隐孢子虫牛源分离株的分离和鉴定

目的 分离和鉴定采自徐州自然感染奶牛粪便中的隐孢子虫卵囊。 方法 在徐州某奶牛场采集经改良抗酸染色镜检确认为隐孢子虫感染的奶牛粪便，用不连续Sheather′s蔗糖密度梯度离心法纯化卵囊。采用Chelex-100方法提取卵囊基因组DNA，设计引物扩增小亚基核糖体RNA（SSU rRNA）基因和卵囊囊壁蛋白（COWP）基因，分别克隆到pGEM-T和pGEM-T Easy载体，测定核苷酸序列，运用BLAST和MEGA软件进行序列同源性和种系发生分析。 结果 分离的隐孢子虫卵囊个体大小为（7.4±0.32） μm×（5.4±0.21） μm，长宽比为1.37±0.07（n=20）。徐州牛源隐孢子虫与Gen-Bank公布的安氏隐孢子虫比较，SSU rRNA和COWP基因序列同源性分别为100%和99%。种系发生分析显示该株隐孢子虫与安氏隐孢子虫处于同一分支。 结论 由徐州自然感染奶牛粪便中分离获得的隐孢子虫是安氏隐孢子虫。     

隐孢子虫卵囊DNA纯化方法的研究进展

PCR技术不仅可检测极微量的隐孢子虫,而且具有高度特异性,在隐孢子虫检测中发挥重要作用。PCR检测中,隐孢子虫卵囊模板DNA的制备尤为重要,需对卵囊进行分离纯化和裂解后才能提取纯化DNA。本文综述目前常用的卵囊分离纯化、裂解和DNA提取纯化的方法。     

微小隐孢子虫卵囊DNA提取及用于PCR检测

目的采用3种方法提取微小隐孢子虫卵囊DNA,并用于PCR检测以进行比较。方法 微小隐孢子虫卵囊经多次冻融加热破壁后,采用螯合树脂(Chelex-100)、酚/氯仿和基因组DNA纯化系统试剂盒3种方法提取微小隐孢子虫卵囊DNA,并根据微小隐孢子虫基因序列(L16996)设计一对寡核苷酸引物,分别对3种方法制备模板进行PCR扩增分析。Chelex-100提取的DNA也用于观察PCR检测的敏感性。结果3种方法制备的微小隐孢子虫卵囊模板用于PCR检测均获得1条446 bp条带,Chelex-100提取的DNA用于PCR检测的敏感性至少达0.5个卵囊。结论3种方法提取的微小隐孢子虫卵囊DNA均可用于PCR检测,Chelex-100法是一种高效而快速的微量提取DNA方法,适用于对隐孢子虫DNA的检测。     

生菜污染隐孢子虫卵囊洗脱与巢式PCR检测方法的研究

目的 比较生菜表面污染隐孢子虫卵囊的洗脱与检测方法。方法 对生菜表面人工“种植”的隐孢子虫卵囊的洗脱次数、振荡方式、振荡频率、振荡时间、洗脱液种类等进行比较,以及3种商业化DNA提取试剂盒提取水溶液中隐孢子虫卵囊DNA的效果进行比较。结果 采取往返振荡,振荡频率为100次/min,振荡时间为1 h,洗脱液采用1% Alconox^○R时,其总体回收率最高,达71.40%。不同DNA试剂盒比较显示,土壤DNA提取试剂盒与粪便DNA提取试剂盒较组织DNA提取试剂盒提取水溶液中隐孢子虫卵囊DNA的质与量均高。结论 本研究建立了巢式PCR检测生菜表面微小隐孢子虫卵囊的检测方法,为蔬菜的食品安全提供新的技术方法。     

从鼠粪中分离纯化微小隐孢子虫卵囊方法的研究

目的 探索一种实用、纯度和回收率高且卵囊活力强的分离纯化微小隐孢子虫卵囊的方法。 方法 分别采用经典的不连续蔗糖密度梯度离心法、改良饱和盐水漂浮法、氯化铯（CsCl）密度梯度离心法和Percoll密度梯度离心法分离纯化C57BL/6小鼠粪中隐孢子虫卵囊。并将4种方法分离纯化获得的卵囊各10⁵体外感染牛输卵管上皮细胞（BFTE）， 48 h和72 h后油镜下观察各分离法卵囊的发育情况，以比较卵囊的纯度和活性。 结果 经典的不连续蔗糖密度梯度离心法分离获得的卵囊数[（2.86±0.08）×10⁷］与改良饱和盐水漂浮法[（2.88±0.15）×10⁷］无明显差异（P>0.05）， 但高于Percoll密度梯度离心法[（1.52±0.08）×10⁷］（P<0.01）和CsCl密度梯度离心法[（2.46±0.13）×10⁷］（P<0.05）。4种方法分离纯化的卵囊体外感染BFTE 48 h和72 h后隐孢子虫数无明显差异（P>0.05）。但CsCl密度梯度离心法纯化的隐孢子虫卵囊纯度明显高于不连续蔗糖密度梯度离心法。 结论 改良饱和盐水漂浮法较经典的不连续蔗糖密度梯度离心法操作简单、快速；CsCl密度梯度离心法分离的隐孢子虫卵囊纯度较高。     

贝氏隐孢子虫PCR检测试剂盒的研制

目的研制禽类贝氏隐孢子虫的PCR检测试剂盒。方法根据贝氏隐孢子虫18S rRNA和ITS-1序列,选取遗传标记位点最多的一段核苷酸序列作为特异PCR引物的靶序列,设计、合成了一对针对贝氏隐孢子虫的特异性引物（YJwF：5′-ACTGATATACAATACCACG-3′和YR：5′-GCGGATAAAGTTCAGGTTC-3′）,对PCR反应条件进行了一系列优化,并分别对试剂盒的特异性、敏感性、稳定性、重复性和保存期等进行了系列研究。结果该试剂盒能特异性地扩增出贝氏隐孢子虫基因组中相应片段,与安氏隐孢子虫,微小隐孢子虫,柔嫩艾美尔球虫等相关原虫基因组DNA无交叉反应;最低能检测到3.48个卵囊;反复冻融50次对试剂盒没有影响;室温条件下至少可保存4个月。结论该试剂盒的各项指标达到了贝氏隐孢子虫的检测要求。     

微小隐孢子虫的基因检测实验研究

目的 探讨聚合酶链反应（PCR）检测微小隐孢子虫（Cryptosporidium parvum)感染的特异性和敏感性。方法 用Sheather's蔗糖梯度离心法从微小隐孢子虫感染者粪便标本中分离纯化卵囊，用酚-氯仿法抽提卵囊总DNA，针对本虫18SrRNA基因片段设计1对引物，对模板DNA进行PCR扩增，同时以蓝氏贾第鞭毛虫（Giardia lambia)，溶组织内阿米巴（Entamoeba histolytica)。阴道毛滴虫（Trichomonas vaginalis)。刚地弓形虫（Toxoplasma gondii)。日本血吸虫（Schis-tosoma japonicum)和旋毛虫（Trichinella spiralis)，以及人体血细胞等DNA样本为对照，用琼脂糖电泳和溴乙腚染色对PCR产物进行检测。结果 仅微小隐孢子虫DNA被扩增出-500bp的DNA片段，其它对照DNA样本均未出现扩增反应。结论 PCR对隐孢子虫检测的特异性可高达100%，敏感性也很强，可检测到20pg微小隐孢子虫卵囊的DNA，表明本实验建立的检测微小隐孢子虫的PCR方法有效。     

新疆水源性隐孢子虫的检测

目的检测新疆15个城市自来水和河水隐孢子虫污染情况。方法采集水样,分别应用改良美国环保局(EPA)1622法及巢式PCR(nested-PCR)方法进行检测。1)改良EPA1622法:水样经微孔滤膜抽滤、淘洗,磁抗体分离法分离纯化后免疫荧光染色鉴定。2)Nested-PCR法:用试剂盒提取纯化的隐孢子虫卵囊基因组DNA,针对隐孢子虫小亚单位核糖体RNA(18SrRNA)部分基因,依据文献设计并合成引物,用巢式PCR扩增,产物纯化后经SspⅠ及VspⅠ单酶切,并进行RFLP分析。结果2种方法检测新疆15个地区的自来水隐孢子虫卵囊均为阴性,改良EPA1622法检测乌鲁木齐市、昌吉市、伊宁市和吐鲁番市的河水隐孢子虫卵囊阳性。巢式PCR检测乌鲁木齐市和伊宁市水样,均扩增出约830 bp的特异片段,RFLP初步鉴定为小鼠隐孢子虫基因;昌吉市和吐鲁番市河水水样PCR检测阴性。结论新疆乌鲁木齐市、伊宁市河水检出隐孢子虫,初步鉴定为小鼠隐孢子虫。而当地的饮用水未受污染。     

隐孢子虫卵囊3种分离纯化方法的比较

隐孢子虫（cryptos poridium parvum,C,P）是一种引起人类和动物腹泻的重要病原体，日益受到国内外学者的重视。我国于1987年在南京首次发现该病例，此后许多地区陆续有病例报道。隐孢子虫引起的腹泻是艾滋病病人致死的主要原因。隐孢子虫主要寄生于宿主的胃肠道，卵囊随粪便排出体外，易感者经粪口途径感染隐孢子虫后发病。检查粪便中的隐孢子虫卵囊是诊断隐孢子虫病的主要依据，从粪便标本中分离纯化卵囊，是对隐孢子虫进行深入研究的前提。本研究选择3种原虫分离纯化方法，用于隐孢子虫卵囊的分离纯化，并进行了初步比较。     

基于SYBR Green检测微小隐孢子虫的实时荧光定量PCR方法的建立及应用

目的建立一种方便快捷的检测微小隐孢子虫的实时荧光定量PCR（Real-time PCR）方法。方法根据GenBank公布的微小隐孢子虫18s rRNA基因序列设计1对引物,通过质粒DNA和卵囊检测标准曲线的绘制及特异性和重复性的研究,建立检测微小隐孢子虫的基于SYBR Green的Real-time PCR方法,进而对奶牛粪便进行检测。结果建立的Real-time PCR法对检测微小隐孢子虫具有很高的特异性,质粒DNA和卵囊的检测阈值分别达到1个拷贝和10个卵囊,奶牛粪便阳性率为25.93%（21/81）,高于普通PCR检测率20.99%（17/80）。结论建立的Real-timePCR方法简便、快速,特异性强,敏感度高,可用于微小隐孢子虫的快速定量检测。     

提纯小管福寿螺DNA6种方法的比较研究

目的以不同方法提纯小管福寿螺DNA,用PCR检测以比较其效果。方法将80只野外采集的小管福寿螺分8组,取出肺囊并剪碎后分别用QIAGEN、天根、OMEGA的基因组DNA抽提试剂盒,及异硫酸氰胍抽提法、树脂抽提法和树脂-二氧化硅抽提法提纯小管福寿螺基因组DNA,用PCR扩增福寿螺16s rDNA,测定目的条带相对浓度以评价各方法的抽提效果。结果各种方法提纯的基因组DNA均能用PCR扩增方法扩增出目的条带,但目的条带浓度有一定差异。其中,QIAGEN公司和OMEGA公司的抽提试剂盒、树脂抽提法和树脂-二氧化硅抽提法提纯的模板PCR扩增量较高,与其余4种抽提方法比较有统计学意义。试剂盒抽提法的单价成本是手工抽提法的8.4～57.1倍。结论QIAGEN和OMEGA公司的基因组DNA抽提试剂盒的提纯效果好,但成本较高,适用于少量样本的抽提。树脂抽提法和树脂-二氧化硅抽提法从提纯效果、成本等方面评价,较适用于大量样本抽提处理工作。异硫酸氰胍抽提法,抽提快,成本低但所用试剂对身体有毒害,较适用于大量样本或应急样本的处理。     

安氏隐孢子虫在HCT-8和AGS细胞中增殖效果的研究

目的比较安氏隐孢子虫（Cryptosporidium andersoni）在人结肠腺癌（human ileocecal adenocarcinoma,HCT-8）细胞和人胃腺癌（humanstomachadenocarcinoma,AGS）细胞中的增殖。方法取培养至对数生长期的HCT-8细胞和AGS细胞,接种于6孔培养板中,待细胞生长融合至60％～70％时,加入2．5×10^5个安氏隐孢子虫卵囊,培养至24h和48h,以Giemsa染色法和Real—time PCR技术检测虫体在细胞中的增殖。结果Giemsa染色法观察24h和48h HCT-8细胞中虫体数量均高于ACTS细胞（P〈0.05）。Real—time PCR技术测得24h和48h HCT-8细胞中安氏隐孢子虫卵囊COWP基因拷贝数均高于AGS细胞（P〈0.05）。结论与AGS细胞相比,以HCT-8细胞作为体外感染模型更利于安氏隐孢子虫的增殖。     

牛源隐孢子虫上海分离株的巢式PCR鉴定

目的 用巢式PCR鉴定1株自然感染的上海牛源隐孢子虫。 方法 改良抗酸染色法检查含隐孢子虫卵囊的牛粪,油镜下观察卵囊形态,测量大小。以牛粪中的隐孢子虫卵囊DNA为模板,根据隐孢子虫18S rRNA序列设计2对引物,巢式PCR扩增目的片段,测序,同源性比对,并运用MEGA4.0软件构建系统发育树。 结果 上海牛源隐孢子虫分离株卵囊呈圆形或椭圆形,大小为（5.6±0.49）mm×（5.2±0.51）mm。扩增出的18S rRNA基因片段为812 bp。上海牛源隐孢子虫分离株的18S rRNA与巴西的牛隐孢子虫（Cryptospridium bovis,GenＢank登录号为151935628）序列一致性为100%,两者在种系发育树上为同一分支,亲缘关系最近;与中国青海、蒙古国、美国、突尼斯等地的牛隐孢子虫序列一致性均为99%。 结论 上海牛源隐孢子虫分离株为牛隐孢子虫（C. bovis）。     

微小隐孢子虫cDNA文库的构建及P23、CP15/60基因的克隆

目的　微小隐孢子虫地方株cDNA文库构建及P2 3、CP15 60基因的克隆。　方法　提取微小隐孢子虫总RNA、mRNA ,逆转录合成cDNA。将cDNA与 pUC18DNA连接 ,导入DH5α宿主细胞中生成cDNA文库。根据文献分别设计并合成两对PCR引物 ,从上述文库中筛选保护性基因 ,对PCR产物克隆、测序。　结果　文库容量为 1.9× 10 6个重组子 ,文库中cDNA插入片段大小介于 0 .4× 10 3～ 6.5× 10 3bp。从该文库中克隆出编码 2 3kDa、15 60kDa子孢子表面蛋白的核苷酸序列。　结论　成功地用 pUC18质粒载体构建了C .parvumcDNA文库。     

Simple method for long-term copro-preservation of Cryptosporidium oocysts for morphometric and molecular analysis

Preservation of Cryptosporidium oocysts in faecal specimens containing 75% ethanol is suitable for subsequent morphometric and molecular analysis. No significant morphologic alteration occurred after storage at ambient temperatures, ranging from 22 to 38 degrees C, for more than 2 years. After washing, sugar floatation and DNA extraction, a nested polymerase chain reaction targeting the small subunit ribosomal RNA gene successfully amplified Cryptosporidium DNA in all 15 isolates examined. The sensitivity of detection by polymerase chain reaction (PCR) was found to be as high as 1.25 oocysts per reaction (mean=3.01, SD=1.14). Importantly, a 2.2-kb of the complete DNA sequence of a gene encoding Cryptosporidium thrombospondin-related adhesive protein (TRAP-C1) was also consistently amplified by PCR in all isolates. The PCR-amplified product can be used as a good template for sequencing. Therefore, this simple procedure should be useful for epidemiological analysis of clinical samples from outbreaks, endemic or sporadic cases of cryptosporidiosis when long-term storage of oocysts is required.     

牦牛隐孢子虫感染调查

为了解牦牛隐孢子虫的感染情况,作者对上海动物园的6份成年牦牛粪便样品和来自青海的396份犊牦牛粪便样品进行隐孢子虫卵囊的检查。饱和蔗糖溶液漂浮法和改良抗酸染色法检测隐孢子虫卵囊。402份样品中,42份阳性,感染率为10．4％。采用饱和蔗糖溶液漂浮法检测：感染率为3．2％（13／402）;应用改良抗酸染色法检测：感染率为10．4％（42／402）。成年牦牛无感染,而犊牦牛的感染率为10．6％（42／396）。调查发现犊牦牛感染隐孢子虫的较严重,成年牛均阴性。