MHV-3诱导的暴发性肝炎小鼠肝脏表达IL-9免疫细胞的变化

目的研究MHV-3病毒感染所致的暴发性肝炎小鼠肝脏T淋巴细胞亚群胞内细胞因子IL-9表达的变化,以探讨IL-9在该疾病模型中的作用。方法利用MHV-3病毒诱导Balb/cJ小鼠暴发性肝炎模型,采用流式细胞术检测肝脏分泌IL-9的淋巴细胞亚群比例的变化。结果随着MHV-3感染时间的延长,肝脏分泌IL-9的CD4＋T细胞比例由感染前的1.87±1.36%于48小时升高到4.77±0.42%,差异显著（P〈0.05）;而分泌IL-9的CD4-CD8（-DN）T细胞比例则于感染后72小时达峰值7.83±3.30%,显著高于感染前（3.57±1.82,P〈0.05）和24小时时（3.60±0.85,P〈0.05）。结论随着感染时间延长,肝脏分泌IL-9的CD4＋T和CD4-CD8（-DN）T淋巴细胞显著升高,说明IL-9可能参与了MHV-3诱导的暴发性肝炎小鼠免疫诱导的肝脏损伤发病过程。     

肝脏自然杀伤细胞在小鼠急性肝衰竭中的作用

目的 探讨肝脏自然杀伤(NK)细胞在3型鼠肝炎病毒(MHV-3)诱导的小鼠急性肝衰竭中的作用.方法 取6～8周龄雌性Balb/cJ小鼠,腹腔注射100 pfu MHV-3,采用流式细胞术检测感染MHV-3 0、24、48、70 h后的Balb/cJ小鼠肝脏、脾脏、外周血和骨髓中NK细胞的百分率及肝脏NK细胞表面活化分子CD69表达的百分率.细胞内细胞因子染色法检测肝脏NK细胞分泌干扰素γ的水平.非放射性细胞毒试验检测肝脏NK细胞的杀伤活性. 结果Balb/cJ小鼠感染MHV-3后,肝脏NK细胞的比例显著升高,在感染48 h后达到峰值(43.9%±2.3%),约为感染前的4倍,随后仍维持在较高水平至小鼠死亡;外周血NK细胞比例同样明显升高,在感染48 h后达到峰值(18.0%±5.4%),但随后显著同落,至70 h仅为1.3%±0.6%,脾脏和骨髓NK细胞比例均先明显减少后又有所上升.肝脏NK细胞在MHV-3感染48 h后其表面活化分子CD69表达明显上调,杀伤活性显著增强,同时分泌干扰素Y的水平也显著增加. 结论 Balb/cJ小鼠感染MHV-3后,来自骨髓和脾脏的NK细胞在肝脏迅速大量募集和活化,且杀伤活性显著增强,分泌干扰素Y水平也显著增加,表明肝脏NK细胞在MHV-3导致的急性肝衰竭中可能发挥着关键作用.     

IL-22和SOCS3在3型鼠肝炎病毒诱导的小鼠慢性病毒性肝炎发病中的作用探讨

探讨鼠3型肝炎病毒（MHV-3）诱导的慢性病毒性肝炎C3H/Hej小鼠肝组织白细胞介素-22（IL-22）和细胞因子信号抑制因子3（SOCS3）mRNA水平的变化。方法给C3H/Hej小鼠腹腔注射MHV-3（100 pfu）,诱导慢性病毒性肝炎模型,采用实时荧光定量PCR 法检测MHV-3感染后0、5、10、15和20 d时小鼠肝组织IL-22和SOCS3 mRNA水平的变化。结果模型鼠肝组织IL-22和SOC3 mRNA水平在0 d时分别为（0.26±0.15）%和（6.35±2.21）%,在感染后10、15和20 d后IL-22水平分别为（6.28±2.79）%、（2.50±1.24）%和（2.73±0.85）%,SOC3水平分别为（16.92±4.39）%、（14.06±4.09）%和（13.36±1.89）%,均较0 d时显著增高（P〈0.05）,且在第10 d达到最高峰。结论 IL-22和SOCS3可能参与了MHV-3诱导的小鼠慢性病毒性肝炎的发生发展过程。     

MHV-3诱导暴发性肝炎小鼠肝组织KCNJ15的表达变化

目的研究病毒感染所致的急性肝衰竭模型中离子通道基因KCNJ15表达水平,探讨该疾病模型中KCNJ15的变化及其与疾病进程的关系。方法利用MHV-3病毒诱导的Balb/cJ小鼠暴发型肝炎模型,采用定量PCR和免疫组化技术分别从基因及蛋白水平检测肝脏KCNJ15表达水平,并应用流式细胞术检测肝脏淋巴细胞亚群KCNJ15表达。结果随着MHV-3感染时间的延长,肝组织中KCNJ15表达水平逐渐增高,以感染后72小时最为显著。在肝脏CD4+T细胞,KCNJ15蛋白表达水平于48小时显著升高,达到25.17±7.68%,与0h(3.92±1.33%)相比差异具有统计学意义(P<0.001),随后于72小时回落;肝脏表达KCNJ15的CD8+T细胞比例变化与CD4+T细胞趋势一致,于48h达到37.08±8.73%,与0h(6.98±3.48%)相比有显著差异(P<0.001);而表达KCNJ15的肝脏NK细胞比例则从7.72±1.34%上升到感染后24小时的峰值19.80±4.25%(P<0.001),随后回落。结论肝组织及肝脏淋巴细胞过表达KCNJ15可能参与了MHV-3诱导的暴发性肝炎小鼠免疫诱导的肝脏损伤过程。     

病毒性肝炎时肝B1-a细胞对肝脏保护作用的实验研究

目的:检测小鼠感染鼠肝炎病毒3型(MHV-3)后肝脏B-1a淋巴细胞亚群变化,探讨B-1a细胞在病毒性肝炎中的作用。方法:通过流式细胞术检测MHV-3诱导的耐受型小鼠及引起暴发性肝炎敏感小鼠肝脏中B细胞、B-1a细胞的基础水平,以及在感染后不同时间点的比例变化。磁珠分选出未感染敏感小鼠肝脏B-1a细胞并过继给敏感小鼠,观察感染MHV-3病毒72h后小鼠肝脏的病理组织学特征。结果:未感染时MHV-3耐受型小鼠肝脏中B细胞明显高于敏感型小鼠(43.6%±2.1%vs15.6%±3.3%,P<0.01),B-1a细胞在耐受型小鼠略高于敏感型小鼠(6.38%±2.13%vs5.84%±1.32%,P>0.05);感染后耐受型小鼠B-1a明显升高至(10.80%±2.82%,P<0.05),而敏感型小鼠呈现下降趋势。过继B-1a细胞的敏感小鼠肝脏坏死程度明显低于其它细胞组及PBS对照组。结论:肝脏固有B-1a细胞对MHV-3引起的病毒性肝炎具有保护性作用。     

慢性乙型肝炎病毒感染者外周血浆样树突状细胞Toll样受体9的表达和分泌功能

目的 探讨外周血浆样树突状细胞(pDC)Toll样受体(TLR)9的表达水平、pDC数量和分泌IFN-α能力的变化以及与慢性HBV感染状态的关系.方法 流式细胞分析技术检测69例慢性HBV感染患者(包括HBV携带者14例,慢性乙型肝炎患者30例,乙型肝炎肝硬化患者25例)和21例健康对照组外周血pDC频率和TLR9表达水平;用CpG ODN 2216刺激外周血单个核细胞(PBMC),并与PBMC共培养24 h,检测上清液中pDC产生IFN-α的能力;分析pDC数量、分泌IFN-α功能变化及其临床意义.应用SPSS 13.0进行统计学分析.结果 与健康对照组(62.6±10.7)相比,HBV携带者、慢性乙型肝炎、乙型肝炎肝硬化患者pDC表达TLR9平均荧光强度均有不同程度下降(P＜0.05).与慢性乙型肝炎患者(54.3±16.9)比较,HBV携带者及乙型肝炎肝硬化患者pDC表达TLR9平均荧光强度分别为44.5±10.3和45.9±13.8,差异有统计学意义(P＜0.05).健康对照组外周血pDC细胞频率为(0.88±0.54)%,明显高于慢性乙型肝炎患者的(0.51±0.36)%和乙型肝炎肝硬化患者的(0.5±0.3)%(P＜0.05).慢性HBV感染患者外周血pDC频率与血清ALT水平呈明显负相关(r=-0.341,P＜0.05).HBV携带者、慢性乙型肝炎患者、乙型肝炎肝硬化患者PBMC中pDC分泌IFN-α的水平分别为(291.10±198.16)、(285.34±155.56)和(206.92±148.36)pg/mL,明显低于健康者的(600.23±344.91)pg/mL(P＜0.05).结论 慢性HBV感染患者外周血pDC TLR9表达低下,外周血pDC频率和分泌IFN-α的能力明显降低,这可能是HBV持续感染的重要机制.     

CXCR3阳性自然杀伤细胞在MHV-3诱导暴发性肝炎小鼠组织分布动态变化

目的检测CXC趋化因子受体3(CXCR3)阳性自然杀伤(NK)细胞在3型鼠肝炎病毒诱导的暴发性肝炎小鼠肝脏、脾脏、骨髓及外周血中百分比的动态变化。方法腹腔注射3型鼠肝炎病毒诱导BALB/cJ小鼠暴发性肝炎,利用流式细胞术检测小鼠肝脏、骨髓、外周血及脾脏CXCR3阳性NK细胞百分比的变化。结果肝脏CX-CR3阳性NK细胞百分比在感染后12小时(20.47±1.54%)和24小时(31.53±2.53%)较感染前(14.0±0.25%)均显著升高(P均<0.05),至感染48小时下降至感染前水平;骨髓CXCR3阳性NK细胞百分比随感染时间延长而逐渐减少,由初始水平(25.53±3.50%)的高点至72小时时降至较低水平(1.2±0.17%,P<0.05);脾脏CXCR3阳性NK细胞的百分比在感染后12小时增高(13.63±3.167%),随后下降,至72小时达到较低水平(2.20±0.53%,P<0.05);外周血CXCR3阳性NK细胞的百分比在24小时增高,在72小时下降至感染前水平。结论在MHV-3感染后,CXCR3阳性NK细胞可能逐渐迁移至肝脏,从而在小鼠暴发性肝炎发生发展中发挥重要作用。     

抗肝衰复方治疗MHV-3感染肝衰竭小鼠的作用观察

目的:观察抗肝衰复方治疗Balb/cJ小鼠感染MHV-3所致肝衰竭的疗效及初步探讨其作用机制.方法:将75只Balb/cJ小鼠随机分为3组:生理盐水对照组、茵陈复方组1、茵陈复方组2(抗肝衰复方组).采用MHV-3感染Balb/cJ小鼠,建立急性肝衰竭模型.描绘各茵陈复方组的生存曲线,观察血清生化及肝脏病理组织学改变,免疫组化检测小鼠肝组织纤维介素(mfgl2)的表达状况.结果:与生理盐水对照组及茵陈复方组1比较,抗肝衰复方组的生存情况最佳,血清ALT、STB明显降低(P＜0.01或P＜0.05);肝细胞损害明显减轻(P＜0.05);与生理盐水对照组及茵陈复方组1比较,抗肝衰复方组中肝组织mfgl2表达明显减少(P＜0.01或P＜0.05).结论:抗肝衰复方可减轻MHV-3感染的Balb/cJ小鼠肝衰竭时的肝功能损伤及肝细胞mfgl2的表达水平.     

腺病毒载体在小鼠肝脏的分布及其表达规律研究

目的研究腺病毒载体介导的β-半乳糖苷酶(LacZ)报告基因在小鼠肝脏的分布及表达情况,评价腺病毒载体作为基因治疗转导系统的有效性及安全性,为进一步的目的基因导入及表达奠定基础。方法将Balb/cJ小鼠随机分为正常组及暴发性肝炎组,给小鼠经尾静脉注射2×108PFU腺病毒,收集24h、48h、72h、96h、120h和第7天小鼠血清,检测谷丙转氨酶和总胆红素,同时取肝脏、肺脏、心脏、肾脏标本进行X-gal染色,以观察腺病毒载体在各脏器的表达情况。取MHV-3诱导的暴发性肝炎组小鼠24h、48h、72h、96h肝脏,检测腺病毒载体在肝脏的表达情况。结果腺病毒载体主要在小鼠肝脏表达,并于72小时表达最高,在正常小鼠及暴发性肝炎小鼠肝脏中表达效率分别约55.7%和25.7%,之后逐渐消减;正常组小鼠注射腺病毒载体后,肝功能无明显变化。结论腺病毒载体介导的报告基因可在肝脏高效表达且未见明显的肝损害,可作为基因治疗中安全有效的基因传递系统用于治疗肝脏疾病。     

KCTD9在暴发性肝炎小鼠中的作用机制初探

目的 初步探讨KCTD9在暴发性肝炎模型小鼠中的作用机制.方法 78只BALB/cJ小鼠(其中雄性6只)随机分为暴发性肝炎对照组和暴发性肝炎模型组,每组39只(每组雄性3只);75只C3H/HeJ雌性小鼠分为慢性肝炎对照组(36只)和慢性肝炎模型组(39只).模型组每只小鼠腹腔注射MHV-3(100 PFU).暴发性肝炎对照组和模型组48 h试验点以1只雄性小鼠供取睾丸,2只雌性小鼠供取肝脾等组织标本和分离肝细胞,10只雌性小鼠为1个单位取肝组织供分离肝脾淋巴细胞;慢性肝炎对照组和模型组48 h时以1只小鼠供取肝脾组织,1只小鼠供分离肝细胞,10只为1个单位供分离肝脾淋巴细胞,重复3次,剩下3只小鼠在建模15d时处死,仅供取肝脾组织.磁珠分选肝脾单个核细胞,采用免疫组织化学、实时定量PCR技术检测KCTD9在暴发性肝炎、慢性肝炎模型动物中的表达差异,各组间比较用t检验或方差分析.结果 与对照组比较,KCTD9 mRNA在暴发性肝炎模型组小鼠肝CD8+T细胞、CD4+T细胞、自然杀伤细胞(NK)细胞中分别上调8.8倍、59.4倍、577.1倍,t值分别为-5.393、-3.706和-4.714,P值均＜0.05,差异有统计学意义;在脾CD4+T细胞、CD8+T细胞中,KCTD9 mRNA表达水平分别下调了43％和69％,t值分别为2.906、10.98,P值均＜ 0.05,差异有统计学意义.与对照组比较,在慢性肝炎模型组小鼠肝NK细胞和CD4+T细胞中KCTD9 mRNA分别下调71％、51％,t值分别为3.827、5.746,P值均＜0.05,差异有统计学意义.KCTD9蛋白在暴发性肝炎模型组小鼠肝细胞中呈弱阳性表达,坏死灶周围及组织中炎症浸润细胞中呈强阳性表达;脾中阳性细胞仍散在分布,与对照组比较,脾白髓中细胞数量减少达71％.结论 KCTD9在MHV-3诱导的暴发性肝炎模型小鼠肝脏高表达,可能参与疾病发生和发展过程.     

外周血髓源性抑制细胞在HBV相关慢加急性肝衰竭患者中表达的研究

目的：探讨外周血髓源性抑制细胞（myeloid-derived suppressor cells , MDSCs）在HBV相关慢加急性肝衰竭（HBV-related acute-on-chronic liver failure, HBV-ACLF）患者疾病进程中的临床意义。方法入组45例HBV-ACLF患者、34例慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B, CHB）患者和25例健康对照者（healthy controls, HC）,采用流式细胞仪检测外周血MDSCs频率。对HBV-ACLF患者进行为期3周的随访,根据临床疗效分为好转组和无效组,动态观察2组患者外周血MDSCs的频率变化。结果 HBV-ACLF组外周血MDSCs频率（1.53%±1.15%）高于CHB组（0.92%±0.46%）和HC组（0.91%±0.47%）（P均〈0.01）。 HBV-ACLF组外周血MDSCs频率分别与TBIL、CRE、国际标准化比值（international normalized ratio, INR）、终末期肝病模型（model for end-stage liver disease, MELD）分值和MELD-Na分值呈正相关（r=0.434,P=0.003;r=0.343,P=0.021;r=0.505, P=0.000;r=0.528,P=0.000;r=0.451,P=0.002）,其中与INR和TBIL成多元线性关系,回归模型为y=-0.781＋0.623×INR＋0.003× TBIL。3周内死亡的HBV-ACLF组患者基线外周血MDSCs频率（2.09%±1.51%）高于好转组（1.15%±0.56%）和无效组（1.17%±0.70%）（P〈0.05）。外周血MDSCs频率与患者整体预后存在较弱的等级相关（r=0.309,P=0.039）。随访显示好转组和无效组患者外周血MDSCs频率均无明显变化。结论 HBV-ACLF患者外周血MDSCs频率显著升高;其与预后存在相关性,外周血MDSCs频率过高的患者预后差。     

外周血DNT细胞和T细胞亚群检测在乙型肝炎病毒感染者诊断中的意义

目的：探讨乙型肝炎病毒感染者外周血CD3＋CD4-CD8-T细胞（DNT）和T细胞亚群的变化及意义。方法使用流式细胞仪检测136例乙型肝炎病毒感染者,包括33例无症状携带者、28例急性乙型肝炎患者、28例轻度慢性乙型肝炎患者、25例中度慢性乙型肝炎患者、22例重度慢性乙型肝炎患者和39例健康人外周血DNT细胞及T细胞亚群。结果健康人群和急性乙型肝炎患者外周血DNT细胞比例分别为（4.82±3.43）%和（4.75±2.71）%,显著低于无症状携带者[（5.43±3.31）%,P〈0.05]和慢性乙型肝炎患者（P〈0.05）;轻度慢性乙型肝炎患者DNT细胞比例为（7.97±4.12）%,显著低于重度慢性乙型肝炎患者[（11.36±5.01）%,P〈0.05];中度慢性乙型肝炎患者DNT细胞比例为（8.41±4.93）%,也显著低于重度慢性乙型肝炎患者（P〈0.05）;健康人、急性乙型肝炎患者和无症状携带者之间 T 淋巴细胞亚群分布无明显差异,但随着慢性乙型肝炎患者病情加重,外周血 CD3＋、CD3＋CD4＋CD8-细胞比例降低（P〈0.05）,CD3＋CD4-CD8＋细胞比例升高（P〈0.05）。结论外周血DNT细胞比例的升高与乙型肝炎病毒感染者慢性化及慢性乙型肝炎患者的疾病进程有关。     

复方牛胎肝提取物治疗慢性乙型肝炎疗效观察

目的：观察复方牛胎肝提取物片治疗慢性乙型肝炎患者的疗效。方法120例慢性乙型肝炎患者被随机分为治疗组64例和对照组56例。对照组给予基础治疗,治疗组加用复方牛胎肝提取物治疗3 m,观察两组治疗前后临床、肝功能和肝纤维化指标的变化。结果在3 m治疗结束时,治疗组乏力和纳差的改善率分别为92.00%和91.84%,显著高于对照组（56.41%和58.33%,P〈0.05）;治疗组ALT为（35.6±17.2）U/L、AST为（38.5±18.6） U/L、GGT为（40.6±19.7）U/L、总胆红素为（16.1±13.9）μmol/L,均较治疗前[分别为（110.8±61.4）U/L、（97.2±62.4） U/L、（106.3±60.1）U/L、（47.8±19.3）μmol/L）]显著下降（P〈0.05）;治疗组基线时III型前胶原肽为（36.7±11.3）μg/L、透明质酸为（276.4±79.5）μg/L、层粘连蛋白为（169.8±73.4）μg/L、IV型胶原为（155.8±61.5）μg/L,治疗后均显著下降[分别为（16.4±6.1）μg/L、（110.8±51.4）μg/L、（70.8±34.9）μg/L、（97.8±41.4）μg/L,P〈0.05）]。结论复方牛胎肝提取物片治疗慢性乙型肝炎患者有一定的效果。     

慢性乙型肝炎患者血清甲状腺相关物质和IL-6检测及其临床意义

目的：研究慢性乙型肝炎病毒（Hepatitis B Virus,HBV）感染者血清甲状腺激素、抗甲状腺自身抗体及白细胞介素（interleukin,IL）-6水平变化及其临床意义。方法选取健康对照者18例、慢性乙型肝炎（CHB）患者65例和乙型肝炎肝硬化患者34例,应用电化学发光法分别检测并比较血清甲状腺激素水平、促甲状腺激素（TSH）、抗甲状腺相关抗体及IL-6水平。结果 CHB患者抗甲状腺过氧化物酶抗体（TPOAb）、抗甲状腺球蛋白抗体（TGAb）、抗促甲状腺激素受体抗体（TRAb）和IL-6水平分别为（9.5±5.6） KIU/L、（42.5±218.7） KIU/L、（1.5±0.7） IU/L和（6.6±12.6） pg/mL,在肝硬化患者分别为（9.5±8.6） KIU/L、（47.6±101.5） KIU/L、（2.2±1.7） IU/L和（15.8±25.5） pg/mL,均显著高于正常组[分别为（4.4±5.6） KIU/L、（7.7±18.3） KIU/L、（0.8±0.8） IU/L和（2.8±2.0） pg/mL,P〈0.05],而CHB和肝硬化患者血FT3分别为（2.4±0.5） ng/L和（2.4±0.6） ng/L,均显著低于对照组[（2.9±0.2） ng/L,P〈0.05];肝硬化患者TRAb和IL-6水平分别为（2.2±1.7） IU/L和（15.8±25.5） pg/mL,明显高于CHB患者[（1.5±0.7） IU/L和（6.6±12.6） pg/mL,P〈0.05],而TT3和TT4水平分别为（0.8±0.3） nmol/L和（5.4±1.9）nmol/L,显著低于CHB患者[（1.3±0.3） nmol/L和（8.0±2.2） nmol/L,P〈0.05]。结论联合检测慢性HBV感染者血清甲状腺激素、抗甲状腺自身抗体及IL-6水平对病情评价和预后判断有一定的临床价值。