体外共培养诱导骨髓间充质干细胞向胰岛样细胞分化

目的 观察成熟胰岛细胞对小鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow derived mesenchymalstem cells,mMSCs)的诱导分化作用,为胰岛细胞移植治疗糖尿病提供移植细胞来源.方法 采用贴壁法分离培养小鼠mMSCs,并传代扩增.应用共聚焦显微镜观察细胞形态,流式细胞仪分析其表面分子.经胆总管注入Ⅳ型胶原酶消化胰腺,行密度梯度离心获得胰岛细胞.运用Transwell共培养体系,取第3代mMSCs与胰岛细胞共培养,倒置显微镜观察细胞的生长及形态变化,细胞免疫化学法检测mMSCs胰岛素的表达,胰岛素释放试验检测胰岛素分泌.以单独培养mMSCs作为对照组.结果 从小鼠骨髓中获得的细胞培养48 h后呈长梭形,体积较大,1周后呈集落式生长,可传代培养.细胞表面分子Sca-1、CD29、CD44、CD105呈阳性,且表达水平较高,而CD34、CD45阴性,证实为mMSCs.与小鼠胰岛细胞共培养7 d后,部分mMSCs细胞胰岛素免疫组化染色呈阳性,胰岛素分泌量为(16.83±0.15)μIU/ml.结论 从小鼠骨髓中分离培养的mMSCs与胰岛细胞共培养后可以被诱导分化为胰岛样细胞,为在胰岛细胞移植治疗糖尿病中存在的供体缺乏和免疫排斥问题提供了新的解决方法 .     

骨髓间充质干细胞向急性肾损伤小鼠的肾脏归巢现象及功能探讨

目的:观察在缺血再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)模拟急性肾损伤的小鼠模型中,骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)能否向损伤的肾小管迁移并促进其修复. 方法:Percoll密度梯度离心结合贴壁培养法有效分离纯化出C57BL/6小鼠的骨髓间充质干细胞(mMSCs),5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)标记并采用免疫组化法鉴定.雄性C57BL/6小鼠45只,分为正常埘照组(15只)、I/R组(15只、夹闭双侧肾蒂30 min开放)、I/R+BrdU-mMSCs组(15只、夹闭双侧肾蒂30 min开放的同时尾静脉注射经BrdU标记的mMSCs).于建模后1d、2d、3d、7d、14d分别处死部分小鼠(每次每组均处死3只),留取动脉血及肾组织,检测血肌酐(SCr)及尿素氮(BUN)水平,观察肾组织病理变化,荧光组织化学及免疫组织化学观察MSCs在受体小鼠肾组织的分布并对其进行鉴定. 结果:经免疫组化证实BrdU标记mMSCs的阳性率可达(98.71±0.32)%.I/R组、I/R+Brdu-mMSCs组小鼠的BUN及SCr均显著高于正常对照组,但I/R+BrdU-mMSCs组小鼠的BUN及SCr水平却较同一时间点的I/R组为低,肾小管损伤程度评分也有着显著降低.免疫组化检测显示I/R+BrdU-mMSCs组小鼠肾脏中可检测到BrdU~+细胞的分布,以术后第3天最多[(19.36±6.94)%].经荧光组织化学及激光共聚焦显微镜观察证实该BrdU~+细胞定位于小鼠的肾小管上皮细胞(renal tubular epithelial cells,RTECs)处,且表达RTECs特异性的标志物角蛋白18(cytokertain-18,CK18). 结论:小鼠发生I/R诱导的急性肾损伤后可诱导MSCs向损伤的肾小管上皮迁移并转化,参与RTECs的更新,促进肾损伤的修复.     

脂肪间充质干细胞向肝细胞横向分化的研究

目的探讨脂肪源性间充质干细胞（AMSC）向肝细胞横向分化的可能性。方法胶原酶消化脂肪组织,贴壁培养,体外扩增后以流式细胞仪鉴定其表面标志。取扩增3代的AMSC分为2组,诱导分化组在含有2％FBS的DMEM-F12培养基中加入肝细胞生长因子20 ng/ml和成纤维细胞生长因子4 10 ng/ml、1×ITS和地塞米松0．1μmol/L,培养14 d；空白对照组则不加任何细胞因子。RT-PCR检测诱导分化过程中肝细胞核因子1、GATA4等基因转录水平的变化。2周后,采用流式细胞术检测AFP和Alb阳性细胞在两组细胞中的比例,检测肝细胞特异性细胞角蛋白（CK） 18、CK19的表达。结果分离、培养的AMSC呈成纤维细胞样生长,可以稳定传代。流式细胞术检测结果显示第3代脂肪间充质干细胞高表达表面CD29、CD44；不表达CD34、CD45。RT-PCR检测诱导5、8、11、14 d的细胞,显示有肝细胞特异性转录因子GATA4和肝细胞核因子1A基因的表达,并随时间延长而逐渐增多。流式细胞术检测诱导14 d的细胞,发现30．0％的细胞表达Alb,17．8％细胞表达AFP,双阳性的细胞为6．9％；免疫荧光检测发现诱导细胞表达CK18、CK19。空白对照组脂肪间充质干细胞则未见上述各项变化。结论在低血清培养体系中,采用细胞因子联合诱导,显示脂肪间充质细胞在体外能定向分化为肝细胞样细胞。     

心脏侧群细胞在体外的增殖与分化

目的:描述成年小鼠心脏的SCA1-/CD31-CSP细胞特征,研究它们在体外的增殖、分化能力。方法:通过荧光激活细胞(流式细胞仪)、逆转录酶聚合酶链反应、甲基纤维素和内皮细胞培养基培养,对细胞进行分选、基因、增殖、分化的检测。结果:SCA1-/CD31-CSP细胞表达干细胞和内皮祖细胞基因,这些细胞能够在体外增殖、分化和血管化。结论:在鼠的心脏中SCA1-/CD31-CSP细胞可作为内皮祖细胞。     

人脂肪间充质干细胞体外分离、培养的方法研究

目的：探讨人脂肪间充质干细胞体外分离及培养方法。方法用消化离心的方法获得人脂肪间充质干细胞,以1×104/cm2接种于体积分数为0．1％胎牛血清的LG-DMEM培养基中,并进行细胞形态学观察,绘制细胞生长曲线,流式细胞仪检测细胞表面抗原,行成脂及成骨诱导检测其多向分化潜能。结果获取的脂肪间充质干细胞大小较为均匀,呈梭形的成纤维细胞样,细胞增殖良好;细胞生长曲线测定表明接种后第4天细胞进入指数增长期,第8天后生长进入平台期,体外能长期培养存活,并保持不分化状态;流式细胞仪检测表明细胞高表达 CD13、CD73,低表达 CD34、CD45及 HLA-DR;能诱导成脂及成骨细胞。结论利用消化离心法在体外能分离得到脂肪间充质干细胞,细胞生长良好,可作为组织工程的种子细胞。     

脑组织匀浆诱导人脐带间充质干细胞分化为神经样细胞

目的模拟体内微环境,研究人脐带间充质干细胞(hUCMSCs)在脑组织匀浆诱导下向神经样细胞的分化程度。方法体外分离、培养、扩增hUCMSCs,流式细胞仪鉴定其表面抗原CD29、CD44、CD45、CD105、CD34、HLA-DR;制备大鼠脑组织匀浆与hUCMSCs共培养,在倒置显微镜下观察细胞形态变化,并应用免疫细胞化学技术检测共培养3 d后细胞内神经干细胞表面标志物巢蛋白(nestin)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)及胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达。结果脑组织匀浆培养hUCMSCs后,细胞表达nestin、NSE及GFAP,而正常培养的hUCMSCs不表达。结论脑组织匀浆可以诱导hUCMSCs向神经样细胞分化。     

脐血、外周血内皮祖细胞分化成内皮细胞的实验研究

目的探讨人的脐血、外周血内皮祖细胞（endothelialprogenitorcells,EPCs）体外分离、纯化、诱导扩增和分化为内皮细胞的可行性,并检测其表型和功能。方法新鲜脐血和健康成年人的外周血,使用Ficoll密度梯度离心法得单个核细胞,在M199培养基中体外培养,3d后去除悬浮细胞,继续培养,诱导EPCs增殖和分化。流式细胞仪检测EPCs标志CD34和内皮细胞特异性标志CD31表型,RTPCR检测ecNOS,flk1/KDR基因水平表达,免疫组化验证蛋白水平表达,并进一步通过NO活性的变化检测内皮细胞的功能。结果流式细胞仪检测,外周血单个核细胞（peripheralbloodmononuclearcells,PBMC）刚分离时,CD34阳性表达率为（1.1±0.8）%,培养3d后为（16.9±6.2）%。细胞形态观察发现,刚分离的单个核细胞呈圆形,形态小,3d后有明显集落形成,7d后梭形细胞线样排列,随培养时间增加,细胞形态逐渐变大,呈现出典型铺路石样改变。脐血单个核细胞（umbilicalcordbloodmononuclearcells,CBMC）和PBMC培养10d后,CD31阳性表达率分别为（76±17）%和（82±9）%。RTPCR检测有内皮细胞特异性成分ecNOS,flk1/KDR的表达。免疫组化染色,细胞膜和细胞浆中有弥漫性棕色出现,呈阳性反应,证实了蛋白水平的表达。培养10d的贴壁细胞随着VEGF浓度增加,NO生成增加,具有内皮细胞的功能。结论脐血,外周血EPCs体外分离,纯化,诱导培养后的贴壁细胞表型检测,大部分细胞具有内皮系标志物,并具有产生NO功能。     

大鼠原代前脂肪细胞及诱导分化方法的探讨

目的探寻大鼠原代培养前脂肪细胞及诱导分化的最佳方法。方法采用胶原酶消化法体外培养大鼠前脂肪细胞。显微镜下观察细胞形态改变,流式细胞仪检测细胞增殖活性;以分化培养基诱导分化后,油红O染色法进行细胞鉴定。结果成功培养大鼠前脂肪细胞。前脂肪细胞24 h贴壁时为类圆形,3 d后渐成梭形或多角梭形,6 d左右进入指数增长期;流式细胞仪检测证明细胞具有增殖分化能力;油红O染色可见细胞内出现红染颗粒。结论成功建立高效原代培养前脂肪细胞及诱导分化的方法,为脂肪细胞的相关研究提供了良好的细胞模型。     

系统性红斑狼疮患者CD200/CD200R的表达及其在Treg/Th17细胞平衡中的作用

目的检测系统性红斑狼疮(SLE)患者CD200/CD200R1的表达,探讨CD200/CD200R1信号对Th17/Treg平衡的影响。方法用流式细胞仪检测53例SLE患者及24名健康对照者CD4+T细胞以及树突细胞表面CD200和CD200R1的表达,用酶联免疫吸附试验检测受试者血清游离CD200水平。通过体外细胞刺激培养观察CD200/CD200R1信号对Th17分化及调节性T细胞Treg生成的影响。结果 SLE患者CD4+T细胞、树突细胞CD200的表达及血清游离CD200水平均显著高于健康对照者,差异有统计学意义(P<0.05);CD200R1显著低于健康对照者,差异亦有统计学意义(P<0.05)。体外细胞培养给予CD200-Fc融合蛋白可降低SLE患者Th17的分化并纠正TGF-β诱导的调节T细胞生成缺陷。结论 SLE患者CD200和CD200R1表达异常,CD200/CD200R1信号在Th17/Treg平衡中具有重要作用。     

小鼠骨髓基质干细胞的鉴定及体外诱导分化为肝细胞的可行性

目的:分离、鉴定小鼠骨髓基质干细胞(MSCs)并探讨在体外多种细胞因子的诱导下分化为肝细胞的可行性.方法:获取小鼠骨髓干细胞,进行体外贴壁培养、纯化,观察不同传代次数细胞形态特点.流式细胞法检测不同传代细胞的表面标志物CD45和CD90.分离后的MSCs再经含有HGF,FGF-4,EGF三种细胞因子的诱导体系继续培养21 d,分别以半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot方法检测诱导后细胞的白蛋白(ALB)、细胞角化蛋白18(Cg18)、以及甲胎蛋白(AFP)在基因和蛋白水平的表达.结果:培养的骨髓干细胞随传代次数增多细胞形态趋向为长梭形.传代到第5代,基质干细胞的表面标志CD90阳性细胞从原代的25.42%增加到93.47%,造血干细胞的表面标志CD45表达阳性细胞从原代的86.49%降低到2.77%.通过RT-PCR可检测出诱导第7天细胞表达AFP mRNA,ALB mRNA及CK18 mRNA;通过Western blot可检测出诱导第21天的细胞表达ALB和CK18.结论:小鼠MSCs可以在体外被有效地分离纯化,可以被诱导为表达肝细胞表面标志的肝细胞样细胞.