重组腺病毒介导的人p27kip1基因高表达对体外培养的大鼠主动脉血管平滑肌细胞迁移的影响

目的　探讨重组腺病毒介导的p2 7kip1基因及其蛋白产物高表达对血管平滑肌细胞 (VSMCs)迁移的抑制作用。方法　将含人p2 7kip1cDNA的重组腺病毒 (Adhp2 7kip1)及含 β 半乳糖苷酶基因的重组腺病毒 (AdLacZ)在体外转染原代大鼠主动脉VSMCs,用Westernblot及Boyden趋化小室检测外源性p2 7kip1蛋白在细胞内的表达及对VSM Cs迁移的影响。结果　转染后 2 4h ,Adhp2 7kip1转染的VSMCs内p2 7kip1蛋白高表达 ,而AdLacZ转染的VSMCs内仅显示极低水平的内源性p2 7kip1蛋白表达 ;Boyden趋化小室检测显示未转染的VSMCs、AdLacZ及Adhp2 7kip1转染的VSMCs血清诱导后的迁移细胞数分别为 139± 2 6、10 6± 16及 6 8± 14。结论　外源性p2 7kip1基因及蛋白产物在VSMCs内高表达可显著抑制VSMCs的迁移     

腺病毒介导gax基因转染在培养的血管平滑肌细胞中的表达

目的 以腺病毒介导gax基因转染血管平滑肌细胞(VSMC)，增强VSMC中gax基因的表达。方法 采用位置特异性重组方法构建携带大鼠gax基因表达序列的复制缺陷型5型腺病毒载体(AdCMV-gax)，经293细胞扩增，纯化制备高滴度病毒转染液；以病毒转染液常规转染VSMC后，应用RT—PCR、流式细胞仪和免疫细胞化学等方法分别检测VSMC中gax mRNA和蛋白质的表达。结果 流式细胞仪检测和免疫细胞化学染色均显示．AdCMV—gax转染VSMC后，VSMC的Gax蛋白表达率明显增高，转染后24小时即可达80％左右，高水平的表达可维持5天以上；AdCMV—gax转染前，PDGF—BB对gax基因转录和翻译水平的表达均有下调作用，AdCMV—gax转染后，无论有无PDGF—BB刺激，VSMC中gax基因的表达均比转染前显著增高。结论 腺病毒载体可有效地介导gax基因转染VSMC，并且表达为蛋白质。这有利于进一步研究gax基因对VSMC生物学行为的影响。     

腺病毒介导gax基因转染在培养的血管平滑肌细胞中的表达

目的以腺病毒介导gax基因转染血管平滑肌细胞(VSMC),增强VSMC中gax基因的表达.方法采用位置特异性重组方法构建携带大鼠gax基因表达序列的复制缺陷型5型腺病毒载体(AdCMV-gax),经293细胞扩增,纯化制备高滴度病毒转染液;以病毒转染液常规转染VSMC后,应用RT-PCR、流式细胞仪和免疫细胞化学等方法分别检测VSMC中gax mRNA和蛋白质的表达.结果流式细胞仪检测和免疫细胞化学染色均显示AdCMV-gax转染VSMC后,VSMC的Gax蛋白表达率明显增高,转染后24小时即可达80%左右,高水平的表达可维持5天以上; AdCMV-gax转染前,PDGF-BB对gax基因转录和翻译水平的表达均有下调作用,AdCMV-gax转染后,无论有无PDGF-BB刺激,VSMC中gax基因的表达均比转染前显著增高.结论腺病毒载体可有效地介导gax基因转染VSMC,并且表达为蛋白质.这有利于进一步研究gax基因对VSMC生物学行为的影响.     

人肝细胞生长因子基因腺病毒重组体的构建及转染血管平滑肌细胞的表达

为探讨构建能表达肝细胞生长因子基因的腺病毒重组体的方法，以及这种腺病毒重组体能否在血管平滑肌细胞表达。将含有肝细胞生长因子基因片段的质粒用限制内切酶酶切，以琼脂糖凝胶电泳回收得到目的基因片段：将它用DNA连接酶插入至腺病毒穿梭质粒中，并用限制内切酶鉴别插入方向，得到插入方向正确的重组腺病毒穿梭质粒。用限制内切酶酶切重组腺病毒穿梭质粒和表达载体，使它们线性化；以电转化方法使它们共转化至BJ5183细胞中进行同源重组，构成肝细胞生长因子基因腺病毒重组体。以脂质体为转染介质，将肝细胞生长因子基因腺病毒重组体转染到人胚肾细胞中进行包装，使病毒复性具有感染能力。用包装后的肝细胞生长因子基因腺病毒重组体感染体外培养的大鼠主动脉平滑肌细胞；经逆转录一聚合酶链反应和蛋白印迹检测发现肝细胞生长因子呈现过表达。此外，酶切及测序发现重组腺病毒穿梭质粒和肝细胞生长因子基因腺病毒重组体是正确的；绿色荧光蛋白标记对重组体在人胚肾细胞中的包装及包装后感染大鼠主动脉平滑肌细胞进行了荧光示踪。结果提示，肝细胞生长因子基因腺病毒重组体构建成功，为血管疾病转基因治疗奠定了基础，具有一定临床价值，     

腺病毒介导eNOS基因转染对血管平滑肌细胞生物学行为的影响

本研究利用基因重组技术构建携带人eNOS基因的复制缺陷腺病毒 ,转染培养的血管平滑肌细胞 (VSMCs) ,探讨其对VSMCs增殖、迁移和凋亡的影响。1 材料与方法 :( 1)质粒和细胞 :含人eNOScDNA质粒 ,pHCMVSP1A、pJM17,大肠杆菌DH5a。 ( 2 )试剂 :氚标胸腺嘧啶核苷 ( 3 H TdR)、氚标亮氨酸 ( 3 H Leucine)。NOS活性测定试剂盒。血小板源性生长因子。 ( 3)仪器 :液体闪烁计数仪 ,流式细胞仪 ,改良的BoydenChamber。 ( 4 )重组腺病毒载体的构建 :重组腺病毒载体AdCMV/eNOS由本课题组按《分子克隆》第二版的同源重组方法构建。对照…     

野生型p53基因转移对体外增减的血管平滑肌细胞增殖的抑制？…

正确构建了介导野生型Ｐ５３基因转移的复制缺陷重组腺病毒，将其感染体外增减的兔血管平滑肌细胞，结果表明腺病毒能介导野生型ｐ５３基因高效地转移和表达，对ＶＳＭＣ的增殖具有明显的帽作用；     

P27kip1在血管平滑肌细胞中的研究进展

细胞周期的正常运行决定细胞的增生、分化和凋亡，并受细胞周期素（Cyclin）、细胞周期素依赖激酶（cyclin-dependent kinase，CDK）和细胞周期素依赖激酶抑制蛋A（cyclin-dependent kinase inhibitor，CKI）在多个层次上的共同调节。前二者结合可催化细胞周期进程，CKI是细胞周期的负性调控因子，通过抑制Cyclin-CDK复合物的形成及生物活性，作用于细胞周期的不同时相，抑制细胞过度增生，延缓或阻滞细胞周期进程，并参与血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）的增生。VSMC的异常增生、迁移和分化是许多血管增生性疾病如动脉粥样硬化（atheroselerosis，AS）、高血压（essensial hypertension，EH）和经皮冠状动脉腔内成形术（PTCA）后再狭窄（restenosis after angioplasty，RAA）的主要病理学特征。因此研究CKI表达对VSMC的作用已成为防治AS、RAA等血管增生性疾病的国内外研究热点。     

野生型p53基因转移对血管平滑肌细胞增殖的抑制作用

作者用正确构建的带野生型p53基因的复制缺陷型重组腺病毒感染体外培养的血管平滑肌细胞(VSMC),结果表明p53基因转移对VSMC的增殖具有明显的抑制作用;PCR扩增法证实了病毒感染的VSMC中含有外源性p53基因;半定量逆转录PCR方法显示有p53基因mRNA的表达;Western blot印迹转移证明有外源性p53蛋白的表达。进一步证明了作者构建的重组p53腺病毒载体的正确性和有效性,为高血压病、动脉粥样硬化、PTCA术后再狭窄等疾病的基因治疗提供了实验依据。     

血管紧张素Ⅱ型受体基因转染表达对血管平滑肌细胞迁移的影响

目的 :探讨血管紧张素 （Ang ） 2型受体 （AT2 R）基因表达对血管平滑肌细胞 （VSMC）迁移能力的影响。方法 :构建带 AT2 R基因的重组复制缺陷腺病毒载体 （Ad CMV - AT2 R） ,体外转染培养的大鼠主动脉 VSMC,用流式细胞仪检测 AT2 R转染表达率 ,RT- PCR方法检测 AT2 R m RNA表达 ,VSMC迁移用改良 Boyden’s趋化小室法检测 ,用激光共聚焦显微镜检测细胞骨架蛋白 F- actin的表达。结果 :构建的 Ad CMV - AT2 R体外转染培养 VSMC表达率为 89.5 %。 AT2 R峰值表达时 ,VSMC的跨膜迁移数降低 6 2 .2 % ,F- actin表达明显减少。结论 :AT2 R转染表达可显著抑制体外培养 VSMC迁移 ,这为防治血管再狭窄提供了新的思路。     

野生型p53基因转移对体外培养的血管平滑肌细胞增殖的抑制作用及其机制的研究

正确构建了的介导野生型ｐ５３基因转移的复制缺陷型重组腺病毒，将其感染体外培养的兔血管平滑肌细胞（ＶＳＭＣ），结果表明腺病毒能介导野生型ｐ５３基因高效地转移和表达，对ＶＳＭＣ的增殖具有明显的抑制作用；应用电镜、流式细胞计数仪、原位末端标记等方法，探讨野生型ｐ５３基因抑制ＶＳＭＣ增殖的机制。结果显示ｐ５３基因转移可有效地导致ＶＳＭＣ明显的Ｇ１期阻滞及大量凋亡，为高血压病、动脉粥样硬化、ＰＴＣＡ术后再狭窄等疾病的基因治疗提供了实验依据     

Inhibition of adenovirus-mediated p27kip1 gene on growth of esophageal carcinoma cell strain

AIM: To investigate the inhibition of p27kip1 gene on the growth of esophageal carcinoma cell strain (EC9706). METHODS: Recombinant adenovirus Ad-p27kip1 was constructed and transfected into esophageal carcinoma cell EC-9706, and its effect on p27kip1 expression, the growth of esophageal carcinoma cell, DNA replication, protein synthesis, cell multiplication and apoptosis were explored by means of cell growth count, 3H-TdR, 3H-Leucine incorporation, flow cytometry, DNA fragment analysis and TUNEL. RESULTS: Recombinant adenovirus Ad-p27kip1 was successfully constructed with a virus titer of 1.24 X 10(12) pfu/ml. p27kip protein expression increased markedly after EC-9706 transfection, while incorporation quantity of 3H-TdR and 3H-Leucine decreased significantly. The growth of esophageal carcinoma cell was inhibited obviously. Testing of flow cytometry displayed a typical apoptosis peak, and DNA gel electrophoresis showed a typical apoptosis ladder. TUNEL showed the apoptosis rate of Ad-p27kip1 group and control group to be 37.3% and 1.26% (P<0.001) respectively. CONCLUSION: Ad-p27kip1 can inhibit the growth and multiplication of esophageal carcinoma cells and induce apoptosis. Therefore, enhanced p27kip1 expression may be a new way to treat esophageal carcinoma.     

可罗卡林对血管平滑肌细胞增殖及c-myc基因表达的影响

目的：观察对大鼠主动脉平滑肌细胞起负调节作用的可罗卡林(cromakalim对同型半胱氨酸(hcy)刺激的血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells，VSMC)增殖及c—myc基因表达的影响。方法：在建立hcy诱导的平滑肌细胞增殖模型后，应用流式细胞术观察VSMC增殖周期的变化；并用免疫细胞化学方法观察可罗卡林对VSMC增殖及c—myc基因蛋白表达的影响。结果：可罗卡林使VSMC处于G0／G1期的细胞数显著增多(P＜0．01)，S期G2 M期的细胞数显著减少(P＜0．01．)，能够抑制hcy诱导的VSMC增殖和c—myc基因蛋白表达的增加。结论：可罗卡林对hcy诱导的VSMC增殖有显著的抑制作用，其作用机制与抑制c—myc基因表达有关。     

姜黄素对血管平滑肌细胞增殖及cyclinD1和p21waf1/cip1蛋白表达的影响

目的 观察姜黄素（curcumin）抑制大鼠血管平滑肌细胞(VSMC)增殖和诱导细胞周期停滞的作用,以及对细胞周期蛋白cyclinD1,p21waf1/cip1表达的影响。方法 采用组织贴块法体外培养大鼠VSMC,MTT法测定姜黄素对VSMC增殖的抑制作用,流式细胞仪分析细胞周期分布,Western印迹法检测cyclinD1,p21waf1/cip1蛋白的变化。结果 MTT示不同浓度姜黄素(7.5～120 μmol/L)在24～72 h范围内,浓度和时间依赖性抑制VSMC增殖;30 μmol/L以上浓度姜黄素显著抑制增殖的VSMC细胞周期进程,使S及G2/M期减少(P<0.05),G0/G1期增加(P<0.05);30 μmol/L的姜黄素可抑制cyclinD1表达,促进p21waf1/cip1蛋白表达。结论 姜黄素具有明确的抑制VSMC增殖和细胞周期停滞的作用,其与cyclinD1,p21waf1/cip1蛋白变化有关。     

组织因子途径抑制物基因转移对大鼠血管平滑肌细胞凋亡的影响

目的 研究组织因子途径抑制物(TFPI)基因转移对大鼠血管平滑肌细胞(VSMC)凋亡的影响,探讨其抑制血管成形术后再狭窄的机制.方法 在体外培养的大鼠VSMC中分别转染含有人TFPI基因的重组腺病毒(Ad-TFPI)、含β-半乳糖苷酶基因的重组腺病毒(Ad-LacZ)或PBS.通过RT-PCR方法检测外源TFPI基因的表达.细胞计数和MTT法测定细胞生长情况.电镜技术、流式细胞仪和TUNEL法分别检测细胞凋亡情况.结果 基因转移后3 d在VSMC中检测到TFPI mRNA的表达.细胞计数结果显示第1、3、5天各组细胞数无明显差异,而第7天Ad-TFPI组细胞数明显少于Ad-LacZ组和PBS组(P＜0.05).MTT结果显示基因转移后第1、3、5天各组细胞的吸光度值比较差异无统计学意义,而第7天Ad-TFPI组的吸光度值明显低于Ad-LacZ组(P＜0.05)和PBS组(P＜0.01).流式细胞仪检测结果显示基因转移后3、5、7 d Ad-TFPI组细胞早期凋亡结果均高于Ad-LacZ组.基因转移后3 d和7 d,Ad-TFPI组TUNEL阳性率分别为(10.82±1.57)%和(16.95±2.01)%,明显高于Ad-LacZ组(3.46±0.93)%和(5.11±1.29)%(P＜0.05).透射电镜结果显示基因转移后3、5、7 d Ad-TFPI组细胞逐渐出现体积变小、线粒体轻度肿胀、核固缩以及凋亡小体形成,而Ad-LacZ组则无明显改变.结论 TFPI基因转移能够显著诱导体外培养的大鼠VSMC发生凋亡,可能是其抑制血管成形术后再狭窄的机制之一.     

姜黄素对血管平滑肌细胞增殖及cyclinD1和p21wafl/cipl蛋白表达的影响

目的 观察姜黄素(curcumin)抑制大鼠血管平滑肌细胞(VSMC)增殖和诱导细胞周期停滞的作用,以及对细胞周期蛋白cyclinDl,p21wafl/cipl表达的影响.方法 采用组织贴块法体外培养大鼠VSMC,MTT法测定姜黄素对VSMC增殖的抑制作用,流式细胞仪分析细胞周期分布,Western印迹法检测cyclinDl,p21wafl/cipl蛋白的变化.结果 MTT示不同浓度姜黄素(7.5～120 μmol/L)在24～72 h范围内,浓度和时间依赖性抑制VSMC增殖;30 μmol/L以上浓度姜黄素显著抑制增殖的VSMC细胞周期进程,使S及G2/M期减少(P<0.05),G0/G1期增加(P<0.05);30 μmol/L的姜黄素可抑制cyclinDl表达,促进p21wafl/cipl蛋白表达.结论 姜黄素具有明确的抑制VSMC增殖和细胞周期停滞的作用,其与cyclinDl,p21wafl/cipl蛋白变化有关.     

氧化型胆固醇对血管平滑肌细胞的损伤作用

目的　以胆固醇为对照 ,观察 3 β 5α 6β 三羟胆固烷 (cholestane 3 β,5α,6β triol)、2 5 羟胆固醇 ( 2 5 hydroxycholesterol)、7 酮胆固醇 ( 7 ketocholesterol)及环氧胆固醇 (cholesterol 5α,6α epoxide)四种氧化型胆固醇对大鼠主动脉平滑肌细胞的损伤作用。方法　取 6～ 10代细胞 ,测定细胞存活率、细胞培养液乳酸脱氢酶活力 ,用电子自旋共振自旋标记检测膜脂流动性和膜蛋白构象。结果　氧化型胆固醇呈时间和剂量依赖性降低细胞存活率、增加培养液乳酸脱氢酶活力 ,以 3 β 5α 6β 三羟胆固烷损伤最重。氧化型胆固醇还使膜脂流动性降低、膜蛋白构象改变及运动减慢。胆固醇除改变膜脂流动性外 ,在相同剂量及相同作用时间的情况下 ,对细胞无损伤作用。结论　氧化型胆固醇对血管平滑肌细胞有损伤作用 ,其中以 3 β 5α 6β 三羟胆固烷损伤最重 ,胆固醇对细胞没有损伤作用。氧化型胆固醇的细胞损伤与膜物理性质改变有关。     

Arginine vasopressin-induced hypertrophy of cultured rat aortic smooth muscle cells

Recently we reported that the contractile agonist angiotensin II induces hypertrophy, not hyperplasia, in cultured rat aortic smooth muscle cells (Geisterfer AAT, Peach MJ, Owens GK: Angiotensin II induces hypertrophy, not hyperplasia, of cultured rat aortic smooth muscle cells. Circ Res 1988;62:749-756). We have further explored the hypothesis that contractile agonists are important regulators of smooth muscle cell growth by examining the effects of another contractile agonist, arginine vasopressin, on growth of cultured rat aortic smooth muscle cells. Autoradiographic analysis as well as cell number determinations showed that arginine vasopressin (1 microM) did not stimulate proliferation in cells made quiescent in a defined serum-free media nor did it augment proliferation in 0.4% fetal bovine serum. However, flow cytometric analysis of cellular protein content demonstrated that arginine vasopressin (1 microM) did induce cellular hypertrophy in quiescent cultures after 4 days of treatment, increasing smooth muscle cell protein content by 35% as compared with vehicle-treated controls. The increase in protein content showed a concentration dependence. Cellular hypertrophy was accompanied by an increase in [35S]methionine incorporation, which was elevated 45% by 24 hours. Both the increase in [35S]methionine incorporation and the increase in protein content could be prevented by the specific arginine vasopressin receptor antagonist. [1-beta-mercapto-beta,beta-cyclopentamethylene propionic acid), 2-(O-methyl)tyrosine] arginine vasopressin. An increase in [35S]methionine incorporation was observed between 12 and 24 hours after treatment of quiescent smooth muscle cells for only 5 minutes with arginine vasopressin (1 microM). Arginine vasopressin-induced increases in [35S]methionine incorporation was increased within 6 hours after treatment. These studies show that arginine vasopressin, like angiotensin II, induces hypertrophy but not hyperplasia of cultured rat aortic smooth muscle cells.     

近距离小剂量放疗对血管平滑肌细胞纤黏连蛋白及弹性蛋白基因表达的影响

目的 :探讨近距离小剂量放疗对血管平滑肌细胞 (VSMC)纤维黏连蛋白 (FN)和弹性蛋白基因表达的影响及其机制。方法 :以 7、14、2 8Gy60 Co射线辐射培养的大鼠主动脉VSMC弹性蛋白及FNmRNA表达的影响 ,无辐射为对照组。结果 :7Gy放疗组对VSMC弹性蛋白及FNmRNA表达与对照组比较差异无统计学意义 ,而 14、2 8Gy放疗组FNmRNA分别为0 .72± 0 .12和 0 .4 9± 0 .0 9,与对照组 (0 .95± 0 .0 7)比较差异有统计学意义 (P <0 .0 5 )。 14和 2 8Gy辐射后细胞弹性蛋白mRNA水平分别为1.93± 0 .2 5及 2 .16± 0 .2 2 ,与对照组 (1.0 7± 0 .11)比较差异有统计学意义 (P <0 .0 5 )。结论 :14、2 8Gy60 Co射线辐射可以抑制FNmRNA及加强弹性蛋白mRNA的表达。