乙型肝炎病毒剪接蛋白在大肠埃希菌中的表达和纯化

目的高效表达并获得高纯度的乙型肝炎病毒剪接蛋白(hepatitis B splicing protein,HBSP)。方法将HBSP编码基因克隆入原核表达载体pET43.1a(+),并在目的基因的C端引入StrepⅡ标签的编码序列,构建HBSP表达载体;将StrepⅡ标签的编码序列置于HBSP基因片段的N端,同时在StrepⅡ和HBSP之间引入终止密码子以构建对照载体。将以上质粒分别转化大肠埃希菌Rosetta(DE3),以IPTG诱导,SDS-PAGE检测融合蛋白的表达及其可溶性;通过Strep-Tactin系统亲和层析纯化蛋白,Western blot检测其反应原性。结果成功构建HBSP重组表达载体pET-43-HBSP-StrepⅡ及对照载体pET-43-StrepⅡ,经IPTG诱导后,分别在大肠埃希菌中高表达Nus-HBSP-StrepⅡ及Nus-StrepⅡ融合蛋白,且融合蛋白主要以可溶形式存在于细菌裂解上清液中。通过亲和层析获得纯度超过95%的Nus-HBSP-StrepⅡ及Nus-StrepⅡ融合蛋白,两融合蛋白均能被Strep.TagⅡ单抗识别。结论在大肠埃希菌中可高效、可溶性表达并获得高纯度的HBSP融合蛋白及对照蛋白,为HBSP功能研究打下良好基础。     

鼠疫耶尔森菌YopJ蛋白的基因密码子优化及异源表达纯化

目的优化鼠疫耶尔森菌YopJ蛋白基因密码子并在大肠埃希菌中进行异源表达纯化。方法依据大肠埃希菌密码子偏好性对鼠疫耶尔森菌YopJ基因进行全基因序列优化,并设计引物。分别以密码子优化前后的鼠疫耶尔森菌YopJ蛋白的基因为模板,将包含YopJ(22aa-288aa)和YopJ(22aa-250aa)的基因片段连接到载体pGI01中。重组质粒转化到大肠埃希菌BL21菌株中,扩大培养后,IPTG诱导目的蛋白表达。提取大肠埃希菌表达蛋白并使用镍离子柱进行纯化。结果鼠疫耶尔森菌YopJ密码子优化前YopJ(22aa-288aa)及YopJ(22aa-250aa)在大肠埃希菌内表达水平较低,密码子优化后YopJ(22aa-288aa)及YopJ(22aa-250aa)在大肠埃希菌内大量表达可溶性YopJ蛋白。结论对鼠疫耶尔森菌YopJ蛋白进行基因密码子优化能够提高其在大肠埃希菌内的表达量。获得的鼠疫耶尔森菌YopJ蛋白具有可溶性,为进一步研究其结构和功能奠定了基础。     

重组人重链铁蛋白纳米粒的构建、表达及鉴定

目的通过原核表达人重链铁蛋白基因(recombinant human H-chain ferritin,rHF),为新型纳米疫苗的研制提供新方法和手段。方法将人源性铁蛋白氨基酸序列按照大肠杆菌常用密码子进行优化,合成重组人重链铁蛋白(rHF)基因并克隆至原核表达载体pET-32a。通过双酶切、测序鉴定阳性重组质粒,将阳性质粒转入感受态细胞BL21(DE3),再经过异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。通过镍柱纯化重组蛋白。结果成功构建并表达纯化重组蛋白,经SDS-PAGE和Western blot鉴定蛋白产物,利用电子透射显微镜观察重组蛋白构型。重组铁蛋白以可溶性形式存在于蛋白上清,并具有生物学活性。且能够胞外自组装成具有12-20nm狭窄尺寸分布的纳米笼结构。结论采用大肠埃希菌表达系统可表达可溶性rHF蛋白并具有纳米粒结构,为新型纳米疫苗的研制以及疾病诊治提供了理论基础。     

幽门螺杆菌胶原蛋白酶HpPrtC的表达、纯化及结晶尝试

目的原核表达、纯化并筛选幽门螺旋菌胶原蛋白酶的结晶条件。方法通过基因重组构建幽门螺杆菌hp0169基因重组表达质粒,在大肠埃希菌进行重组蛋白的原核表达;经Ni 2+亲和层析、阴离子交换层析、凝胶过滤层析纯化蛋白;通过Hampton Research结晶试剂盒筛选蛋白结晶条件。结果扩增的幽门螺杆菌hp0169基因片段略大于1 000bp,构建重组质粒pET-28a-hp0169,转化至大肠埃希菌BL21(DE3)菌株后以IPTG诱导表达该U32家族蛋白酶HpPrtC;亲和层析,离子交换及凝胶过滤层析纯化的目标蛋白经SDS-PAGE鉴定为HpPrtC蛋白单体和二体,分子质量单位(Mr)为50×103和100×103,但以单体形式为主。使用结晶机器人筛选HpPrtC蛋白的初始结晶条件为0.2mol/L MgCl2,0.1mol/L Tris,pH 8.5,3.4mol/L己二醇。结论 HpPrtC可在大肠埃希菌中可溶性表达,并具有较好的可结晶性,为其结构与功能研究奠定了基础。     

家蝇天蚕素Cec4的原核表达与纯化北大核心CSCD

目的构建家蝇天蚕素(Cecropin)Cec4原核表达质粒,表达及纯化Cec4蛋白。方法从家蝇cDNA文库中筛选家蝇天蚕素基因Cec4,设计并合成特异性引物,PCR扩增Cec4基因,连接克隆载体后转入DH5α感受态细胞,通过重组子鉴定及测序完成目的基因的克隆。用限制性内切酶BamHI和HindⅢ双酶切目的基因和质粒,构建GST表达载体pGEX 4T-1-Cec4,转化到大肠埃希菌BL-21中,利用IPTG诱导表达重组Cec4蛋白,经亲和层析纯化后进行SDS-PAGE电泳分析。结果 PCR扩增获得的Cec4基因全长为192 bp,连接到表达载体pGEX 4T-1获得重组质粒pGEX 4T-1-Cec4,转化大肠埃希菌BL-21后经30℃、0.6 mmol/L的IPTG诱导18 h,表达相对分子质量约为26×10~3上清表达的融合蛋白,亲和层析纯化后的蛋白浓度为0.117 mg/ml。结论成功构建重组质粒pGEX 4T-1-Cec4并表达和纯化获得Cec4蛋白,为其进一步研究奠定了实验基础。     

猪重链铁蛋白的可溶性表达与纯化及纳米颗粒自组装北大核心CSCD

目的通过原核表达系统制备高可溶性的猪铁蛋白纳米颗粒,以期用于抗原递呈和纳米疫苗开发等研究。方法以提取的猪心脏总RNA为模板,RT-PCR扩增猪重链铁蛋白(Sus scrofa ferritin heavy chain,FTH1)基因。将目的片段连接到克隆载体pEASY-Blunt Zero,并对其进行双酶切鉴定和测序。将测序正确的FTH1基因克隆至含MsyB促溶标签的原核表达载体中,构建重组质粒pET28a-MsyB-FTH1。将重组质粒转化至大肠埃希菌BL21(DE3)感受态细胞并进行最佳表达条件的优化,用Ni-NTA亲和层析法纯化重组蛋白,通过Western blot和透射电镜观察对该蛋白进行分析与鉴定。结果成功扩增出大小为543 bp的FTH1基因片段,构建的重组质粒pET28a-MsyB-FTH1转化至DE3感受态细胞后经IPTG诱导表达分子质量约为37 ku的可溶性融合蛋白。优化的最佳诱导表达条件为温度37℃,IPTG终浓度0.6 mmol/L、诱导时间6 h。Western blot检测纯化的重组蛋白能被相应抗体识别。透射电镜观察到大小均一、粒径约10 nm的颗粒结构。结论利用大肠埃希菌可溶性表达并纯化了猪重链铁蛋白,该蛋白具有反应原性,可自组装成纳米颗粒,为新型猪疫苗的研制奠定了实验基础。     

家蝇天蚕素Cec4的原核表达与纯化

目的构建家蝇天蚕素(Cecropin)Cec4原核表达质粒,表达及纯化Cec4蛋白。方法从家蝇cDNA文库中筛选家蝇天蚕素基因Cec4,设计并合成特异性引物,PCR扩增Cec4基因,连接克隆载体后转入DH5α感受态细胞,通过重组子鉴定及测序完成目的基因的克隆。用限制性内切酶BamHI和HindⅢ双酶切目的基因和质粒,构建GST表达载体pGEX 4T-1-Cec4,转化到大肠埃希菌BL-21中,利用IPTG诱导表达重组Cec4蛋白,经亲和层析纯化后进行SDS-PAGE电泳分析。结果 PCR扩增获得的Cec4基因全长为192 bp,连接到表达载体pGEX 4T-1获得重组质粒pGEX 4T-1-Cec4,转化大肠埃希菌BL-21后经30℃、0.6 mmol/L的IPTG诱导18 h,表达相对分子质量约为26×10~3上清表达的融合蛋白,亲和层析纯化后的蛋白浓度为0.117 mg/ml。结论成功构建重组质粒pGEX 4T-1-Cec4并表达和纯化获得Cec4蛋白,为其进一步研究奠定了实验基础。     

亚洲带绦虫60S核糖体蛋白L8基因的克隆表达和免疫学分析

目的原核克隆表达亚洲带绦虫成虫60S核糖体蛋白L8基因（TaRPI。8）,探索其应用前景。方法用RT—PCR方法从亚洲带绦虫成虫cDNA中获取RPI．8基因,克隆到原核表达质粒pET一28a（＋）中,在大肠埃希茵BL21／DE3中用IPTG诱导表达,表达产物通过SDS-PAGE进行鉴定,用镍离子金属螯合剂亲和层析柱进行纯化,纯化的重组蛋白用蛋白印迹进行免疫学分析。结果PCR、双酶切及DNA测序结果均表明pET-28a（＋）一TaRPL8重组质粒构建成功。SDS-PAGE结果表明目的基因在大肠埃希菌BL21／DE3中获得高效表达,亲和层析获得了高纯度蛋白。重组蛋白可被其免疫的SD大鼠血清识别但不能够被正常大鼠血清识别,表明其具有免疫原性。结论亚洲带绦虫成虫TaRPI．8基因可在大肠埃希菌BL21／DE3中获得具有免疫原性的表达,为进一步的功能研究奠定了基础。     

鼠伤寒沙门菌修饰酶YdiU的表达、纯化及晶体培养北大核心CSCD

目的采用大肠埃希菌原核表达体系表达并纯化YdiU蛋白,筛选蛋白质晶体,为其结构和酶活测定等研究奠定基础。方法以生物信息学预测为基础,使用PCR方法从沙门菌基因组中调取ydiU基因,构建ydiU-pGl01重组质粒,转化入大肠埃希菌BL21(DE3)中,诱导蛋白表达。并使用镍离子亲和层析柱和阴离子交换柱对YdiU蛋白进行纯化。纯化后YdiU蛋白利用16种晶体筛选试剂盒在悬滴条件下进行晶体培养。结果成功构建重组表达质粒ydiU-pGl01。IPTG诱导后,YdiU蛋白在大肠埃希菌BL21(DE3)菌株中大量表达,并多以可溶形式存在。经镍离子亲和层析和阴离子交换法纯化后得到纯度较高的蛋白溶液,浓度为3.6 mg/ml,相对分子质量约51×10^3。纯化的YdiU蛋白在0.5 mol/L Potassium thiocyanate条件下长出蛋白晶体。结论采用大肠埃希菌表达系统可表达可溶性YdiU蛋白,YdiU蛋白在阴离子交换柱上表现为峰型对称的单峰,纯度较高,可用于蛋白质晶体的筛选,为进一步解析YdiU的结构和功能研究奠定了基础。     

鼠伤寒沙门菌修饰酶YdiU的表达、纯化及晶体培养

目的采用大肠埃希菌原核表达体系表达并纯化YdiU蛋白,筛选蛋白质晶体,为其结构和酶活测定等研究奠定基础。方法以生物信息学预测为基础,使用PCR方法从沙门菌基因组中调取ydiU基因,构建ydiU-pGl01重组质粒,转化入大肠埃希菌BL21(DE3)中,诱导蛋白表达。并使用镍离子亲和层析柱和阴离子交换柱对YdiU蛋白进行纯化。纯化后YdiU蛋白利用16种晶体筛选试剂盒在悬滴条件下进行晶体培养。结果成功构建重组表达质粒ydiU-pGl01。IPTG诱导后,YdiU蛋白在大肠埃希菌BL21(DE3)菌株中大量表达,并多以可溶形式存在。经镍离子亲和层析和阴离子交换法纯化后得到纯度较高的蛋白溶液,浓度为3.6 mg/ml,相对分子质量约51×10~3。纯化的YdiU蛋白在0.5 mol/L Potassium thiocyanate条件下长出蛋白晶体。结论采用大肠埃希菌表达系统可表达可溶性YdiU蛋白,YdiU蛋白在阴离子交换柱上表现为峰型对称的单峰,纯度较高,可用于蛋白质晶体的筛选,为进一步解析YdiU的结构和功能研究奠定了基础。     

C2株蓝氏贾第鞭毛虫组蛋白H3基因的克隆表达与基因分析

目的克隆表达C2株蓝氏贾第鞭毛虫H3组蛋白基因,与WB株蓝氏贾第鞭毛虫进行同源分析,构建C2株蓝氏贾第鞭毛虫H3组蛋白分子进化树。方法PCR扩增获取H3组蛋白基因,构建pGM—T—H3重组载体,转化E．coli TOP10感受态宿主细胞,挑选阳性克隆并进行序列分析,利用限制性内切酶NcoI和XhoI构建pET28a（＋）一Ha重组载体,转化E．coli Rosetta（DE3）,IPTG诱导组蛋白H3表达,Western blotting鉴定表达,与美国WB株蓝氏贾第鞭毛虫及模式生物H3组蛋白基因和蛋白序列进行同源分析。结果成功克隆表达C2株蓝氏贾第鞭毛虫H3组蛋白基因,同源比对结果显示C2株蓝氏贾第鞭毛虫基因序列与美国WB株完全一致,但与其他现存真核生物亲缘关系较为疏远。结论C2株蓝氏贾第鞭毛虫H3组蛋白分子进化树分析表明贾第虫H3组蛋白基因在进化过程中与其他物种分化较早,本研究结果为进一步研究蓝氏贾第鞭毛虫的生物进化地位提供有价值的实验资料。     

蓝氏贾第鞭毛虫末端结合蛋白 1 基因的克隆与原核表达

目的 克隆并原核表达 C2 株蓝氏贾第鞭毛虫(Giardia lambia,简称贾第虫)末端结合蛋白 1(End-bind- ing protein 1,geb1)基因,获得重组 gEB1 蛋白。 方法 由于 geb1 基因无内含子,我们以 C2 株贾第虫基因组为模板,以国际标准株WB 株geb1 基因序列为参考序列,设计引物克隆 geb1 基因,经 NcoⅠ和 XhoⅠ双酶切与原核表达载体 pET-28α(+)连接,转化感受态 E. coli TOP10,经筛选和测序验证后导入大肠杆菌 E. coli Rosetta(DE3),异丙基-β-D -硫代半乳糖(IPTG)诱导 gEB1 蛋白表达,产物经 SDS-PAGE 和 Western blot 进行检测和验证。 结果 成功构建了表 达 C2 株贾第虫 geb1 基因的原核表达载体 pET-28α(+)- gEB1,转化入大肠杆菌 E. coli Rosetta(DE3),重组菌株经 0. 1 mmol / L IPTG ,30℃低温诱导 5 h, SDS-PAGE 和 Western blot 显示,在相对分子量约 29 KDa 的位置出现目的蛋 白条带,与理论值一致。 结论 用大肠杆菌成功表达了 gEB1 蛋白,为 gEB1 蛋白的功能研究和抗体制备提供了材料。     

蓝氏贾第鞭毛虫α-4贾第素的原核表达及纯化

目的原核表达并纯化蓝氏贾第鞭毛虫的α-4贾第素蛋白。方法经RT—PCR获得a-4贾第素基因片段,经双酶切连入原核表达载体pET-28a（＋）,构建成为重组表达载体pET-28a（＋）-α-4,并转化大肠杆菌Rosetta（DE3）。IPTG诱导后,收集菌体,裂解后进行SDS-PAGE及Western blot检测,并用Ni—NTA亲和层析柱纯化融合蛋白。结果成功构建了原核表达载体pET-28a（＋）-α-4,经IPTG诱导后,在大肠杆菌中高效表达,目的蛋白以包涵体形式存在;SDS-PAGE及Western blot分析显示,在相对分子量约34kD的位置出现目的蛋白条带,与理论值相符;经Ni—NTA亲和层析柱纯化获得了高纯度的重组的α-4贾第素融合蛋白。结论成功克隆、表达并纯化了α-4贾第素蛋白,为α-4贾第素的细胞定位及功能研究提供了必要条件。     

副结核分枝杆菌SOD基因在大肠杆菌中的表达

目的构建副结核分枝杆菌SOD基因的原核表达载体，并在大肠杆菌中获得表达。方法以BamH I和EcoR I双酶切pGEM-T-SOD和pET-28a（＋），并将纯化的SOD基因亚克隆至pET-28a（＋）中，构建原核表达质粒pET-28a—SOD，并将其转化至感受态E．coli BL21（DE3）中，经IPTG诱导后，进行SDS-PAGE和Western bloting分析。结果成功地构建出原核表达质粒pET-28a—SOD，并表达了约26．5 kDa融合外源蛋白带，且具有牛副结核分枝杆菌抗原反应性。结论副结核分枝杆菌SOD基因在大肠杆菌中获得了表达，并具有抗原反应性，为进一步研究SOD作为诊断试剂或亚单位疫苗奠定了基础。     

Stx1B基因克隆、表达及重组蛋白的纯化

目的构建志贺样毒素1B亚单位（Stx1B）的原核表达载体，获取高纯度的Stx1B重组蛋白。方法用PCR法扩增Stx1B，通过基因重组技术克隆入原核表达载体pGEX4T-2，将该重组质粒转化E．col iBL21，IPTG诱导表达，Glutathione Sepharose 4B亲和层析柱纯化重组蛋白，进行SDS-PAGE电泳分析及Western blot检测。结果重组质粒经诱导后表达分子量为34kD的重组蛋白，Western blot检测显示特异性条带，亲和层析柱纯化后得到重组蛋白的纯度在90％左右。结论成功构建了Stx1B重组质粒，表达并纯化出高纯度重组蛋白，为进一步的生物性质研究奠定了基础。     

细粒棘球绦虫H3蛋白的克隆表达及囊型包虫病检测效果评价

目的克隆、表达细粒棘球绦虫基底膜特异性硫酸乙酰肝素聚糖核心蛋白(H3),并评价其检测囊型包虫病的效果。方法将从细粒棘球绦虫原头节cDNA文库中免疫筛选的H3基因,克隆入pGEX-4T表达载体,将重组质粒转化大肠杆菌BL21细胞,用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达,用亲和层析法纯化重组蛋白,用ELISA方法检测囊型包虫病患者血清、其他寄生虫病患者血清及健康人血清,评价其检测效能,并与本课题组制备的细粒棘球蚴包囊液粗抗原(Hydatid cyst fluid,HCF)和重组Ag B8/2进行比较。结果成功构建细粒棘球蚴pGEX-4T-H3重组质粒,并在原核细胞中成功表达。重组H3抗原、纯化HCF和rAgB8/2检测囊型包虫病患者血清的敏感度分别为84.0%(68/81)、90.1%(73/81)、77.8%(63/81),3者差异无统计学意义(χ~2=4.58,P0.05)。重组H3抗原与泡型包虫病患者、囊虫病患者及血吸虫病患者血清分别存在63.3%(19/30)、16.7%(5/30)和5.0%(1/20)的交叉反应,与50份健康者血清无交叉反应;H3检测总特异度为80.8%(105/130),H3、纯化HCF[71.5%(93/130)]和rAgB8/2[82.3%(107/130)]特异度间差异无统计学意义(χ~2=5.71,P0.05)。结论重组H3抗原在囊型包虫病诊断上具有潜在的应用价值。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A反式激活基因4剪切体Ns5atp4a基因原核表达载体的构建和表达

目的构建丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A反式激活基因4剪切体（NS5ATP4A）的原核表达载体并进行表达。方法用PCR扩增NS5ATP4A基因,克隆入pET32a（＋）质粒,构建pET32a（＋）-NS5ATP4A表达重组体,转化DH5α和BL21菌,经IPTG诱导。SDS-PAGE分析,Western Blot验证蛋白带。结果成功构建大肠杆菌原核表达载体。经IPTG诱导,得到了目的蛋白分子量为35kD,用Western Blot证实其具有良好的抗原性。结论构建原核表达载体pET32a（＋）-NS5ATP4A,为抗原的制备及临床检测奠定了基础。     

肺孢子虫（菌）p55抗原嵌合基因的克隆及表达产物分析

目的构建肺孢子虫（菌）p55蛋白嵌合基因的原核表达载体,分析、鉴定及纯化表达产物。方法自NCBI网站的蛋白数据库中获取p55抗原及4个变异体信息,运用生物信息学方法预测可能的抗原表位,设计包含多个可能抗原表位的多肽,根据遗传中心法则及大肠杆菌密码子偏好性进行密码子优化,将氨基酸序列转化为核苷酸序列,将人工合成的嵌合基因（CAG）片段连接到质粒pGEX-6p-1（含GST标签）上,构建原核表达载体pGEX-6p-1/CAG,酶切、测序鉴定。pGEX-6p-1/CAG转化大肠杆菌,异丙基-β-D硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达重组融合蛋白CAG-GST。表达产物用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）及Western-blotting分析鉴定。结果双酶切及测序结果显示重组质粒pGEX-6p-1/CAG构建成功。SDS-PAGE显示重组融合蛋白相对分子量约为69 000。Western-blotting结果显示,表达的融合蛋白为CAG-GST。结论成功构建表达p55蛋白嵌合基因的原核表达载体pGEX-6p-1/CAG,建立表达重组蛋白的原核表达系统。     

日本血吸虫21.7kDa膜蛋白的表达及特性分析

目的　对日本血吸虫中国大陆株 2 1 .7kDa膜蛋白分子 (SjC2 1 .7)进行体外重组表达 ,纯化并分析其免疫特性。　方法　将SjC2 1 .7分子基因亚克隆到表达载体 pGEX 4T 3中构建重组表达质粒。重组质粒转化大肠杆菌 ,经IPTG诱导 ,表达GST SjC2 1 .7融合蛋白 ,用亲和层析及蛋白酶切制备纯化的重组SjC2 1 .7分子。将重组SjC2 1 .7免疫小鼠制备抗血清 ,用Westernblotting分析其免疫特性。　结果　SjC2 1 .7分子基因被成功地克隆到表达质粒 pGEX 4T 3中 ,并获得能表达GST SjC2 1 .7融合蛋白的转化子。纯化的重组SjC2 1 .7蛋白免疫昆明鼠能产生高效价的抗体。该重组蛋白能被免疫鼠血清和重感染兔血清所识别 ,免疫鼠血清能识别成虫抗原 (AWA)中相应分子量的蛋白质条带。　结论　本研究获得具有较好免疫原性的重组SjC2 1 .7蛋白质分子 ,为进一步研究其免疫保护性作用奠定了基础     

弓形虫Rhomboid-1蛋白基因的克隆及原核表达

目的克隆并原核表达刚地弓形虫（Toxoplasmagondii）Rhomboid-1（TgROMl）蛋白。方法收集、纯化弓形虫速殖子,用Trizol法提取总RNA,应用RTPCR技术扩增TgROMl基因,回收的PCR产物与pMDl8-T载体连接,构建重组克隆质粒pMDl8-T-TgROMl。将重组克隆质粒亚克隆至原核表达载体pGEX一4T—l中,构建重组表达质粒pGEX-4Tl-TgR（）M1并转化至Rosetta感受态,用IPTG诱导表达,表达产物进行SDS-PAGE和Westernblot分析。结果成功克隆了643bp的TgROMl基因,双酶切鉴定重组表达质粒pGEX-4T-1-TgROMl构建正确。SDS-PAGE检测重组表达质粒表达的TgROMl蛋白分子质量约为48ku,Westernblot检测表明该蛋白能被鼠抗弓形虫血清识别。结论成功克隆了弓形虫ROMl基因并原核表达了具有反应原性的重组TgROMl蛋白,为该蛋白的功能研究奠定了基础。