mtDNA突变与大肠癌发病关系的基础研究

目的观察大肠癌突变型mtDNA转导NIH3T3细胞后转染细胞的生物学特性。方法通过脂质体法（lipofection2000^TM）将大肠癌细胞突变的mtDNA真核表达载体转染NIH3T3细胞，利用G418抗性筛选克隆细胞：用荧光标记的染色体原位杂交（HSH）观察mtDNA在核内的整合情况；观察转染前后细胞异型性及进行染色体核型分析；PCR法检测转染细胞线粒体突变情况；流式细胞仪（FCM）检测转染细胞的凋亡情况；用四唑盐比色法（MTT）测定不同组间细胞增殖的吸光度值。结果突变的大肠癌mtDNA可通过影响NIH3T3细胞的mtDNA的突变、多态性和通过外源性mtDNA在核内的整合从而影响NIH3T3细胞的染色体核型及细胞增殖、凋亡等生物学行为。结论突变型mtDNA可能参与大肠癌的发生与发展。     

p21活化激酶1基因在大肠癌细胞中的表达及意义

目的 探讨p21活化激酶l（PAK1）基因在大肠癌细胞中的表达及意义。方法 运用免疫印迹技术检测PAK1基因在8株不同转移和恶性潜能大肠癌细胞（LoVo、SW480、SW620、SW1116、HT29 HCT116和CO-LO320细胞）中的表达。结果 与HCT116、HT29、SW480、SW1116和LST细胞相比,PAK1在LoVo、COLO320和SW620大肠癌细胞中蛋白表达明显增加,而HT29和SW480细胞中的PAK1蛋白表达亦强于SW1116和LST细胞,但PAK1在SW1116和LST细胞几乎无表达。结论 PAK1蛋白过度表达可促进大肠癌的发生、发展,且可能与大肠癌的恶性生物学表型密切相关。     

前列腺癌特异突变DNA聚合酶β表达载体转染NIH3T3的细胞生物学行为变化

目的观察前列腺癌(CPa)特异突变DNA聚合酶β(polβ)表达载体转染NIH3T3的细胞生物学行为变化。方法采用业已成功构建的2例特异突变polβ表达载体(pCDNA3.1-M1和pCDNA3.1-M2),采用脂质体包裹转染NIH3T3细胞,观察比较这些突变对细胞polβ基因mRNA和蛋白表达的影响以及引发的相应的细胞周期和细胞自发突变率等细胞生物学行为的变化。结果筛选得到高表达PCa特异突变polβ的NIH3T3细胞株(NIH3T3-M1,NIH3T3-M2)和高表达野生型polβ的NIH3T3细胞株(NIH3T3-W)。RT-PCR和Western印迹结果显示,外源DNApolβ在转化的NIH3T3细胞中呈现高表达。与转染空载体和未转染的NIH3T3细胞相比,转染PCa特异突变polβ的2个细胞株和转染野生型polβ的细胞株的细胞周期的S期比例及转染细胞的HGPRT(次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶)基因的自发突变率均显著增加,且转染野生型polβ的细胞株亦显著高于转染PCa特异突变DNApolβ的细胞株。结论 DNApolβ高表达介导了肿瘤发生的分子机制。     

增殖诱导配体在大肠癌细胞株上的表达、定位及意义

目的了解增殖诱导配体（APRIL）在大肠癌细胞株上的表达、定位及意义。方法分别采用RT-PCR和Western Blotting技术检测APRIL在大肠癌细胞株SW620、LOVO、HCT116、HT29及SW480上的表达,同时采用ATP法检测这些大肠癌细胞株对5-FU的耐药性;以LOVO细胞为研究对象,用细胞免疫荧光技术分析APRIL蛋白的细胞定位情况。结果 RT-PCR和Western-blotting检测显示,APRIL在不同大肠癌细胞株中存在差异性表达,在LOVO、HCT116相对高表达,而在SW480、SW620、HT29相对低表达,其表达水平与5-FU耐药性呈正相关。激光共聚焦显微镜观察发现APRIL蛋白在LOVO细胞中主要定位于细胞浆,胞核中少见。结论 APRIL在大肠癌细胞株上有差异表达,其表达水平与大肠癌细胞株的5-FU耐药性有相关性。APRIL主要定位于胞浆。     

大肠癌细胞线粒体DNA D-环区的突变

目的研究线粒体DNAD-环区在大肠癌细胞中的突变情况。方法用PCR与直接测序相结合的方法．对比分析三株大肠癌细胞系和一例原代培养的正常肠上皮细胞的线粒体DNAD-环区的突变位点。结果三株大肠癌细胞系和正常肠上皮细胞的线粒体DNAD—环区均存在不同程度的点突变，其中72位C→T，73位A→G，16298位C→T，16519位T→C这4个突变位点在3株癌细胞和正常肠上皮细胞中均可检测到。在SW480和Lovo细胞中检测到16224位T—c、1631l位T—c两个相同的突变位点，在SW480和HT29中检测到114位C→T、498位C→T、16234位C→T 3个相同的突变位点．不同大肠癌细胞系中相同的突变位点考虑为细胞的特征性改变。结论大肠癌细胞线粒体DNAD-环区具有多态性和特征性突变，细胞特征性的突变可能与大肠癌患者的易感性有关。     

基因转染CLD1对大肠癌细胞株SW480粘附作用的影响

目的：探讨基因转染CLD1对大肠癌细胞株SW480粘附作用的影响。方法对SW480 CLD1（转染CLD1的SW480细胞株）、SW480 control （转染了pEGFP-C1的SW480细胞株）、SW480细胞株分别进行细胞同质粘附实验和细胞异质粘附实验。结果细胞同质粘附实验结果显示SW480CLD1细胞粘附细胞数量少于SW480 control （ P＝0.000）和SW480细胞（ P＝0.000）,SW480 control的粘附细胞数与SW480无差异（ P＝0.376）,粘附细胞数顺序为SW480CLD1＜SW480control和SW480。异质粘附实验的结果显示SW480CLD1粘附细胞数多于SW480control（P＝0.000）和SW480（P＝0.000）,差异有统计学意义。 SW480control和SW480粘附细胞数无显著差异（P＝0.334）。粘附细胞数顺序为 SW480CLD1＞SW480control和 SW480。结论 CLD1基因转染后可减少SW480细胞之间的同质粘附作用,增加SW480细胞与Ⅳ型胶原的粘附性。     

霍乱肠毒素ctxA基因真核表达重组质粒的构建及表达

目的 构建霍乱肠毒素A亚单位基因（ctxA）真核表达重组质粒，并在NIH3T3细胞中进行表达。方法 用限制性核酸内切酶从重组质粒pET32a—ctxA上切下ctxA基因，导入真核表达载体peDNA3．1（＋）．重组子pcDNA3．1-ctxA经限制性酶切分析、PCR鉴定和序列测定正确后，用脂质体法将重组质粒pcDNA3．1-ctxA转染NIH3T3细胞，采用免疫荧光法和Westernblot对peDNA3．1-ctxA的瞬时表达产物和稳定表达产物进行鉴定。结果 重组质粒peD—NA3．1-ctxA成功转入NIH3T3细胞。利用免疫荧光技术在NIH3T3细胞膜和细胞浆中检测到了瞬时表达，用Westernblot检测到转染的阳性细胞克隆稳定表达出约29ku的蛋白。结论 成功构建霍乱肠毒素A亚单位基因真核表达重组质粒peDNA3．1-ctxA，并在NIH3T3细胞中表达出29ku的CTA蛋白。     

下调VEGF基因表达对人大肠癌细胞株SW480的增殖抑制作用

目的利用RNA干扰技术特异性抑制人大肠癌细胞株SW480的VEGF基因表达,并进行大肠癌的基因治疗。方法体外合成带有T7启动子的VEGF基因DNA片段、转录针对VEGF mRNA的siRNA、利用脂质体转染法导入SW480细胞内,MTT染色法观察转染后的SW480细胞增殖抑制率,ELISA法检测蛋白表达水平。RT-PCR检测转染后VEGF mRNA表达水平的变化。结果设计的两个靶位点siRNA能有效抑制SW480细胞生长,VEGF mRNAR的表达受到有效抑制,而阴性对照的错义序列组siRNA细胞生长良好。结论体外合成的VEGF siRNA可有效抑制SW480细胞增殖和VEGF mRNA蛋白表达水平。     

大肠侧向发育型肿瘤线粒体DNA D-环区的突变

目的:了解大肠侧向发育型肿瘤(laterally spreading tumor, LST)线粒体DNA的突变,探讨其与肿瘤发生的关系. 方法:提取LST线粒体DNA(mtDNA),扩增D-环区,产物用DNA自动测序法进行序列分析. 结果:共检测到4个碱基突变.第16223位C突变为T,第16298位C突变为T,第16362位T突变为C,第16519 位T突变为C. 结论:线粒体DNA D-环区是—个具有高度多态性和突变性的区域,在LST中突变率较高.     

PRL-3真核绿色荧光蛋白表达载体的构建及其在结肠癌SW480细胞中的表达

目的:构建蛋白酪氨酸磷酸酶-3(PRL-3)绿色荧光蛋白真核表达载体pEGFP-N1-PRL-3,为PRL-3基因功能研究奠定基础.方法:设计人PRL-3特异性引物,提取人大肠癌细胞系SW620细胞总RNA,应用RT-PCR方法获取人PRL-3全长cDNA,分别克隆至T载体及真核绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-N1,应用PCR、酶切及DNA测序进行鉴定,确认后转染大肠癌细胞SW480,应用G418进行筛选获取PRL-3稳定表达细胞克隆,应用荧光定量PCR检测PRL-3基因表达.结果:获得522 bp的PRL-3基因编码序列并成功构建了真核绿色荧光蛋白表达载体pEGFPN1-PRL-3,该重组载体能够在SW480细胞中稳定表达.结论:成功构建真核绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-N1-PRL-3和建立PRL-3稳定表达SW480细胞,为进一步深入研究PRL-3基因在大肠癌发生发展中的作用奠定基础.     

二甲双胍对人胰腺癌细胞迁移的抑制作用

目的:研究二甲双胍对胰腺癌细胞迁移的影响,并初步探讨可能机制.方法:体外培养人胰腺癌细胞株Bxpc-3,予二甲双胍进行干预作为实验组(M组),无药物组作为对照组(C组).MTT检测二甲双胍对Bxpc-3细胞存活率的影响,细胞划痕实验检测划痕愈合率,RT-PCR检测MMP-2、MMP-9 mRNA的表达,Elisa检测细胞培养上清液MMP-2、MMP-9蛋白的分泌量.结果:与对照组相比,MTT结果示二甲双胍可以抑制人胰腺癌细胞株Bxpc-3的增殖,并呈时间-浓度依赖性(F=8.991,124,114.61,P<0.01);划痕实验示二甲双胍干预组12、24、48h与对照组相比划痕愈合率显著下降(t=7.683,9.013,10.471,P<0.01);RT-PCR示二甲双胍干预组MMP-2、MMP-9mRNA的表达显著降低(t=16.563,28.494,P<0.01);Elisa示二甲双胍干预组MMP-2、MMP-9蛋白分泌明显下降(t=9.428,13.542,P<0.01).结论:二甲双胍能显著抑制人胰腺癌细胞株Bxpc-3的增殖及迁移,其主要机制可能与抑制MMP-2、MMP-9活性有关.     

Effects of phorbol esters on an interleukin-3-dependent cell line

FDC-P1 is an interleukin-3 (IL-3)-dependent cell line that ceases to proliferate in the absence of IL-3. We have isolated variant cell lines from FDC-P1 that grow in response to phorbol myristate acetate (PMA). These variant cell lines (FD/PMA) have maintained their PMA-dependency for over 1 year. Lymphokine gene expression, which would support growth, was not detected in FD/PMA lines. FD/PMA lines had a different cell surface phenotype than the parental line. Mac-1, Mac-2, and Mac-3 were readily detected on the cell surface of FD/PMA lines; however, these antigens were not detected on FDC-P1. Because protein kinase C (PKC) activation may mediate PMA effects, we examined this kinase. PKC activity quantitated by 32P-incorporation into histone was increased in FDC-P1 as compared with FD/PMA cultured in IL-3. Moreover, PKC activity was undetectable in FD/PMA lines cultured in PMA. Using Western blotting, immunoreactive PKC was readily detected in cytosolic and solubilized particulate fractions of FDC-P1 cells, not but in FD/PMA cell extracts. Comparisons between the parental and FD/PMA lines should provide insight into IL-3- and PMA-mediated signal transduction.     

Ultrastructural features of minute chromosomes in a methotrexate-resistant mouse 3T3 cell line

The Miller spreading procedure was applied to mouse metaphase spreads of methotrexate-resistant 3T3 cells that contain large numbers of minute chromosomes and dihydrofolate reductase genes. There is substantial variation in both size and numbers of minutes in individual cells, the smallest of which (estimated as 5 X 10(3) kilobase pairs) would be undetected by standard light microscopic analyses. Minute chromosomes are composed of nucleosomal chromatin, which is organized into typical higher order fibers that are folded to form rosette-like structures characteristic of normal chromosome organization. There is no evidence that the DNA in minutes is linear. Minutes exist singly and in pairs, and members of a pair are connected by higher order chromatin fibers, suggesting that they are topologically interlocked. They are often closely apposed to chromosomal telomeres or arms, a configuration that may be involved in their distribution at mitosis. In addition to typical minutes, which do not possess kinetochores, a small marker chromosome possessing all of the features of a centromere region is present in parental and resistant cells. An unusual feature of this cell line is the retention of resistance, minute chromosomes, and amplified dihydrofolate reductase genes; most methotrexate-resistant mouse cell lines with minute chromosomes lose these properties when grown in the absence of methotrexate.     

雌激素受体在胃腺癌细胞株和胃癌高侵袭转移细胞系中的表达

目的 测定雌激素受体(ER)在人胃腺癌细胞系SGC-7901以及高转移株OCUM-2MD3上的表达.方法 用免疫细胞化学方法、RT-PCR和免疫印迹方法检测ER在人胃腺癌细胞上的表达,并对其表达量进行相对定量分析.结果 ER在人胃腺癌细胞上有表达;ERα在OCUM-2MD3细胞系的表达强于SGC-7901;而ERβ表达在SGC-7901和OCUM-2MD3中相同,并且ERα/ERβ比值在胃癌高侵袭转移细胞系OCUM-2MD3中升高.结论 雌激素有可能通过它的受体对人胃腺癌细胞产生一定的影响,ERα/ERβ比值的改变在胃腺癌发生和转移过程中可能起一定作用.     

Insulin attenuates leptin-induced STAT3 tyrosine-phosphorylation in a hepatoma cell line

Leptin, the 16 kDa protein product of the ob gene, is secreted by adipocytes. The long form leptin receptor (ObRb) is expressed at high levels in the hypothalamus, and regulates appetite and energy expenditure. The fact that serum concentration of leptin is correlated with body mass index (BMI) suggests reduced sensitivity to leptin. Even though hyperinsulinemia and hyperleptinemia could coexist in obese humans, little is known about the interaction of insulin and leptin. In this study, we examined the effect of insulin on leptin signaling using Huh 7 cells transiently transfected with ObRb cDNA. Insulin inhibits leptin-induced STAT3 phosphorylation in a time- and dose-dependent manner without affecting Janus tyrosine kinases (JAKs) JAK2 phosphorylation. Okadaic acid prevents the inhibitory effect of insulin on leptin-induced STAT3 activation.     

雄激素受体对前列腺癌PC3细胞株增殖能力的影响

目的研究雄激素受体（AR）对雄激素非依赖性前列腺癌细胞株PC3增殖能力的影响。方法将含有AR的质粒（Pbabe-AR）稳定转染到PC3细胞,建立起新的细胞系PC3-AR,并用实时逆转录聚合酶链反应（Q—PCR）、蛋白免疫印迹试验（Western blot）和荧光素酶法确认AR的表达水平和功能;用MTT法、软琼脂糖凝胶实验检测AR对体外培养PC3细胞增殖的影响。结果PC3-AR细胞能够稳定表达有功能的AR;MTT实验显示PC3-AR细胞体外生长慢于PC3-v细胞,加入DHT以后效果更加明显。相对于PC3-v,PC3-AR在软琼脂糖凝胶中形成的克隆明显减少。结论AR能够降低PC3-AR细胞在体外的增殖能力。     

三氧化二砷对肺成纤维细胞株NIH3T3增殖和凋亡的影响

目的 探讨三氧化二砷（As2O3）的抗肺纤维化（PF）作用及其机制。方法将对数生长期成纤维细胞株NIH3T3随机分为对照组及观察1组、观察2组,分别用含0、2、4μmol／LAs2O3的DMEM培养液处理24h和48h,采用四甲基偶氮唑蓝（MTF）法检测细胞增殖抑制率（IR）,流式细胞术检测细胞周期分布,透射电镜和Hoechst染色方法观察细胞超微结构及细胞核形态变化。结果 观察1组和观察2组细胞增殖IR均显著高于对照组,尤以作用48h时和观察2组为著（P均〈0.01）;观察1组和观察2组G0／G1,期细胞显著多于对照组,而G2／M期细胞显著少于对照组,尤以观察2组为著（P均〈0.01）;观察1组和观察2组细胞具有早、中期凋亡形态学特征（细胞膜结构完整、细胞质浓缩、染色质边集、固缩）。结论As2O3可抑制肺成纤维细胞株NIH3T3增殖并促进其凋亡,此为临床PF治疗提供了新思路。     

间隙连接蛋白43对胰腺癌细胞株BxPC3凋亡的作用及其机制研究

目的 研究间隙连接蛋白43(Cx43)在胰腺癌细胞凋亡中的作用,并探讨其机制.方法 采用脂质体2000法将pcDNA-Cx43、pcDNA-Cx43N、空质粒peDNA3.0、siRNA-Cx43和对照siRNA-NC分别转染BxPC3细胞.Western blotting检测细胞Cx43蛋白表达、细胞色素C(Cyt C)含量;流式细胞仪检测细胞凋亡、线粒体膜电位;荧光分光光度计检测细胞Caspase-9和Caspase-3活性;染料传递法测定细胞间间隙连接(GJ).结果 Cx43转染BxPC3细胞后,Cx43蛋白表达明显上调,细胞凋亡从空质粒转染组的(6.35±0.43)%增加到(14.29±1.24)%,经H_2O_2处理后,从(20.34 ±2.47)%增加到(31.27±2.56)%(P<0.05),同时线粒体膜电位下降,Cyt C从线粒体释放增多,Caspase蛋白酶活性增加;而siRNA43干扰细胞后,细胞凋亡从(7.42±0.47)%减少到(5.19±1.37)%,经H_2O_2处理后,从(19.43±1.71)%减少到(11.67±1.97)%(P<0.05),线粒体膜电位去极化,Cyt C从线粒体释放减少,Caspase 酶活性下调.细胞间间隙连接指数在无GJ抑制剂B-GA情况下从对照组的14.52±0.57增加到peDNA-Cx 43转染组的23.05±3.84,在存在β-GA情况下从1.70±0.24增加到3.84±0.45(P<0.05),但细胞凋亡率改变无显著差异.结论 Cx43可通过线粒体凋亡途径促进BxPC3细胞凋亡,Cx43调节细胞凋亡存在间隙连接以外的机制.