环介导等温扩增联合横向流动试纸条可视化检测HPV16及HPV58方法的建立

目的将环介导等温扩增技术(LAMP)与横向流动试纸条(LFD)联合应用,建立一种快速、可视化的HPV16、HPV58检测方法。方法运用LAMP在线引物设计软件,针对HPV16E6基因及HPV58L1基因保守区域设计引物及探针。采用生物素标记LF,荧光基团FAM和淬灭基团BHQ-1标记探针,LFD进行目视检测,建立HPV16和HPV58的LAMP-LFD检测方法,并对其特异性、灵敏度及临床实用性进行验证。将临床样品使用该方法的检测结果与实时LAMP扩增及qPCR结果相比较,计算符合率。结果优化的LAMP最佳反应温度为63℃,最佳反应时间为50min。LFD检测仅需5min,故完成检测耗时仅55min;建立的LAMP-LFD方法能特异性检出HPV16、HPV58,其他5种常见高危型HPV呈阴性反应;该方法针对HPV16和HPV58的检测灵敏度均为100拷贝/μl,50份临床样品检测结果与实时LAMP和qPCR检测的符合率达100%。结论建立的HPV16、HPV58LAMP-LFD检测体系快速、简便,可视化。该方法对设备的要求低,仅需恒温孵育器即可完成,结果易观察,适用于现场HPV检测,以及经济落后和资源匮乏地区的HPV筛查。     

环介导等温扩增联合横向流动试纸条可视化检测HPV16及HPV58方法的建立北大核心CSCD

目的将环介导等温扩增技术(LAMP)与横向流动试纸条(LFD)联合应用,建立一种快速、可视化的HPV16、HPV58检测方法。方法运用LAMP在线引物设计软件,针对HPV16E6基因及HPV58L1基因保守区域设计引物及探针。采用生物素标记LF,荧光基团FAM和淬灭基团BHQ-1标记探针,LFD进行目视检测,建立HPV16和HPV58的LAMP-LFD检测方法,并对其特异性、灵敏度及临床实用性进行验证。将临床样品使用该方法的检测结果与实时LAMP扩增及qPCR结果相比较,计算符合率。结果优化的LAMP最佳反应温度为63℃,最佳反应时间为50min。LFD检测仅需5min,故完成检测耗时仅55min;建立的LAMP-LFD方法能特异性检出HPV16、HPV58,其他5种常见高危型HPV呈阴性反应;该方法针对HPV16和HPV58的检测灵敏度均为100拷贝/μl,50份临床样品检测结果与实时LAMP和qPCR检测的符合率达100%。结论建立的HPV16、HPV58LAMP-LFD检测体系快速、简便,可视化。该方法对设备的要求低,仅需恒温孵育器即可完成,结果易观察,适用于现场HPV检测,以及经济落后和资源匮乏地区的HPV筛查。     

人乳头瘤病毒16亚型LAMP检测法的建立

目的本研究旨在建立一种简单、快速、灵敏的检测方法,使环介导等温扩增技术(LAMP)应用于HPV16亚型的检测。方法根据Gen Bank登录的HPV16亚型序列(FJ610152)中E7基因序列设计了多套特异引物,通过LAMP real-time Turbidimeter仪对HPV16亚型的LAMP引物进行筛选并对反应体系和反应条件进行检测和实时监控以检测其特异性和敏感性。反应结束后加入SYBR Green I染料肉眼判定并与仪器检测结果进行比对。结果建立的LAMP方法在61℃下可对HPV16核酸进行高效扩增,反应结束后加入染料肉眼判定结果与Real-time Turbidimeter仪检测结果一致;该方法具有较强的特异性和较高的敏感性(最低检出限量为3.0×103 copies/μL)。LAMP法与HPV分型试剂盒对35份样品的检测结果一致。结论本研究建立的可视化LAMP方法操作简便,适用于HPV16的快速检测。     

防气溶胶污染的UDG-LAMP-LFD核酸检测体系的建立北大核心CSCD

目的 建立一种基于热敏UDG酶防污染的、环介导等温扩增(LAMP)技术及横向流动试纸条(LFD)联合使用的核酸检测方法,实现对HPV18的快速、可视化检测。方法 使用LAMP在线引物设计软件设计HPV18特异性引物,同时引入热敏UDG酶,建立UDG-LAMP检测体系,优化T/U碱基比例,设置对照试验验证热敏UDG酶防污染能力;根据LFD要求,设计特异性同化探针及淬灭探针,建立UDG-LAMP-LFD核酸检测体系并对LAMP反应时间进行优化;对该体系进行灵敏度、特异性及临床样品的验证,并与QPCR结果进行比较。结果 优化的LAMP反应时间为40 min, T/U比例为1∶1;热敏UDG酶孵育时间为10 min,防污染效果显著;LFD结果判读耗时5 min,整个检测时间为55 min。该UDG-LAMP-LFD核酸检测体系在以HPV18作为检测对象时,灵敏度10^(3)拷贝/μl;29例临床样品的验证结果与QPCR检测结果完全一致。结论 建立的UDG-LAMP-LFD检测体系可快速、特异、灵敏、可视化的检测HPV18,同时可避免气溶胶污染导致的假阳性。该方法对实验设备及工作人员要求较低,适合在偏远地区及基层医院使用。     

LAMP技术用于幽门螺旋杆菌检测与分型的研究北大核心CSCD

目的建立环介导等温扩增(LAMP)体系用于检测唾液和胃液中的幽门螺旋杆菌(Hp)及基因分型。方法收集临床Hp阳性标本,应用荧光定量PCR进行分型检测,即分为Ⅰ型和Ⅱ型。分别根据Hp,HpⅠ型设计LAMP引物并优化反应条件,通过LAMP检测验证这3套引物的特异性,并通过检测稀释后模板验证引物的灵敏度,同时加入钙黄绿素使产物显色,使Hp分型检测可视化。用LAMP方法检测收集的临床标本,计算Hp阳性率,并与荧光定量PCR法相比较。结果建立的LAMP体系特异性良好,对Hp、HpⅠ和HpⅡ型检测的灵敏度均为102 IU/ml。利用钙黄绿素进行产物检测的效果和电泳结果相一致。对临床标本进行Hp分型检测,HpⅠ、HpⅡ型LAMP结果与荧光定量PCR法比较差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 LAMP对Hp的检测与分型均具有较高的特异性和灵敏度,且操作简便,在基层医院具有良好的应用前景。     

LAMP技术用于幽门螺旋杆菌检测与分型的研究

目的建立环介导等温扩增(LAMP)体系用于检测唾液和胃液中的幽门螺旋杆菌(Hp)及基因分型。方法收集临床Hp阳性标本,应用荧光定量PCR进行分型检测,即分为Ⅰ型和Ⅱ型。分别根据Hp,HpⅠ型设计LAMP引物并优化反应条件,通过LAMP检测验证这3套引物的特异性,并通过检测稀释后模板验证引物的灵敏度,同时加入钙黄绿素使产物显色,使Hp分型检测可视化。用LAMP方法检测收集的临床标本,计算Hp阳性率,并与荧光定量PCR法相比较。结果建立的LAMP体系特异性良好,对Hp、HpⅠ和HpⅡ型检测的灵敏度均为102 IU/ml。利用钙黄绿素进行产物检测的效果和电泳结果相一致。对临床标本进行Hp分型检测,HpⅠ、HpⅡ型LAMP结果与荧光定量PCR法比较差异均有统计学意义(P0.05)。结论 LAMP对Hp的检测与分型均具有较高的特异性和灵敏度,且操作简便,在基层医院具有良好的应用前景。     

2型猪链球菌89K毒力岛Ⅳ型分泌系统LAMP检测方法的建立

目的建立针对高致病性2型猪链球菌(Streptococcus suis 2,SS2)89K毒力岛Ⅳ型分泌系统的环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)方法。方法根据国内流行株特有89K毒力岛编码的Ⅳ型分泌系统(T4SS-89K)的virB4-89K基因保守区域设计并合成LAMP引物,通过优化反应体系和扩增条件建立T4SS-89K快速检测方法,对方法的特异性、敏感性进行评估。结果优化的LAMP反应体系具有良好的扩增效率,检测灵敏度为1.53×101拷贝/反应,全部扩增检测可在60min内完成;建立的LAMP法具有良好的特异性,与不含T4SS-89K的猪链球菌(包括1/2型、1型、3~33型),以及其他常见9种对照菌均不发生特异性扩增,而与1998和2005年疫情现场分离的高致病性SS2均可发生特异性扩增。结论建立的LAMP方法具有特异、灵敏,设备要求简单等特点,可用于高致病性SS2快速检测。     

空肠弯曲杆菌LAMP检测方法的建立及初步应用

目的 建立一种灵敏的环介导等温扩增方法（Loop-mediated Isothermal Amplification, LAMP）用于空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)的快速检测。方法：根据已公布的空肠弯曲杆菌旋转酶基因（gyrA）设计引物,建立并优化LAMP反应体系,对检测方法的特异性和灵敏度进行验证,并运用该方法对我国不同地方鸡种空肠弯曲杆菌的携带率进行调查。结果 该方法能扩增出典型的梯形条带,且扩增产物的酶切鉴定结果与理论值相符;对单增李斯特菌等8株实验菌株进行检测,仅空肠弯曲杆菌的LAMP结果为阳性;该方法检测空肠弯曲杆菌纯培养物的灵敏度为20cfu／mL,高于常规PCR检测方法10倍;不同地方鸡种空肠弯曲杆菌携带率介于6%～90%之间,差异显著。结论 本试验建立的空肠弯曲杆菌LAMP检测方法特异性强、灵敏度高,有望在临床样品检测中发挥作用。     

H9亚型禽流感病毒RT-LAMP可视化检测方法的建立

目的根据环介导等温扩增技术（LAMP）,建立了一种适用于H9亚型禽流感病毒（AIV）的逆转录环介导等温扩增（RT-LAMP）快速检测方法。方法根据GenBank中的H9亚型AIV血凝素（HA）基因序列,在保守区设计了一套针对HA基因8个区域的6条特异性引物,并对反应条件进行优化。结果结果表明该方法对H3、H5、H7亚型AIV及其它禽呼吸道病原体均无扩增反应,并可通过反应液是否有沉淀或向反应液中加入荧光染料来对结果进行可视化观察;扩增反应只需要在常规水浴锅中进行,50min之内可完成反应;该方法对H9亚型AIV RNA的最小检测限为0.01pg,灵敏度是一步法RT-PCR方法的1 000倍。结论本研究建立的RT-LAMP方法简便、快速、灵敏、特异,适合在基层进行H9亚型AIV的快速检测。     

淡水鱼华支睾吸虫囊蚴 LAMP 检测方法的建立

目的 建立一种高效灵敏的环介导等温扩增(LAMP)方法检测淡水鱼中华支睾吸虫囊蚴。 方法 以华支睾吸虫 ITS2 基因序列为靶序列,合成 Cs-1、Cs-2、Cs-3 三组 LAMP 引物体系。 以华支睾吸虫囊蚴 DNA 样本为模板,日本血吸虫成虫、带绦虫成虫、蛔虫虫卵及其他吸虫囊蚴 DNA 样本为参考,比较三组引物体系的特异度;以不同浓度的华支睾吸虫成虫基因组 DNA 为模板,比较三组引物体系的灵敏度;用 LAMP 法及 PCR 法平行检测 16 份华支睾吸虫囊蚴样本和 23 份其他吸虫囊蚴样本,评价 LAMP 法的敏感性和特异性。 结果 三组引物体系的灵敏度及特异度以 Cs-3 为最优,以其建立的 LAMP 法反应体系,检测华支睾吸虫成虫 DNA 的最低检出浓度可达到 3. 33×10^-4ng / μL,敏感性和特异性与 PCR 法一致,均为 100%。 结论 成功建立了一种可用于检测淡水鱼中华支睾吸虫囊蚴的 LAMP 方法,为淡水鱼寄生虫病监测工作提供了便捷高效的检测手段。     

大肠埃希菌O157:H7环介导等温扩增可视化检测方法的建立

目的建立肠出血性大肠埃希菌O157︰H7环介导等温扩增(LAMP)可视化快速检测方法。方法针对肠出血性大肠埃希菌(EHEC)O157︰H7编码脂多糖rfbE基因保守区设计LAMP引物及环引物,反应体系加入染料羟基萘酚蓝(HNB)作为LAMP扩增的指示剂,结合LAMP浊度仪优化扩增条件,根据HNB的颜色变化进行结果判定,评价LAMP方法的特异性和灵敏性。结果建立的LAMP法对O157︰H7rfbE基因的最低检出限约为100copy/反应管,检测肠产毒性大肠埃希菌(ETEC)、肠致病性大肠埃希菌(EPEC)、肠侵袭性大肠埃希菌(EIEC)、肠聚集性大肠埃希菌(EAEC)、宋内志贺菌、福氏志贺菌均为阴性。体系的扩增效率较高,可在40min内出结果。结论建立的基于颜色判定的EHEC O157︰H7LAMP检测方法具有特异、灵敏,设备要求简单等特点,适用于EHEC O157︰H7的快速检测。     

大肠埃希菌O157:H7环介导等温扩增可视化检测方法的建立

目的建立肠出血性大肠埃希菌O157︰H7环介导等温扩增(LAMP)可视化快速检测方法。方法针对肠出血性大肠埃希菌(EHEC)O157︰H7编码脂多糖rfbE基因保守区设计LAMP引物及环引物,反应体系加入染料羟基萘酚蓝(HNB)作为LAMP扩增的指示剂,结合LAMP浊度仪优化扩增条件,根据HNB的颜色变化进行结果判定,评价LAMP方法的特异性和灵敏性。结果建立的LAMP法对O157︰H7rfbE基因的最低检出限约为100copy/反应管,检测肠产毒性大肠埃希菌(ETEC)、肠致病性大肠埃希菌(EPEC)、肠侵袭性大肠埃希菌(EIEC)、肠聚集性大肠埃希菌(EAEC)、宋内志贺菌、福氏志贺菌均为阴性。体系的扩增效率较高,可在40min内出结果。结论建立的基于颜色判定的EHEC O157︰H7LAMP检测方法具有特异、灵敏,设备要求简单等特点,适用于EHEC O157︰H7的快速检测。     

基于微流控核酸等温扩增的 登革病毒现场快速检测技术研究

[摘要]?目的?结合环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification, LAMP）和微流控芯片技术，建立一种适合现场快速检测登革病毒的方法。方法?利用RT-LAMP，针对登革病毒基因组中3’非编码区中特异性序列进行扩增，建立基于微流控芯片技术的LAMP检测方法，优化检测体系，并对该方法的灵敏性和特异性进行评估。结果?基于LAMP 和微流控芯片技术的登革病毒检测方法，通过对病毒模板进行扩增，发现与其他病毒无交叉反应，特异性良好；同时，结果显示该方法对登革病毒检测灵敏性可达61.2 pg/μl，与实时荧光定量PCR仪所达到的检测灵敏性一致。结论?基于LAMP和微流控芯片技术的登革病毒检测方法具有操作简单、快速、对设备要求低等优势,并且灵敏性、特异性均较好，是一种便于开展现场快速检测的方法。     

刚地弓形虫529 bp重复序列环介导等温扩增检测方法的建立

目的建立高效检测刚地弓形虫(Toxoplama gondii)的环介导等温扩增(LAMP)方法,为弓形虫病诊断提供新的技术手段。方法采用在线引物设计软件Primer Explorer 4.0设计弓形虫529 bp基因LAMP扩增引物,用已构建的pMD-19T-529 bp重组质粒为模板,建立LAMP扩增反应,通过添加环引物、设置不同浓度的甜菜碱和Mg SO_4以及不同反应温度对扩增反应体系和反应条件进行优化。以猪、微小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)、猪等孢球虫(Isospora suis)的基因组DNA和超纯水为对照,pMD-19T-529 bp重组质粒为模板,分别进行优化后的LAMP和PCR扩增,评价LAMP方法的特异性。将pMD-19T-529 bp重组质粒梯度稀释为109~100copies/ml,分别进行优化后的LAMP和PCR扩增,评价LAMP方法的灵敏性。结果设计的LAMP扩增引物可扩增出弓形虫529 bp序列保守区域的目的片段。优化结果显示,最佳反应总体系为25μl,其中,甜菜碱最佳浓度为0.4 mol/L,Mg SO_4最佳浓度为6 mmol/L;添加环引物反应30 min的扩增效率与未添加环引物反应60 min的扩增效率相当,可使反应时间缩短30 min;最佳反应条件为63℃30 min,80℃3 min。特异性检测结果显示,所建立的LAMP方法可特异扩增弓形虫529 bp基因片段,对照均未扩增出目的片段。灵敏性检测结果显示,LAMP方法的最低检出值达10~3 copies/ml,效率为PCR扩增(10~4 copies/ml)的10倍。结论建立了弓形虫529 bp重复序列的LAMP检测方法,该法具有较好的特异性和灵敏性。     

等温扩增法用于孕妇B族链球菌感染筛查的研究

目的建立可用于快速筛查孕妇B族链球菌(GBS)的等温扩增法。方法培养GBS并提取基因组DNA。根据其cfb基因设计LAMP(环介导等温扩增)和RPA(重组酶聚合酶扩增)反应引物,进行目的基因扩增。采集临床标本50份,同时用两种方法进行检测,评价方法的特异性和敏感性。结果 LAMP可在45min完成基因扩增,RPA法可在15min完成目的基因的扩增。二者均具有高度敏感性和特异性,最低检出浓度均为0.01ng DNA/μl。检测50份临床标本LAMP法4份阳性,RRP法5份阳性(其中1份假阳性)。结论 LAMP和RPA均不依赖特定仪器,在恒温条件下即可完成目的基因扩增,以LAMP方法操作更简单、快速,特异性更高,可用于女性孕期GBS感染筛查。     

实时荧光环介导等温扩增技术检测土壤中的类鼻疽伯克霍尔德菌

目的 结合荧光染料EvaGreen与环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)探索快速检测类鼻疽伯克霍尔德菌的可行性。方法 根据类鼻疽伯克霍尔德菌filc基因片段设计了LAMP引物,利用荧光染料EvaGreen建立实时荧光环介导等温扩增技术(real-time fluorescence loop-mediated isothermal amplification,RealAmp),优化反应条件,扩增产物经电泳鉴定。通过类鼻疽伯克霍尔德菌和其他致病菌验证特异性,比较RealAmp与普通LAMP技术的敏感度,并测定人工污染土壤模拟样本的检出限。结果 恒温63 ℃条件下,20~60 min即可完成RealAmp检测;利用该方法检测类鼻疽伯克霍尔德菌为阳性,其余致病菌如鼠疫杆菌、布鲁氏杆菌、大肠杆菌等13株参考菌株及蜱虫的DNA(含大量假单胞菌属细菌)呈扩增阴性;RealAmp技术检测类鼻疽伯克霍尔德菌核酸的灵敏度为10² CFU/mL,检测克隆株质粒的灵敏度可达10¹ copies/μL,比普通LAMP技术的灵敏度高10倍;人工污染土壤模拟样本RealAmp的检出限为4.4×10¹ CFU/g,且20 min左右即可判定结果;直接检测24份浓度为4.4×10¹ CFU/g~4.4×10⁸ CFU/g的类鼻疽伯克霍尔德菌人工污染土壤样本,在检出限以上,检出率同荧光定量PCR一致。结论 该方法特异性强、灵敏度高,且可实时监测类鼻疽伯克霍尔德菌,有望成为快速检测类鼻疽伯克霍尔德菌的有效方法,增强抵御生物恐怖战争的能力。     

山羊无形体可视化等温扩增法的建立与应用北大核心CSCD

目的 山羊无形体(Anaplasma capra)是无形体属中近年来新发现的一种人兽共患无形体,可引起无形体病,严重威胁人类的健康。建立一种适用于现场快速检测山羊无形体的可视化环介导等温扩增(LAMP)方法,对无形体病的诊断与防控有重要意义。方法 用聚合酶链式反应(PCR)扩增山羊无形体的msp2基因,构建重组质粒。利用在线引物设计软件设计LAMP引物,优化其反应条件和反应体系;加入一定浓度的钙黄绿素,建立可视化LAMP方法,评价其敏感性和特异性,并与PCR方法比较。结果 建立的可视化LAMP反应可准确检测山羊无形体的重组质粒和样品中的山羊无形体基因,且不与其他无形体发生交叉反应,最低检测限为1 copy/μL,比PCR方法的灵敏度高100倍。用该方法检测已知山羊无形体阳性蜱的总DNA,结果均为阳性;检测承德市野外采集的蜱标本,山羊无形体阳性率为16.1%,PCR方法的阳性率为12.5%。结论 建立的可视化LAMP方法敏感性、特异,操作简单、快捷,可用于人感染山羊无形体的早期检测与蜱携带无形体的监测。     

艰难梭菌快速分子诊断方法的建立北大核心CSCD

目的建立用于快速检测艰难梭菌感染的聚合酶链式反应(PCR)和环介导等温扩增(LAMP)方法。方法收集有艰难杆菌感染症状患者的粪便样品,经CCFA选择性培养基筛选和VITEK MS飞行时间质谱仪分析获得艰难梭菌菌株;利用BLAST分析得到艰难梭菌特异性基因,以此为模板建立、优化并验证艰难梭菌PCR检测和LAMP检测方法。结果筛选得到3株产毒艰难梭菌,经数据分析获得艰难梭菌的两个特异性基因FliM和假定蛋白基因(hypothetical protein)。分别建立Flim基因的PCR检测方法和检测假定蛋白基因的LAMP方法,检测下限均达到了100个质粒/μl,且无非特异性扩增。结论 PCR法和LAMP法成本低,快速灵敏、特异性好,可用于艰难梭菌感染的快速检测。     

艰难梭菌快速分子诊断方法的建立

目的建立用于快速检测艰难梭菌感染的聚合酶链式反应(PCR)和环介导等温扩增(LAMP)方法。方法收集有艰难杆菌感染症状患者的粪便样品,经CCFA选择性培养基筛选和VITEK MS飞行时间质谱仪分析获得艰难梭菌菌株;利用BLAST分析得到艰难梭菌特异性基因,以此为模板建立、优化并验证艰难梭菌PCR检测和LAMP检测方法。结果筛选得到3株产毒艰难梭菌,经数据分析获得艰难梭菌的两个特异性基因FliM和假定蛋白基因(hypothetical protein)。分别建立Flim基因的PCR检测方法和检测假定蛋白基因的LAMP方法,检测下限均达到了100个质粒/μl,且无非特异性扩增。结论 PCR法和LAMP法成本低,快速灵敏、特异性好,可用于艰难梭菌感染的快速检测。     

环介导等温扩增技术及其应用

环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术是一种新型的体外核酸扩增技术,在等温条件下,利用一种具有自动链置换活性的Bst DNA聚合酶和一组特异性引物,对靶DNA序列进行快速扩增,1 h左右可合成109～1010拷贝的靶DNA序列.LAMP技术具有简便、快速、扩增效率和特异性高等特点,近年来该技术广泛应用于病原菌、病毒等病原体的快速分子检测.该文详细介绍LAMP的原理、引物设计及其在微生物分子检测方面的应用.