实时荧光定量PCR法分析结核分枝杆菌对异烟肼耐药的分析

目的利用实时荧光定量PCR技术快速检测异烟肼耐药结核分枝杆菌。方法收集到医院就诊的结核病疑似患者痰液样本,提取痰液样本的总DNA,利用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)技术对结核分枝杆菌感染进行快速筛查,并与传统药敏试验进行比较,对两者的灵敏度、特异性、一致性进行比较分析。结果检测346例结核病人临床分离培养样本,药敏试验检出257例异烟肼敏感标本,101例异烟肼耐药标本;实时荧光定量PCR法共检测出异烟肼敏感和耐药标本225例98例,灵敏度为86.64%,特异性为93.92%,一致率为93.12%。结论跟传统药物敏感性实验相比,实时荧光定量PCR法检测速度快速、特异性强、灵敏度较高,可用于结核分枝杆菌耐异烟肼突变的快速检测,适于耐多药结核病的快速筛查。     

实时荧光定量PCR检测人类EZH2基因方法的建立

目的:建立SYBR Green Ⅰ实时荧光PCR定量检测人类EZH2基因的方法.方法:将EZH2 RT-PCR扩增片段克隆入载体pGEM-T后,经测序鉴定正确后,进行纯化和定量及系列稀释,应用SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测EZH2,建立标准曲线,熔解曲线分析产物的特异性.结果:该法检测的最低拷贝数为10,线性范围为101～108拷贝,相关系数r为-1.00,104copies/μl标本的批内变异系数(CV)和日间CV分别为1.0%和2.7%.熔解曲线分析显示单一的峰,熔解温度(Tm)为(83.42±0.13)℃.结论:实时荧光定量PCR方法检测EZH2基因,具有高敏感性、高特异性和高精确性等优点,可作为进一步研究EZH2的方法.     

高致病性猪链球菌2型多重实时荧光定量PCR检测方法的建立

目的建立对高致病性猪链球菌2型毒力基因SalK、virB4-89K、cps2J同步检测的多重实时荧光定量PCR检测方法。方法根据SalK、virB4-89K、cps2J基因保守区域设计并合成3对引物及其探针;通过反应体系和扩增条件优化,建立快速鉴定高致病性猪链球菌2型的方法,并对方法的特异性、敏感性、重复性指标进行评估。结果反应体系具有良好的扩增效率,全部扩增检测可在60min内完成。SalK、virB4-89K、cps2J基因检测灵敏度分别为19cfu/ml、27cfu/ml和32cfu/ml。重复性试验中变异系数均小于3%。用该方法考核33株猪链球菌,包括1/2型、1型、3型至33型,以及9株常见对照菌株,仅猪链球菌1/2型检测到cps2J基因荧光信号增强。对疫情现场获得的SS2感染者血液进行检测,3个基因均阳性。结论建立的多重实时荧光定量PCR方法可快速检测高致病性猪链球菌2型,并能鉴定是否含有89K毒力岛基因SalK、virB4-89K,具有敏感、特异、重复性好的特点。     

实时荧光定量PCR检测GI型诺瓦克样病毒方法的建立

目的建立临床粪便中GI型诺瓦克样病毒的实时荧光定量PCR检测方法。方法针对诺瓦克样病毒GI型保守序列,用序列比对软件设计特异性引物与探针,建立诺瓦克样病毒实时荧光定量PCR检测方法。并用常规RT-PCR和本文建立的实时荧光定量PCR对137份临床腹泻标本进行检测。结果该方法对诺瓦克样病毒检测准确,重复性好,标准曲线的线性范围为102～107拷贝,相关系数为0.9991。并且对临床标本的检出率显著高于普通RT-PCR。结论本研究建立的实时荧光定量PCR方法可用于检测临床腹泻粪便标本中的GI型诺瓦克样病毒,从而有效预防和控制该病毒的传染。     

实时定量PCR技术在寄生虫学中的应用

寄生虫计数所用的标准方法一般耗时、困难 ,准确率低。近来在寄生虫学特别是疟原虫、弓形虫、利氏曼原虫及新孢子虫等检测时使用了实时定量PCR反应 ,此技术定量准确、快速、扩增后不需要进行数据后处理。此外 ,在估算基因组容量和基因表达水平的研究方面也能应用这种方法。本文讨论目前常用的此类检测系统的优势及其局限性。     

结核杆菌DNA实时定量PCR检查在肾结核诊疗中的应用

目的 探讨结核杆菌DNA PCR检查在肾结核诊疗中的应用.方法 收集仙桃市第一人民医院肾结核患者肾脏活检组织,进行结核杆菌DNA实时定量PCR检测,观察该法诊断肾结核的敏感度；对肾结核患者进行正规治疗后观察其尿液结核杆菌DNA含量；对门诊疑似肾结核患者行尿液结核杆菌DNA实时定量PCR检测并随访,观察患者最终诊断肾结核等临床转归情况.结果 (1)与结核杆菌尿培养结果对比,实时定量PCR检测敏感度显著增高(P＜0.05)；(2)经过正规抗结核治疗后,与治疗前相比,肾结核患者尿液TB DNA含量显著降低(P＜0.05)；(3)随访调查发现,检验半年后,与随访对照组相比,随访组经实时定量PCR检验后,患者确诊率显著增高(P＜0.05)；接受手术治疗率两组间无显著差异(P＞0.05).结论 肾脏结核杆菌DNA实时定量PCR对于诊断肾结核具有较高敏感性,尿液结核杆菌DNA实时定量PCR有助于早期发现肾结核.     

实时荧光定量PCR检测肝癌患者外周血甲胎蛋白mRNA水平

在生理状态下 ,甲胎蛋白 (AFP)基因主要由胎肝细胞表达产生 ,出生后该基因表达迅速受到抑制。肝细胞大量坏死或发生原发性肝癌时 ,AFP基因再次激活[1] 。我们采用以Taqman技术为基础的实时荧光定量PCR技术 ,检测各型肝癌患者外周血细胞中AFPmRNA水平 ,分析外周血中是否存在肝癌细胞 ,并判断该方法检测肝癌细胞血液转移的可行性。一、材料与方法1 病人与标本 :本院 2 0 0 2年 8～ 12月收治的 5 7例肝癌患者 ,血清学AFP检测阳性 ,经影像学、组织病理学检查确诊为原发性肝癌。抽取肝癌住院患者晨血 5ml,EDTA抗凝。对照组为健康体检者…     

实时荧光定量PCR技术检测肺炎衣原体的诊断价值

目的探讨实时荧光定量PCR技术检测肺炎衣原体的诊断价值。方法对呼吸道感染的186例患者的痰液分别采用实时荧光定量PCR技术和基因测序检测,以评价实时荧光定量PCR技术检测肺炎衣原体感染的准确性。结果实时荧光定量PCR检测肺炎衣原体的灵敏度为100.0%,特异度为93.1%,阳性预期值为80.8%,阴性预期值为100.0%,准确率为94.6%。结论实时荧光定量PCR技术检测肺炎衣原体具有较高的可靠性,适用于临床快速诊断肺炎衣原体感染的相关疾病。     

2型糖尿病患者皮下、大网膜脂肪组织脂联素mRNA表达的定量研究

目的　探讨 2型糖尿病患者皮下及大网膜脂肪组织脂联素 (adiponectin)表达水平及与血脂联素、体重指数、腰臀比 (WHR)、胰岛素敏感性的相关关系。方法　用实时荧光定量RT PCR检测 2型糖尿病患者和非糖尿病患者皮下及大网膜脂肪组织脂联素mRNA的表达水平 ,用ELISA方法测定血浆脂联素水平。结果　 2型糖尿病患者大网膜脂肪组织脂联素mRNA表达水平较非糖尿病组显著下降 (P <0 .0 5 ) ;糖尿病组与非糖尿病组的血浆脂联素水平差异无显著性 ;糖尿病组大网膜脂肪组织脂联素mRNA表达与WHR成负相关 (r=- 0 .5 1,P <0 .0 5 )。糖尿病组血浆脂联素水平与大网膜脂肪组织脂联素mRNA的表达成正相关 (r=0 .5 7,P <0 .0 1)。结论　 2型糖尿病患者大网膜脂肪组织脂联素mRNA表达显著降低。内脏脂肪组织脂联素mRNA的表达水平可以作为胰岛素抵抗的重要参数。     

实时荧光定量PCR在登革热病毒快速检测中的应用

目的应用实时荧光定量PCR快速检测登革热病毒感染。方法采集疑似登革热患者血清,采用实时荧光定量PCR检测登革热病毒,同时采用ELISA检测血清登革热IgM抗体。结果患者发病第7d血清登革热IgM血清抗体A值为0.236和0.237(临界值0.250),高度疑似阳性,第13d血清IgM抗体阳性。患者发病第2d,通用型核酸检测显示血清登革热病毒核酸含量较多,经过治疗,于第7d病毒拷贝下降。发病第2d,核酸检测确定感染病毒为登革热Ⅲ型;发病第13d血清登革Ⅲ型病毒核酸检测阴性。结论实时荧光定量PCR法具有准确性好、灵敏度高等优点,可用于登革热病毒感染的快速检测。     

老年2型糖尿病骨质疏松与骨容积改变影响因素研究

目的研究老年2型糖尿病（type2diabetesmellitus,T2DM）患者骨质疏松（osteoporosis,OP）的发生情况及其危险因素,并探讨骨容积改变的影响因素。方法采用双能x线骨密度仪测定47例老年T2DM患者的腰椎L2-4骨密度（BMD）,参照WHO规定的OP诊断标准来判定其有无合并OP,并测定血生化指标（血清骨碱性磷酸酶、骨钙素、甲状旁腺素、I型胶原c端肽、25羟维生素D、血钙、血脂、糖化血红蛋白、空腹及餐后2h血糖、胰岛素等）,同时应用容积定量CT（volumetricquantitativeCT,vQCT）测定腰椎L3的骨容积,并分析其与血生化等指标的相关性。结果老年T2DM患者OP发生率为46．8％,Logistic回归分析显示,BMI、餐后2h血糖是OP发生的独立危险因素,而空腹血糖、胰岛素、糖化血红蛋白、骨碱性磷酸酶等与OP发生无关。相关分析显示,容积定量CT测量所得L3每单位高度容积（cm3／cm）与年龄和骨碱性磷酸酶呈负相关（r=-0．343,P〈0．05;r=-O．466,P〈0．05）,与BMI和血钙呈正相关（4=0．403,P〈0．01;r=0．376,P〈0．05o结论老年T2DM人群有较高的OP患病率,低体重指数、餐后高血糖都是OP发生的高危因素,而骨小梁容积改变与年龄、BMI、血钙、骨碱性磷酸酶等因素相关。因此在对老年T2DM患者的诊治中,要注意稳定体重、控制餐后血糖以及补充钙等要点,对进一步延缓骨质量改变及预防OP发生有重要意义。     

实时荧光定量PCR方法检测幼兔粪便双歧杆菌的实验研究

目的:应用实时荧光定量PCR技术对实验幼兔粪便内双歧杆菌进行定量分析．方法:依据双歧杆菌16S rDNA序列设计属特异性引物,以常规PCR产物经克隆后的质粒 DNA为标准品,经光谱定量、梯度稀释后制备标准曲线．抽提正常对照组和双歧杆菌喂饲组幼兔粪便内的细菌基因组DNA,用实时荧光定量PCR技术定量分析样品中双歧杆菌数量．结果:两组幼兔粪便内双歧杆菌测定结果均成阳性,双歧杆菌喂饲组0．05 g湿粪内菌量的对数值较对照组显著升高(6．37±0．58 vs 5．18 ±0．98,P=0．004)．结论:实时荧光定量PCR方法可正确定量实验兔粪便内双歧杆菌数量．     

肥胖2型糖尿病肾病患者微量白蛋白排泄率与胰岛素抵抗及血浆纤溶系统相关性研究

目的探讨肥胖2型糖尿病(T2DM)肾病患者胰岛素敏感性与血浆纤溶系统相关性。方法对108例肥胖T2DM患者及31例健康体检者进行体格检查,采用生物电阻抗法测定其体脂含量,测定其24h尿白蛋白排泄量、血脂、空腹血糖、糖基化血红蛋白(HbA1c)及胰岛素水平、血浆组织型纤溶酶原激活物(tPA)及其抑制物1(PAI1)活性和D二聚体(DD)水平。结果大量白蛋白尿组肥胖度、HbA1c和胰岛素敏感性指数(ISI)分别大于和小于微量白蛋白尿组和尿白蛋白正常组(均P<005)。与正常对照者比较,肥胖T2DM患者血浆PAI1活性明显升高(均P<005),大量白蛋白尿组更明显;糖尿病肾病患者血浆tPA活性及大量白蛋白尿组DD水平大于正常对照者(P<005,P<001)。多因素逐步回归分析显示,PAI1活性与BMI、腰围及血清TG水平呈正相关,与ISI呈负相关。结论肥胖T2DM肾病患者尤其是向心性者血浆PAI1活性及DD水平明显增加,而tPA活性减低,并随着肾病的加重而增加,与肥胖程度呈正相关、与ISI呈负相关。     

实时荧光定量PCR在手足口病肠道病毒快速检测中的应用

目的建立快速检测手足口病肠道病毒的实时荧光定量PCR法,并作出应用分析。方法采用卫生部《手足口病预防控制指南》(2008年版)推荐的RT-PCR法,对丽水市2008年4～5月间发生的172例临床诊断手足口病患者的324份标本进行人肠道病毒、柯萨奇病毒A组16型和肠道病毒EV71型特异性核酸的检测,同时采用实时荧光定量PCR法进行平行检测,比较两者的实验结果,分析实时荧光定量PCR方法的特异性和灵敏度。结果实时荧光定量PCR检测324份标本,肠道病毒通用核酸阳性70份,柯萨奇A16核酸阳性22份,肠道EV71病毒核酸阳性15份,与RT-PCR结果一致,符合率100%。结论实时荧光定量PCR法具有特异性强、灵敏度高等优点,是一种理想的手足口病肠道病毒的检测方法。     

C-反应蛋白与2型糖尿病大血管病变的相关性研究

目的 探讨C-反应蛋白(CRP)与糖尿病大血管病变发生的关系。方法 用ELISA方法测定2型糖尿病(T2DM)患者、无糖尿病的大血管病变患者以及正常对照组的CRP水平变化。结果 T2DM伴有或不伴有大血管并发症患者以及无糖尿病的大血管病变患者间血清cRP水平无显著差异；大血管病变患者血清cRP水平较非大血管病变者明显增高。结论 cRP在T2DM大血管病变的发生发展中具有致病作用。     

实时定量PCR检测B细胞非霍奇金淋巴瘤患者外周血和骨髓IgH基因重排及临床意义

目的:检测B细胞非霍奇金淋巴瘤(B-NHL)患者外周血和骨髓中IgH基因重排并探讨其在临床诊治中的应用。方法:利用SYBR GreenⅠ荧光染料,采用实时定量PCR方法,以IgH基因为标志,对B-NHL患者治疗后采集的15例外周血及10例骨髓的IgH基因重排进行定量分析。结果:15例外周血及10例骨髓均检测到IgH基因拷贝数,外周血和骨髓差异无统计学意义(P>0.05)。结论:实时定量PCR方法对外周血和骨髓中IgH基因重排定量分析,可以作为B-NHL鉴别诊断和随访微小残留病的辅助手段,并对判断疗效、预测复发有一定的临床意义。外周血和骨髓IgH基因拷贝数差异无统计学意义。     

两种方法定量分析肝硬化患者肠道菌群改变的比较

目的观察肝硬化患者肠道菌群改变,探讨传统培养法与实时定量PCR检测结果的一致性。方法纳入73名肝硬化患者及55名健康人,对其粪便细菌进行传统培养及定量PCR,比较两种方法检测结果的一致性。结果细菌培养结果显示,与正常对照组比较,肝硬化患者肠杆菌、肠球菌、葡萄球菌、酵母菌数量显著增加（P分别为0.004、0.002、0.044、0.026）,拟杆菌、乳酸杆菌、双歧杆菌、梭菌数量显著降低（P分别为0.029、0.046、0.045、0.045）。定量PCR结果显示,肝硬化组肠杆菌、肠球菌数量显著增高（P分别〈0.01、0.012）,乳酸杆菌、双歧杆菌、拟杆菌及梭菌数量显著降低（P均为〈0.01）。结论肝硬化患者存在不同程度肠道菌群失衡,可能影响病情发展。传统细菌培养与荧光定量PCR的结果具有良好的一致性,但定量PCR更精确、灵敏、省时、省力。     

女性2型糖尿病患者无症状菌尿致病菌及其药敏结果分析

目的：分析女性2型糖尿病（T2DM）无症状菌尿（ASB）培养和药敏试验结果,指导临床应用抗菌素。方法对2010-06～2011-12住院的324例女性T2DM伴ASB患者尿培养和药敏试验结果进行回顾性分析。结果本组培养阳性率为65.7％,其中G-杆菌占60.7％,G＋球菌占34.6％,念珠菌属占4.7％。 G-杆菌中大肠埃希菌、变形杆菌居多,对氨苄西林、环丙沙星及复方新诺明普遍耐药,对第三代头孢菌素敏感。G＋球菌中以肠球菌属多见,对大多数药物不敏感,对万古霉素极少耐药。结论女性T2 DM伴ASB患者致病菌以大肠埃希菌、肠球菌多见,对多数常用的抗生素不敏感,应根据药敏试验结果指导用药。