B7-1转基因骨肉瘤疫苗的制备及鉴定

目的构建含B7—1基因与绿色荧光蛋白（GFP）基因的融合表达载体，转染LM8骨肉瘤细胞制备骨肉瘤疫苗。方法用RT—PCR法扩增B7—1基因片断，应用含GFP基因的真核表达质粒构建融合表达载体，酶切、测序鉴定构建质粒；采用脂质体介导方法将其转染到LM8细胞，并用荧光显微镜及LCM结合蛋白免疫印记检测其在肿瘤疫苗细胞中的表达。结果经PCR及酶切鉴定，证实成功构建了含B7—1基因的真核表达重组体pEGFP—C1／B7，重组子测序结果与国际基因文库中mB7—1序列相符。用荧光显微镜观察到疫苗细胞中有GFP表达，RT—PCR检测到疫苗细胞中B7—1基因的表达．westernblot发现疫苗细胞中有B7蛋白的表达。结论B7—1重组真核绿色荧光表达载体pEGFP—C1／B7已成功构建，转染，LM8细胞成功制备了骨肉瘤细胞疫苗。     

弓形虫致密颗粒蛋白GRA2真核表达质粒的构建与体外表达

目的构建弓形虫致密颗粒蛋白GRA2的真核表达重组质粒。方法设计合成GRA2引物，运用PCR方法扩增其基因片段，经克隆至pMDl8-T载体后，亚克隆至真核表达质粒pcDNA3．1（-）而构建重组表达质粒pcDNA3．1-GRA2。脂质体法将构建的重组质粒转染HFF细胞，RT—PCR法检测转染细胞中GRA2的表达情况。结果PCR扩增GRA2基因序列正确，构建的重组表达质粒pcDNA3．1-GRA2经PCR、EcoRⅠ／HindⅢ双酶切和测序鉴定正确；转染GRA2基因的细胞，RT—PCR可见目的条带。结论成功获得真核表达重组质粒pcDNA3．1-GRA2，为进一步研究弓形虫疫苗的免疫保护性奠定基础。     

人SCL基因pDC315-EGFP真核表达载体的构建及意义

目的构建含有人SCL基因的pDC315-EGFP真核表达载体,为糖尿病膀胱病变（DCP）的治疗提供新思路。方法从含有人SCL基因的质粒中,采用PCR方法扩增SCL基因,将目的载体pDC315-EGFP进行酶切后交换,其产物转化细菌感受态细胞,对克隆产物进行菌落PCR鉴定,对阳性克隆产物进行测序和比对分析,比对正确的克隆即为构建成功的质粒。结果 PCR扩增的基因片段长度为1 036 bp,测序结果以及重组质粒pDC315-EGFP-SCL阳性克隆凝胶电泳鉴定均证明SCL基因成功克隆到真核表达载体中。结论成功构建了真核表达载体pDC315-EGFP-SCL,该载体有望用于DCP的治疗。     

淡色库蚊抗药性相关胰蛋白酶基因稳定转染细胞系的建立与表达鉴定

目的为进一步研究胰蛋白酶基因与抗药性的关系。方法采用PCR方法，以淡色库蚊抗性品系cDNA文库为模板，扩增出抗药性品系高表达的胰蛋白酶(trypsin)基因编码区。T／A克隆测序鉴定后，亚克隆到昆虫细胞表达载体piE1—3。构建重组昆虫细胞表达载体piE1—3／tw。经酶切和PCR鉴定后，与带有筛选标记的piE1-neo质粒共转染蚊虫细胞C6／36。通过G418选择培养，建立稳定转染细胞。用RT—PCR、Western blotting鉴定胰蛋白酶基因的转录表达。结果酶切和PCR鉴定表明，成功构建昆虫细胞表达载体piE1-3／try；证实胰蛋白酶基因已转入C6／36细胞，并建立稳定转染细胞系，成功地表达目的基因。结论稳定转染细胞系的建立和基因表达为进一步研究胰蛋白酶与抗药性的关系提供了良好的实验基础。     

hTERT启动子调控下PE38KDEL表达载体的构建及其在MiaPaCa2人胰腺癌细胞中的表达

目的探讨端粒酶逆转录酶（hTERT）启动子调控铜绿假单胞菌外毒素衍生物（PE38KDEL）表达载体的构建及其在MiaPaCa2人胰腺癌细胞中的表达。方法通过PCR法扩增hTERT启动子,全基因合成PE38KDEL,将其分别亚克隆到pIRES2-EGFP及phTERTp-IRES2-EGFP质粒的多克隆位点中;均经酶切及测序鉴定。通过脂质体法将两质粒分别转染MiaPaCa2及WI-38细胞,观察荧光表达情况,通过RT-PCR检测PE38KDEL的表达。结果经酶切及测序鉴定证实质粒构建成功,pPE38KDEL-IRKS2-EGFP转染后MiaPaCa2和WI-38细胞中均有PE38KDEL基因表达;但phTERTp—PE38KDEL-IRES2-EGFP转染后仅MiaPaCa2中有PE38KDEL基因表达。结论hTERT调控下PE38KDEL表达载体构建成功,并可在MiaPaCa2人胰腺癌细胞中靶向性表达,为探讨胰腺癌的靶向基因治疗提供了实验依据。     

真核绿色荧光蛋白表达载体pEGFP—C3-MAGE-12的构建与表达

目的构建黑色素瘤抗原基因-12（MAGE-12）绿色荧光蛋白表达载体pEGFP—C3-MAGE—12，并在真核细胞中表达。方法于2005—10～2005—12对郑州大学第一附属医院应用RT—PCR方法．从人肺癌组织中扩增出MAGE-12cDNA基因片段，经过酶切鉴定后，克隆至质粒载体（pGEM—Teasy），测序证实碱基序列无误后，再克隆至真核绿色荧光蛋白表达载体（pEGFP—C3）上，并转染真核细胞，观察其在真核细胞中表达。结果经酶切及基因序列分析验证，PCR扩增出944bp的MAGE-12基因并成功构建了真核绿色荧光蛋白表达载体pEGFP—C3-MAGE-12，该重组载体能够在真核细胞中广泛表达。结论成功构建真核绿色荧光蛋白表达载体pEGFP—C3-MAGE-12，为建立肿瘤细胞疫苗打下基础。     

日本血吸虫Sj14FABP与细胞因子IL-12重组质粒的构建和表达

目的构建日本血吸虫14kDa脂肪酸结合蛋白(Sj14FABP)和细胞因子IL-12共表达质粒，并观察其能否在小鼠体内获得表达。方法TRIzol试剂提取日本血吸虫成虫总RNA，采用RT—PCR方法逆转录Sj14FABP编码基因序列，经过双酶切后定向克隆到载体pVIVO2-IL12中，通过PCR、酶切及测序进行鉴定。大量制备重组质粒pVIVO2-IL12-Sj14FABP并免疫BALB/c小鼠，取注射部位肌肉组织进行间接免疫荧光试验。结果RT-PCR扩增出一条大小为440bp的片段；经PCR、酶切及测序鉴定表明所构建的重组质粒中含有Sj14FABP基因；间接免疫荧光试验结果为阳性。结论本试验成功构建重组质粒pVIVO2-IL12-Sj14FABP，并在小鼠体内获得表达。     

弓形虫表面抗原SAG1 DNA疫苗的构建

目的 构建真核重组表达质粒pVAX1-SAG1，并探讨其诱导的体液免疫应答。方法 采用多聚酶链反应技术，从弓形虫RH株基因组DNA中扩增截短型的SAG1基因片断，并克隆至载体pMD18-T，经菌落PCR鉴定和测序分析后，亚克隆至真核表达载体pVAXI，构建重组真核表达质粒pVAX1—SAG1，并予菌落PCR和双酶切鉴定。以此为疫苗候选分子免疫小鼠，检测其诱导产生的抗体。结果 PCR扩增出SAG1基因的截短型片段，其大小约780bp；测序的阳性TA克隆除两处发生同义突变外，其余序列与原序列一致；TA克隆的插入片段被亚克隆到真核表达载体pVAX1，构建了重组表达质粒pVAX1-SAG1；该质粒诱导小鼠产生了抗弓形虫抗原的抗体。结论 成功构建了弓形虫表面抗原SAG1的DNA疫苗。     

人Hepsin基因表达型载体的构建及鉴定

应用RT-PCR方法从人前列腺癌细胞系LNcaP中克隆Hepsin基因全编码序列，并将其克隆入pIRES2-EGFP表达型质粒，应用酶切和测序方法对重组质粒进行鉴定。结果成功克隆人Hepsin基因cDNA序列并构建了重组表达载体。认为含人Hepsin基因表达型载体的构建为Hepsin基因在前列腺癌中的功能研究提供了实验基础。     

hIL-10基因修饰的L02肝细胞的克隆培养和最高表达株的筛选

目的:确认hIL-10基因修饰的L02肝细胞的克隆培养可实现hIL-10在L02肝细胞中的高效表达．方法:通过构建真核质粒表达载体pchIL-10, 并纯化后转染L02肝细胞．通过G418的压力选择获得hIL-10高表达的克隆株,并以ELISA测定其表达水平．结果:经过测序和酶切验证,真核质粒表达载体pchIL-10构建成功．电泳显示一长约540 bp 条带．hIL-10基因转导可在L02肝细胞中实现 hIL-10的高效表达．最高表达株表达量为每小时69．875 ng/106细胞．结论:hIL-10基因修饰的L02肝细胞的克隆培养可实现hIL-10的高效表达,为抗肝纤维化、肝硬化提供有效途径．     

人遗传印记基因PEG10重组真核表达质粒的构建及其在转染细胞株中的表达

目的构建人遗传印记基因PEG10的全长表达基因质粒,观察PEG10的过表达对人正常肝细胞及其非肝脏来源的对照细胞的作用。方法将PEG10基因全长cDNA直接连入真核细胞表达质粒pcDNA3．1hisC中,以脂质体介导的方法将该表达质粒pcDNA3．1hisC-PEG10转染入人正常肝细胞及其对照细胞,采用RT-PCR、Western blot、MTT、TUNEL等方法分析PEG10基因在正常人肝细胞及其对照细胞中的表达和功能。结果限制性酶切及DNA测序结果均说明所构建质粒为PEG 10全长表达质粒。该质粒经过稳定筛选后稳定表达于细胞内,促进人肝细胞的生长,抑制其凋亡,但对非肝脏来源的对照组细胞没有明显影响。结论PEG10全长表达质粒的构建为进一步研究PEG10基因的效应和机制提供了有利的工具,研究结果显示PEG10基因可以促进人正常胚肝细胞增殖并抑制其凋亡,但对非肝脏来源的对照组细胞人胚肾细胞株293细胞没有明显效应。     

结核分枝杆菌复苏因子E的真核表达及鉴定

目的 构建结核分枝杆菌复苏因子E基因的真核表达质粒.方法 PCR扩增结核分枝杆菌复苏因子E基因片段.将片段克隆至PcDNA 3.1(一)载体,重组质粒测序正确后,转染至CHO细胞中,表达复苏因子E蛋白质.RT-PCR检测克隆基因mRNA在真核细胞中的表达,收集并纯化表达的蛋白质,SDS-PAGE分析和Western blot分析检测目的 蛋白的表达,淋巴细胞增殖实验(CCK-8)鉴定表达蛋白的免疫原性.结果 成功构建了结核分枝杆菌复苏因子E基因的真核表达质粒.RT-PCR证实克隆基因mRNA在真核细胞中表达,SDS-PAGE分析和Western blot分析均证实目的 蛋白在真核细胞中成功表达,淋巴细胞增殖实验(CCK-8)进一步证实了表达蛋白具有免疫原性.结论 我们成功构建了复苏因子E真核表达系统.     

E2F-1真核表达载体的构建和Genectin抗性细胞的筛选

目的通过构建含E2F-1基因的真核表达载体,转染胃癌细胞MGC-803,获得Genectin抗性的稳定过表达E2F-1的胃癌细胞株。方法 PCR扩增E2F-1基因片段,经限制性内切酶EcoRⅠ和HindⅢ双酶切后将E2F-1定向克隆到真核表达载体pCMV-HA2中转化筛选。用脂质体Lipofectamine 2000将该载体转染MGC-803胃癌细胞,然后用含G418的培养基筛选获得具Genectin抗性的过表达E2F-1的胃癌细胞株。RT-PCR和Western blot技术检测MGC-803/E2F-1细胞内E2F-1表达情况。结果重组载体pCMV-E2F-1-HA2经EcoRⅠ和HindⅢ双酶切后得到预期片段,测序结果与报道的E2F-1基因完全一致。获取具Genectin抗性的细胞克隆,并进行了扩增。RT-PCR和Western blot证实重组载体pCMV-E2F-1-HA2成功转入胃癌细胞内,并稳定过表达E2F-1。结论成功获取具Genectin抗性的稳定过表达E2F-1的胃癌细胞株,为下一步的功能实验奠定了基础。     

小鼠烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶1基因的克隆与表达检测

目的 检测真核表达克隆pcDNA3.1烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶1(NMNAT1)的水平和有效性.方法 采用PCR的方法钓取小鼠源NMNAT1基因的cds全长片段,构建到T载体中,并转接到pcDNA3.1中;同时设计引物进行全基因测序;采用常规的脂质体转染方法转染入Hela细胞系中表达小鼠源NMNAT1基因,通过qPCR和Western blot的方法检测克隆pcDNA3.1-NMNAT1的表达水平和表达有效性,并同时建立小鼠源NMNAT1基因的qPCR和Western blot检测方法.结果 成功钓取了小鼠源NMNAT1基因,测序结果显示与数据库序列完全匹配,pcDNA3.1-NMNAT1通过脂质体转染入Hela细胞系,48 h以后收取细胞,经过反转录以后进行qPCR检测和Western blot检测,结果显示表达克隆pCDNA3.1-NMNAT1能同时在mRNA水平和蛋白水平高表达小鼠NMNAT1基因.结论 成功从小鼠脑cDNA文库中克隆了NMNAT1基因的全长cDNA,与Pubmed序列完全一致,并构建到真核表达载体上正确表达NMNAT1蛋白质.     

HSP70-GST融合蛋白表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达

目的构建小鼠热休克蛋白70(HSP70)重组原核表达质粒,获取小鼠HSP70-GST融合蛋白。方法先用RT-PCR方法从小鼠脑基因组中扩增出HSP70基因cDNA序列,应用T-A克隆技术,克隆到质粒pMD—Tvector,经DNA测序证实基因碱基无误后,亚克隆到原核表达质粒pGEX-4T-1 中进行表达。结果表达产物经Western Blot分析,在109 KD处有一明显特异带,与预期结果相符。结论构建重组融合表达载体pGEX—HSP70,用基因工程的方法在原核细胞中成功表达出小鼠 HSP70-GST融合蛋白。     

胱抑素C基因真核表达载体的构建及在转染的人主动脉平滑肌细胞中的表达

目的克隆人胱抑素C基因及构建胱抑素C基因真核表达载体并研究其在人血管平滑肌细胞中的表达。方法培养人脐静脉内皮细胞系,并从中提取总RNA,采用逆转录聚合酶链反应扩增胱抑素C基因,构建其真核表达载体,双酶切及聚合酶链反应鉴定阳性克隆,转染人血管平滑肌细胞,逆转录聚合酶链反应及Western blot法检测其表达情况。结果成功克隆人胱抑素C基因及构建其真核表达载体,转染后成功高表达。结论克隆人胱抑素C基因及构建其真核表达载体成功,转染人血管平滑肌细胞获得其高表达。     

Pim-3慢病毒质粒构建及其表达鉴定

目的 构建Pim-3慢病毒质粒,鉴定其在卵巢癌SKOV3细胞中基因及蛋白水平的表达.方法 RT-PCR法提取Pim-3 cDNA,经T-A克隆及双酶切将其与慢病毒表达载体pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP重组;酶切鉴定及基因测序后,将阳性重组质粒导入病毒包装细胞293T中;收集病毒上清液转染SKOV3细胞,荧光显微镜下观察转染情况,应用RT-PCR及Western blot法分别检测Pim-3 mRNA及其蛋白.结果 RT-PCR法获得Pim-3基因,重组质粒酶切后片段大小及基因测序结果显示pCDH/Pim-3重组质粒构建成功.将感染重组质粒及空载体的293T细胞生产的病毒上清分别感染SKOV3细胞,感染重组质粒的SKOV3细胞中Pim-3 mRNA及蛋白表达水平均高于空载体细胞.结论 成功构建了pCDH/Pim-3重组慢病毒质粒,建立了Pim-3高表达SKOV3瞬转细胞模型,为探讨Pim-3在卵巢癌发生、发展中的作用及机制奠定实验基础.     

人瘦素的基因克隆及其在COS-7细胞中的表达

目的 构建重组人瘦素哺乳细胞表达载体并在COS-7细胞表达重组人瘦素。方法 提取脂肪细胞总RNA，用RT-PCR扩增人瘦素cDNA并克隆至载体pUCm-T，并对克隆基因进行DNA序列分析。以克隆的人瘦素cDNA为模板，用特异引物扩增瘦素基因，经KpnI和BamH I酶切，插入相应酶切的哺乳细胞表达载体pcDNA3，构建重组哺乳细胞表达载体并转染COS-7细胞，RT-PCR和Western印迹检测其在COS-7细胞中的表达。结果 RT-PCR扩增的DNA片断和预期的人瘦素cDNA大小一致；序列分析显示，克隆的基因序列和文献报道的人瘦素基因序列一致；经RT-PCR和Western印迹鉴定，转染的COS-7细胞可表达、分泌人瘦素。结论 构建了人瘦素的哺乳动物细胞表达载体，并成功地在COS-7细胞中获得重组人瘦素的分泌表达。     

杜氏利什曼原虫四川分离株无鞭毛体蛋白基因的克隆及真核表达

目的克隆、真核表达杜氏利什曼原虫四川株的无鞭毛体蛋白(amastin)编码基因。方法PCR扩增杜氏利什曼原虫四川汶川人株L．d．SC10H2与四川南坪犬株L．d．SC7的无鞭毛体蛋白基因,将该基因导入pcDNA3．1( ),构建真核表达重组质牲,转染NIH3T3细胞,采用免疫荧光法鉴定重组质粒的瞬时表达;RT-PCR和Western blotting鉴定稳定表达,结果2株杜氏利什曼原虫均扩增出552 bp的无鞭毛体蛋白基因。同源性为86％。转染后在NIH3T3细胞膜和细胞内观察到较强的绿色荧光,表明无鞭毛体蛋白基因在NIH3T3细胞中获得短暂表达。细胞裂解产物经Western blotting,在相对分子质量(Mr)约20000处检测到阳性杂交信号,表明无鞭毛体蛋白基因在NIH3T3细胞内获得了稳定表达。结论获得了我国杜氏利什曼原虫四川分离株L．d．SC10H2和L．d．SC7的无鞭毛体蛋白基因序列,并在NIH3T3细胞中稳定表达。     

杜氏利什曼原虫四川分离株无鞭毛体蛋白基因的克隆及真核表达

目的 克隆、真核表达杜氏利什曼原虫四川株的无鞭毛体蛋白（amastin）编码基因。 方法 PCR扩增杜氏利什曼原虫四川汶川人株L.d.SC10H2与四川南坪犬株L.d.SC7的无鞭毛体蛋白基因，将该基因导入pcDNA3.1（+），构建真核表达重组质粒，转染NIH3T3细胞，采用免疫荧光法鉴定重组质粒的瞬时表达；RT-PCR和Western blotting鉴定稳定表达。 结果 2株杜氏利什曼原虫均扩增出552 bp的无鞭毛体蛋白基因，同源性为86％。转染后在NIH3T3细胞膜和细胞内观察到较强的绿色荧光，表明无鞭毛体蛋白基因在NIH3T3细胞中获得短暂表达。细胞裂解产物经Western blotting，在相对分子质量（Mr）约20 000处检测到阳性杂交信号，表明无鞭毛体蛋白基因在NIH3T3细胞内获得了稳定表达。 结论 获得了我国杜氏利什曼原虫四川分离株L.d.SC10H2和L.d.SC7的无鞭毛体蛋白基因序列，并在NIH3T3细胞中稳定表达。