富含半胱氨酸蛋白61RNA干扰质粒抑制血管平滑肌细胞的增殖

目的 观察富含半胱氨酸蛋白61(Cyr61)RNA干扰质粒(pCyr61-shRNA)对大鼠血管平滑肌细胞增殖的影响.方法 构建Cyr61 RNA干扰质粒转染大鼠血管平滑肌细胞,采用半定量逆转录聚合酶链反应及Western blot检测Cyr61 RNA和蛋白表达;采用MTT法检测细胞增殖;3H-标记胸腺嘧啶掺入法检测细胞DNA含量.结果 测序证实成功构建Cyr61 RNA干扰质粒;转染pCyr61-shRNA组mRNA及蛋白表达均明显降低(P<0 01);pCyr61-shRNA组细胞数、吸光度值和DNA含量均明显降低(P<0 01).结论 Cyr61 RNA干扰质粒抑制大鼠血管平滑肌细胞的增殖.     

富含半胱氨酸蛋白61 RNA干扰质粒抑制血管平滑肌细胞的增殖

目的观察富含半胱氨酸蛋白61(Cyr61)RNA 干扰质粒(pCyr61-shRNA)对大鼠血管平滑肌细胞增殖的影响。方法构建 Cyr61 RNA 干扰质粒转染大鼠血管平滑肌细胞,采用半定量逆转录聚合酶链反应及 West-ern blot 检测 Cyr61 RNA 和蛋白表达;采用 MTT 法检测细胞增殖;~3H-标记胸腺嘧啶掺入法检测细胞 DNA 含量。结果测序证实成功构建 Cyr61 RNA 干扰质粒;转染 pCyr61-shRNA 组 mRNA 及蛋白表达均明显降低(P<0.01);pCyr61-shRNA 组细胞数、吸光度值和 DNA 含量均明显降低(P<0.01)。结论 Cyr61 RNA 干扰质粒抑制大鼠血管平滑肌细胞的增殖。     

RNA干扰Akt对食管癌细胞株Eca109生物学特性的影响

目的:探讨RNA干扰沉默Akt对人食管鳞癌细胞体外增殖、迁移及血管生成拟态(VM)形成的影响.方法:应用倒置荧光显微镜观察Akt的干扰质粒转染食管癌细胞Eca109后绿色荧光蛋白的表达;采用Western blot方法检测Akt蛋白的表达;四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测转染前后细胞增殖能力的变化;Transwell方法...     

Tumstatin-EGFP真核表达载体构建及稳定转染CHO细胞系的建立

目的 构建重组tumstatin-增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的分泌型真核表达载体质粒,建立稳定转染的中国仓鼠卵巢细胞系(CHO-K1).方法 利用重叠多聚酶链反应(PCR)技术从pGEM-T/STL质粒和pEGFP-C2质粒中扩增出STL-EGFP,用DNA重组技术将片段定向插入pIRESneo3质粒中,经酶切和序列验证正确后,用lipofectamine 2000转染CHO-K1细胞,通过G418筛选建立稳定转染的CHO细胞系,用逆转录-PCR、Western blot检测tumstatin-EGFP的表达,用倒置荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达.结果 重组真核表达载体正确构建并在CHO细胞获得稳定表达,tumstatin-EGFP基因整合入细胞基因组DNA,培养液上清有融合蛋白tumstatin-EGFP的分泌,绿色荧光蛋白的表达高达95%以上.结论 成功构建了质粒PIRESneo3-STL-EGFP,获得稳定表达tumstatin-EGFP的细胞系.     

APP基因真核表达载体的构建及其在SH-SY5Y细胞中的稳定表达

目的 构建淀粉样前体蛋白(APP)基因真核表达载体,转染SH-SY5Y细胞,建立稳定转染细胞系.方法 从质粒pcDNAs-APP中经PCR扩增出APP基因,利用DNA重组技术将其插入到真核表达载体pcDNA3.1(+)中,经酶切和测序鉴定后,脂质体转染法转染SH-SY5Y细胞,通过G418选择培养,建立稳定转染细胞系,通过印迹法(Western blot)检测APP的表达. 结果 pcDNA3.1(+)-APP重组体经PCR扩增后片段大小约为2 300 bp,与预期相同.测序结果与目的序列相同,重组体载体构建成功.Western印迹检测到SH-SY5Y细胞中APP的表达. 结论 成功构建pcDNA3.1(+)-APP真核表达载体并稳定转染SH-SY5Y细胞,成功表达了目的基因,为进一步研究阿尔茨海默病分子学机制奠定了基础.     

FAK基因靶向miRNA表达质粒的构建及鉴定

目的构建靶向黏着酶（FAK）基因的miRNA真核表达质粒,为其在胃癌相关研究中的应用奠定基础。方法设计合成两条针对FAK基因的特异性miRNA干扰序列,定向克隆到pcDNATM6．2-GW／EmGFP—miR真核表达载体上,经鉴定后转染胃癌BGC-823细胞,实时定量PCR及Western—blot技术鉴定重组体对细胞FAK基因表达的干扰效果。结果针对FAK基因的两组miRNA干扰质粒构建成功,转染BGC-823细胞后,细胞FAKmRNA及FAK蛋白表达均明显降低。结论针对FAK基因的miRNA真核表达质粒成功构建,该质粒可用于miRNA进行靶向FAK的相关研究。     

辣椒素对高盐致大鼠血管平滑肌细胞增殖的抑制作用

目的研究辣椒素对高盐诱导的大鼠血管平滑肌细胞(VSMC)增殖的抑制作用。方法组织贴壁法培养原代大鼠血管平滑肌细胞,根据MTT结果绘制大鼠血管平滑肌细胞的生长曲线,大鼠血管平滑肌细胞传至第4代去血清同步化24 h,不同浓度辣椒素(0.01μmol/L、0.1μmol/L、1μmol/L、10μmol/L、100μmol/L)进行高盐培养72 h,MTT比色法检测大鼠血管平滑肌细胞增殖情况,选取抑制血管平滑肌细胞增殖的辣椒素浓度进行后续实验。CCK-8检测渗透压对大鼠血管平滑肌细胞增殖的影响,流式细胞仪分析细胞增殖周期,免疫荧光染色法和Western blot检测增殖细胞核抗原(PCNA)的表达,实时荧光定量PCR检测瞬时受体电位家族香草醛1型受体(TRPV1)mRNA的表达,Western blot检测瞬时受体电位家族香草醛1型受体的蛋白表达。结果 MTT结果显示,辣椒素浓度为10μmol/L时大鼠血管平滑肌细胞增殖开始受抑制,100μmol/L时抑制作用增强(P0.05),选取10μmol/L辣椒素进行后续实验。CCK-8结果显示,高盐组细胞明显增殖,而甘露醇组、正常组和高盐+辣椒素组无差异。流式细胞仪测得高盐组G0/G1、G2/M期细胞比例减少(P0.05),S期细胞比例增多(P0.05);与高盐组比较,高盐+辣椒素组G0/G1、G2/M期细胞比例增加(P0.05),S期细胞比例下降(P0.05)。免疫荧光及Western blot结果显示,高盐组增殖细胞核抗原阳性细胞核增多,蛋白表达增加(P0.05),而高盐+辣椒素组增殖细胞核抗原阳性细胞核减少,蛋白表达减少(P0.05)。实时荧光定量PCR和Western blot结果显示高盐组瞬时受体电位家族香草醛1型受体mRNA及蛋白表达减少(P0.05),辣椒素组则增加(P0.05)。结论辣椒素可抑制高盐所致的大鼠血管平滑肌细胞增殖,其作用机制可能与激活瞬时受体电位家族香草醛1型受体表达有关。     

ERK1/2 siRNA干扰质粒对IGF-1诱导结肠平滑肌细胞产生干细胞因子的影响

目的:探讨IGF-1诱导的大鼠结肠平滑肌细胞(SMC)产生干细胞因子(SCF)的信号途径.方法:以不同时间(0,5,15,30,45,60 min)、不同浓度(0,50,100,150 μg/L)的IGF-1诱导结肠SMC;以ERK1/2 siRNA干扰质粒转染大鼠结肠SMC.RT-PCR及Western blot检测...     

VEGF-C基因靶向RNA干扰重组表达载体的构建和表达

目的:利用质粒pSilencer3.1-H_1构建针对人血管内皮生长因子-C(VEGF-c)基因的表达载体,测序鉴定并观察在胃癌细胞中的表达.方法:根据质粒pSilencer3.1-H_1要求设计两对小干扰RNA靶序列,退火形成互补的双链,通过与线性化的pSilencer3.0-H_1相应位点连接、转化大肠杆菌,扩增、纯化得到所需质粒,酶切电泳及测序鉴定后转染胃癌细胞株SGC-7901,Western blot检测转染前后VEGF-C基因的蛋白表达.结果:经酶切和测序鉴定,针对VEGF-C基因的siRNA表达载体构建成功.转染胃癌细胞株SGC-7901后,Western blot检测显示VEGF-C基因蛋白表达明显降低,pSilencer3.1-VEGF-C1组抑制效果明显,其抑制率为81.2%,与阴性对照组相比差异具有显著性(P<0.05).结论:成功构建了针对人VEGF-C基因的siRNA表达载体和稳定转染的胃癌细胞株SGC-7901.     

携带Pyk2基因的shRNA质粒构建及其在Lovo结肠癌细胞系中的表达

目的:构建重组质粒PGCsi-Pyk2 shRNA,并检测所引起的Pyk2 mRNA和蛋白在Lovo结肠癌细胞系中的表达.方法:设计合成3对pkv2基因shRNA序列,形成双链后将其依次连入带有U6启动子并含有潮霉素B的pGcsi空载体,构建成能产生Pyk2短发卡RNA的质粒:采用双酶切和测序分析鉴定插入基因的序列:脂质体介导重组质粒pGCsi-Pyk2 shRNA稳定转染Lovo细胞系并通过潮霉素B筛选,获得比较单一的转染细胞;分别采用RT-PCR、Western blot等检测转染前后Pyk2的水平表达.结果:酶切鉴定和测序分析表明重组表达质pGCsi-Pyk2 shRNA构建无误:绿色荧光照相及PCR表明质粒转染成功:RT-PCR和Western blot均表明,与转染空质粒PGCsi组和转染仅含免疫荧光基因组细胞相比,转染重组表达质pGCsi-Pyk2 shRNA细胞t'Pyk2mRNA及蛋白表达水平均明显降低.结论:成功构建重组质pGCsi-Pyk2 shRNA.并证明他能降4Pyk2在Lovo胞株系中的表达,为进一步研究Pyk2何调控Hic-5/ARA55,Paxillion等下游靶基因的表达和参与结肠癌表观遗传学发生机制奠定了基础.     

转化生长因子β1及基质金属蛋白酶抑制剂1、2siRNA真核表达载体的构建与鉴定

目的 用RNA干扰技术,分别以转化生长因子(TGF)β 1、基质金属蛋白酶抑制剂(TIMP)-1和TIMP-2为靶基因,设计并构建针对TGF β 1、TIMP-1和TIMP-2基因的小干扰RNA(siRNA)真核表达载体,并在体外检测其对大鼠肝星状细胞株(HSC-T6)的TGF β 1、TIMP-1和TIMP-2基因表达的抑制情况.方法 设计合成TGF β 1、TIMP-1和TIMP-2的siRNA并与含绿色荧光蛋白的pGenesil-1载体连接,构建siRNA真核表达载体,并测序鉴定.体外转染HSC-T6细胞,观察转染效率,并用荧光定量PCR以及Western blot分析对目的 基因的抑制效率.组间比较用方差分析,两两比较用q检验.结果 成功构建了针对TGF β 1、TIMP-1和TIMP-2基因的siRNA真核表达载体.体外成功转染HSC-T6细胞,转染后的细胞TGF β 1、TIMP-1及TIMP-2 mRNA表达分别下调63.4%±8.0%,64.5%±9.0%,55.0%±17.0%(F值分别为17.55、128.42、210.36,P值均＜0.01),TGF β 1、TIMP-1及TIMP-2蛋白表达分别下降57.8%±3.0%,55.1%±5.0%,49.3%±1.0%(F值分别为130.75、159.09、35.72,P值均＜0.01).结论 成功构建了针对TGF β 1、TIMP-1和TIMP-2基因的siRNA真核表达载体;将重组载体成功转染入体外培养的HSC-T6细胞,并显著抑制了目的 基因的表达;为进一步研究其在体抑制表达提供了实验工具.

Abstract：

Objective To construct the siRNA eukaryotic expression vectors targeting on TGF β1,TIMP-1 and TIMP-2 and to investigate the inhibitory efficiency of target genes expression on rat hepatic stellate cell in vitro. Methods The siRNA cDNA sequences ofTGF β 1, TIMP-1 and TIMP-2 were designed,synthesized and inserted into plasmid pGenesil-1 respectively to generate eukaryotic expression plasmids.The plasmids were transfected into HSC T6 cells in vitro and the inhibitory efficiency of target genes expression was observed with real-time PCR and Western blot. Results The eukaryotic expression vectors were constructed successfully. The expressions of TGF β1 mRNA, TIMP-1 mRNA and TIMP-2mRNA in siRNAtransfected groups were decreased by 63.4% ± 8.0%, 64.5% ± 9.0% and 55.0% ± 17.0% respectively and the expressions of TGF β1 protein, TIMP-1 protein and TIMP-2 protein were decreased by 57.8% ± 3.0%,55.1% ± 5.0%, 49.3% ± 1.0% respectively as compared to the control groups. Conclusions The siRNA eukaryotic expression vectors constructed targeting on TGF β1, TIMP-1 and TIMP-2 could reduce the expressions of target genes and they might be able to used for the exploration of new anti-fibrosis drugs genetically.     

肝细胞中HBV X基因的表达及其共培养的肝星状细胞的增殖和迁移

目的:研究乙型肝炎病毒X(hepatitis B virus X,HBV X)基因在乙型肝炎病毒致肝纤维化中的作用.方法:构建HBV X基因真核表达载体pHBV-X-IRES2-EGFP,将其转染人肝细胞HL-7702后分成2组,一组经G418筛选出稳定表达HBVX基因的肝细胞株(L02/x),另一组予瞬时转染48 h(L02/48x).Real-time PCR、Western blot鉴定2组细胞HBV X基因的表达.与转染空质粒和未转染的肝细胞组对照,将L02/x和L02/48x细胞分别与肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSCs)共培养36 h,并检测各组HSCs增殖和迁移情况.结果:Real-time PCR和Western blot实验显示,转染pHBV-X-IRES2-EGFP载体的L02/x和L02/48x细胞均有HBV X基因的表达.与转染空质粒和未转染的肝细胞组对照,与L02/x和L02/48x细胞共培养的HSCs的增殖和迁移均显著增多.结论:HBV X基因在肝细胞中的表达可以促进HSCs发生增殖和迁移,从而在乙型肝炎病毒致肝纤维化过程中起重要作用.     

人ACE2基因真核表达载体的构建及其转染人内皮细胞的研究

目的:克隆人血管紧张素转换酶2(ACE2)基因,构建其真核表达载体并将之转染入体外培养的人血管内皮细胞中。方法:采用PCR方法从人胎儿心脏cDNA文库扩增出人ACE2cDNA全长基因,克隆到pcDNA3.1-D/V5-His表达载体上,构建重组真核表达质粒phACE2,经酶切和测序鉴定。采用脂质体法将phACE2转染至人血管内皮细胞中,分别利用实时定量PCR和Western印迹检测重组ACE2的mRNA和蛋白的表达情况。结果:经PCR、酶切和基因序列测定证实重组入载体的片段(2419bp)为目的基因序列,在转染的内皮细胞中发现ACE2的mRNA和蛋白的表达明显增加(P<0.01)。结论:本研究成功构建并表达了pcDNA3.1-hACE2重组真核表达载体,为该基因在高血压病防治中的功效研究奠定了基础。     

人NPTX2真核表达载体的构建及稳定转染细胞系的建立

目的 构建入神经元正五聚蛋白2(NPTX2)真核表达载体.转染人胰腺癌细胞PANC1,建立稳定转染的细胞系.方法 通过双酶切的方法获得人NPTX2全长cDNA,利用Not I和EcoR I酶切位点将其插入到真核表达载体pcDNA3.1(+),经酶切和测序验证盾,用脂质体转染法转染PANC1细胞,通过G418筛选,建立稳定转染的PANC1细胞,用实时定量PCR方法筛选NPTX2 mRNA高表达克隆.结果 成功构建了pcDNA3.1(+)-NPTX2真核表达载体.并建立了稳定转染的PANC1细胞,成功表达了目的 基因.结论 真核表达载体的构建和稳定转染PANC1细胞系的建立为进一步研究NPTX2基因在胰腺癌细胞的作用奠定了良好的基础.     

应用表达载体介导siRNA抑制胰腺癌STAT3基因表达的研究

目的探讨表达载体介导小干扰RNA（siRNA）对人胰腺癌细胞系SW1990转录激活因子-3（STAT3）表达的抑制作用。方法设计合成3种可编码后形成小发夹结构针对STAT3基因的siRNA的DNA序列，将其连入pRNAT—U6．1／Neo质粒中，构建STAT3siRNA表达载体。表达载体进行PCR及测序鉴定，并分别转染SW1990细胞，实时定量PCR和Western blot观察SW1990细胞转染后STAT3 mRNA和蛋白表达的改变。结果PCR和DNA测序证实携带3种STAT3 siRNA表达载体构建成功，分别转染SW1990细胞后，STAT3基因的mRNA和蛋白表达量与空质粒转染相比均明显下降（P〈0．05），其中，第二种STAT3 siRNA作用明显，可使mRNA和蛋白表达水平分别下降63％和60％。结论本研究构建的STAT3．siRNA表达载体可有效抑制SW1990细胞STAT3的mRNA和蛋白表达，为下一步以STAT3为靶点的胰腺癌基因治疗实验研究奠定了基础．     

整合素β1基因沉默对胰腺癌细胞PANC1体外侵袭能力的影响及机制研究

目的 应用短发夹RNA(shRNA)沉默人胰腺癌细胞株PANC1的整合素α1(integrinβ1)基因表达,观察其对PNAC1细胞体外侵袭能力的影响,探讨其机制.方法 构建靶向integrinβ1基因的shRNA真核表达质粒integrinβ1-shRNA及对照真核表达质粒c-shRNA,转染人胰腺癌PANC1细胞,以未转染质粒的细胞作为对照组.应用实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法检测integrinβ1、MMP-2、MMP-9 mRNA和蛋白的表达水平,应用Transwell侵袭小室检测细胞体外侵袭能力.结果 integrinβ1-shRNA 组、c-shRNA组和对照组细胞integrinβ1 mRNA表达量分别为0.0029±0.0004、0.0131±0.0009、0.0138±0.0005;integrinβ1蛋白表达量为0.0159±0.0062、0.3215 ±0.0126、0.3107±0.0094.integrinβ1-shRNA 组integrinβ1 mRNA和蛋白表达抑制率分别为(78.6±7.2)％和(92.9±3.2)％(P＜0.01).而c-shRNA 组与对照组差异无统计学意义(P =0.2999).integrinβ1-shRNA组穿膜细胞数由(52±5)个降低至(21 ±4)个(P＜0.01);MMP-2和MMP-9mRNA表达分别从0.592±0.073和0.847±0.069降低到0.102±0.034和0.273±0.071;MMP-2和MMP-9蛋白表达分别从0.225±0.046和0.416±0.081降低到0.059±0.013和0.106±0.022(P值均＜0.05).结论 重组质粒integrinβ1-shRNA能有效地抑制PANC1细胞integrinβ1基因的表达,并可能通过下调MMP-2和MMP-9基因表达而抑制其体外侵袭能力.     

Survivin靶向RNA干扰对人结肠癌HCT116细胞生长影响的研究

目的设计和构建survivin特异性的siRNA真核表达载体,观察survivin siRNA重组体对人大肠癌HCT116细胞株生长的影响,为大肠癌的基因治疗提供理论依据。方法针对survivin mRNA序列设计合成编码siRNA的DNA模板,构建2个survivin RNAi真核表达载体;实验分为survivin siRNA重组质粒转染组、空载体组和HCT116组,转染大肠癌细胞HCT116细胞,采用RT-PCR法检测survivin mRNA的表达,观察重组质粒对转染的HCT116细胞survivin基因表达的影响;用四甲基偶氮唑盐（MTT）法测量细胞生长情况;用流式细胞术检测细胞凋亡情况。结果测序表明survivin干扰序列完全正确,RT-PCR结果显示2条survivin siRNA真核表达质粒均能有效抑制survivin mRNA的转录表达。MTT比色法检测显示,与阴性对照组及未转染组细胞比较,干扰组细胞增殖率明显下降（P〈0．05）。流式细胞术检测的转染重组质粒组细胞凋亡率高于脂质体对照组和空质粒对照组（P〈0．05）。结论成功构建了survivin干扰真核表达载体,siRNA重组体能有效抑制人大肠癌细胞survivin mRNA表达,并抑制结肠癌细胞生长,促进其凋亡。     

RNA干扰对XWLC-05肺癌细胞水通道蛋白3表达的影响

目的构建靶向水通道蛋白3（AQP3）的siRNA表达载体,探讨其对XWLC-05肺癌细胞系AQP3表达的影响。方法构建AQP3特异性siRNA表达载体和对照组表达载体,以脂质体法转染XWLC-05肺癌细胞,用RT—PCR检测AQP3mRNA的表达,用Westernblot方法检测APQ3蛋白的表达。结果成功构建靶向AQP3的siRNA表达载体1和2,分别命名为pAQP3-siRNAl、pAQP3-siRNA2。转染48h后pAQP3-siRNA1和pAQP3．siRNA2转染组AQP3 mRNA的表达量分别是对照组的65％和79％,组间比较有统计学差异（P〈0．05）;pAQP3-siRNAI和pAQP3-siRNA2转染后的蛋白表达量分别是对照组的53％和。73％,pAQP3-siRNA1干扰效果明显高于pAQP3-siR—NA2（P〈0．05）。结论AQP3特异性siRNA能够有效地抑制XWLC-05肺癌细胞系AQP3的表达。