western -blotting检测重组质粒目的基因的表达。结果　 (1)获得长约 15 0 0bp的Ot Gilliam株 5 6kDa外膜蛋白基因 ,SDS -PAGE检测表达产物 ,在相对分子量5 6× 10 4处有表达带 ;(2 )DNA测序证明重组质粒 pQE30 / 5 6中插入的基因片段的序列与已报告的Ot Gilliam株 5 6kDa外膜蛋白基因序列基本一致。 (3)诱导表达菌体经超声破碎后 ,显示目的蛋白主要以包涵体形式存在 ;(4 )免疫印迹显示该重组质粒转化的大肠杆菌有一相对分子量约为 5 6× 10 4的独特蛋白带 ,该蛋白约占细菌蛋白总量的 2 9 4 %。结论　Ot Gilliam株5 6kDa外膜蛋白基因在大肠杆菌中获得了高效表达 ,表达的重组蛋白具有免疫反应性 ,与Ot Gilliam株感染的小鼠血清在免疫印迹中呈阳性反应。     

肺炎衣原体Cpn0147基因的克隆、表达与定位及其重组蛋白的生物信息学分析

目的重组表达肺炎衣原体Cpn0147基因,并对表达的内源性蛋白进行细胞内定位,对重组蛋白进行生物信息学分析。方法使用PCR方法从肺炎衣原体菌株AR39基因组中扩增第0147段开放读码区基因,使用限制性内切酶BamHⅠ和NotⅠ酶切目的片段和载体PGEX-6P2,T4连接酶连接后转化入大肠埃希菌感受态XL-Blue,并诱导表达融合蛋白GST-Cpn0147。用融合蛋白免疫小鼠,制备抗体,应用IFA方法对衣原体感染细胞内Cpn0147基因表达的内源性蛋白进行定位。利用软件Expasy对重组蛋白进行生物信息学分析。结果克隆出肺炎衣原体基因Cpn0147,全长450 bp,编码蛋白分子质量单位为14.727 ku,表达的融合蛋白GST-Cpn0147分子质量单位约为43 ku;用制备的抗体做IFA,显示现该蛋白定位于肺炎衣原体包涵体膜上。生物信息学分析该蛋白含2个抗原决定簇,具有良好的抗原性和亲水性。结论肺炎衣原体Cpn0147基因编码蛋白为一包涵体膜蛋白,抗原性和亲水性较好。     

日本血吸虫嗜肌素样蛋白编码基因的克隆表达及其免疫原性研究

目的克隆和表达日本血吸虫嗜肌素样蛋白(SjcMLP)编码基因,并研究其重组抗原的免疫原性。方法PCR扩增SjcMLP编码基因,并亚克隆人表达载体pQE30。将重组表达质粒pQE 30-SjcMLP转入宿主菌E. coli M15,异丙基-βD-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,用金属Ni螯合物亲和层析柱(Ni-NTA)纯化SjcMLP重组蛋白(reSjcMLP)。纯化的reSjcMLP采用十二烷基磺酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和免疫印迹试验(Western blot)作进一步分析。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定用reSjcMLP免疫C57BL/6小鼠血清中的抗体水平。结果 SDS-PAGE分析表明获得的重组抗原的大小约24.8 kDa,与预的融合蛋白大小相符。Western blot昱示该重组抗原能被日本血吸虫尾蚴感染兔血清识别。用该重组抗原包被进行ELISA检测,免疫血清滴度高达1：12 800。但动物免疫试验结果减虫效果不明显。结论SjcMLP编码基因以可溶性融合蛋白的形式得到表达,动物免疫试验未诱导出明显的保护力