幽门螺杆菌1pp20基因的克隆与表达

目的 克隆及表达幽门螺杆菌（Helicobacter pylori)lpp20基因，为探索高效的防治幽门螺杆菌感染的疫苗抗原和诊断抗原奠定基础。方法 用PCR方法从幽门螺杆菌的染色体DNA上扩增出lpp20基因片段，将目的基因插入的表达载体pMAL-C2X中，用重组质粒转化大肠杆菌（E.coli TB1），并在E.coli TB1中进行表达。用SDS-PAGE方法对表达产物进行分析。结果 用PCR方法扩增的lpp20基因长度约为540bp；经酶切、PCR和测序分析，插入到载体的基因片段与文献报道的基因序列一致；SDS-PAGE的结果显示，目的基因表达产物的相对分子质量为18kDa，融合蛋白的表达量占全菌总蛋白的34%。结论 本研究中构建的pAML-C2X与lpp20基因重组质粒在E.coli TB1中能够高效表达目的基因。该重组子的构建为幽门螺杆菌lpp20基因的研究建立了重要的基础。     

幽门螺杆菌lpp20基因与麦芽糖结合蛋白基因的融合表达与纯化

目的 研究幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，H．pylori)lpp20基因与麦芽糖结合蛋白基因的融合表达产物的纯化方法，为幽门螺杆菌基因工程疫苗的制备建立基础。方法 采用本研究室分离的HpMEL-HP27菌株提取染色体DNA，用PCR方法从HP染色体DNA上扩增出lpp20基因片段，将目的基因插人到表达载体pMAL-c2X中，用重组质粒转化大肠杆菌(E．coil TB1)。采用IPTG进行诱导表达。用多糖树脂(amylose resin)作为填充料，制备层析柱，将可溶性菌体蛋白进行亲和层析。应用SDS-PAGE方法对纯化产物进行分析。结果 融合蛋白的分子量约为60kDa，融合蛋白的表达量约占全菌总蛋白的34％；纯化后的融合蛋白纯度达90％以上。结论 与麦芽糖结合蛋白基因融合的lpp20基因在E．coli TB1中能够高效表达；用多糖树脂作为填充料，进行亲和层析的方法，具有良好的纯化效果。     

幽门螺杆菌金属蛋白酶原核表达载体的构建与重组表达及纯化北大核心CSCD

目的构建幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, Hp)金属蛋白酶(metalloprotease, Mtp)基因mtp与麦芽糖结合蛋白基因mbp融合表达载体,诱导Mtp重组表达并纯化表达产物,为Hp致病机制和疫苗研究奠定基础。方法应用PCR从Hp郑州分离株MEL-Hp27的DNA扩增mtp基因,经纯化回收后与克隆载体pMD19-T连接,并进行测序验证。对重组质粒pMD19-T-mtp双酶切,酶切目的片段克隆至表达载体pMAL-c2X,然后用重组质粒pMAL-mtp转化大肠埃希菌(E.coli TB1)。从大肠埃希菌重组子中提取重组质粒,进行酶切和测序鉴定。用分光光度计测定重组菌的生长曲线。用IPTG诱导mtp表达,用SDS-PAGE法分析表达产物,并用Amylose树脂预装柱纯化Mtp蛋白。结果 PCR扩增的mtp基因片段长度为621 bp,重组菌株的酶切和测序鉴定正确;重组菌生长曲线显示重组质粒的转入对受体菌的生长无显著影响;Mtp诱导表达和纯化产物的SDS-PAGE显示,Mtp表达产物为相对分子质量为66.4×10^3的水溶性融合蛋白(rMtp),纯化产物的纯度约为85.6%。结论成功构建mtp基因与麦芽糖结合蛋白mbp基合表达载体,并纯化制备了重组蛋白,为探索Mtp在Hp感染发病机制和抗Hp感染疫苗研究奠定了基础。     

幽门螺杆菌金属蛋白酶原核表达载体的构建与重组表达及纯化

目的构建幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, Hp)金属蛋白酶(metalloprotease, Mtp)基因mtp与麦芽糖结合蛋白基因mbp融合表达载体,诱导Mtp重组表达并纯化表达产物,为Hp致病机制和疫苗研究奠定基础。方法应用PCR从Hp郑州分离株MEL-Hp27的DNA扩增mtp基因,经纯化回收后与克隆载体pMD19-T连接,并进行测序验证。对重组质粒pMD19-T-mtp双酶切,酶切目的片段克隆至表达载体pMAL-c2X,然后用重组质粒pMAL-mtp转化大肠埃希菌(E.coli TB1)。从大肠埃希菌重组子中提取重组质粒,进行酶切和测序鉴定。用分光光度计测定重组菌的生长曲线。用IPTG诱导mtp表达,用SDS-PAGE法分析表达产物,并用Amylose树脂预装柱纯化Mtp蛋白。结果 PCR扩增的mtp基因片段长度为621 bp,重组菌株的酶切和测序鉴定正确;重组菌生长曲线显示重组质粒的转入对受体菌的生长无显著影响;Mtp诱导表达和纯化产物的SDS-PAGE显示,Mtp表达产物为相对分子质量为66.4×10~3的水溶性融合蛋白(rMtp),纯化产物的纯度约为85.6%。结论成功构建mtp基因与麦芽糖结合蛋白mbp基合表达载体,并纯化制备了重组蛋白,为探索Mtp在Hp感染发病机制和抗Hp感染疫苗研究奠定了基础。     

弓形虫RH株致密颗粒蛋白GRA4基因的克隆与表达

目的 克隆和表达弓形虫RH株致密颗粒蛋白GRA4基因。方法 根据GRA4基因序列,设计合成一对引物,用聚合酶链式反应(PCR)方法从弓形虫RH株基因组DNA中扩增GRA4基因片段,插入pMD18-T载体,并转化大肠杆菌JM109,经PCR、双酶切、测序验证后,将GRA4基因片段定向亚克隆到载体pGEX-4T-2中构建原核表达重组质粒pGEX-4T-2.GRA4,重组子在E.coli BL21中经IPTG诱导表达,并对表达产物进行SDS-PAGE及Westem blot分析。结果 从弓形虫RH株基因组DNA中扩增出GRA4基因片段并诱导表达出能被兔抗弓形虫血清识别的重组GRA4蛋白。结论 成功构建和表达了弓形虫pGEX-4T-2-GRA4重组质粒,为弓形虫病诊断抗原和疫苗的研究奠定了基础。     

幽门螺杆菌基因hpaA克隆、融合表达和鉴定

目的克隆幽门螺杆菌粘附素基因hpaA,构建幽门螺杆菌hpaA基因与麦芽糖结合蛋白基因融合表达载体,并进行诱导表达,鉴定融合蛋白免疫原性,为幽门螺杆菌疫苗研究提供依据。方法利用PCR技术从H.pylori郑州分离株MEL-HP27染色体DNA上扩增出hpaA基因,序列分析后,将其克隆到表达载体pMAL-c2X中,转化大肠杆菌(E.coliTB1),用IPTG诱导目的基因表达,SDS-PAGE方法对表达产物进行分析,Western blot鉴定其免疫原性。结果用PCR方法扩增的hpaA基因长度为783bp,编码260个氨基酸,经酶切鉴定和测序,插入到克隆载体的基因片段与预期目的DNA片段相一致;SDS-PAGE结果显示表达产物相对分子质量约为29kDa,融合蛋白的表达量约占全菌总蛋白的26%。结论本研究成功构建了hpaA基因与麦芽糖结合蛋白基因融合原核表达系统,为幽门螺杆菌基因工程组分疫苗的研究奠定基础。     

幽门螺杆菌外膜蛋白18的克隆表达及纯化研究

目的克隆表达幽门螺杆菌（HP）外膜蛋白,为HP的疫苗开发及诊断试剂盒的研究奠定基础。方法用PCR方法从HP临床分离株9806的染色体DNA中扩增出OMP18基因片段,将目的基因插入表达载体pQE30中,重组载体pQE30-OMP18经DNA测序鉴定后,将重组质粒转化大肠杆菌E．coli．M15,IPTG诱导表达。采用镍离子亲和层析纯化蛋白,并用SDS-PAGE和Western blot分析鉴定其表达。结果PCR扩增出长度为537bp的OMP18基因,片段测序分析其与Gen—Bank公布的核苷酸序列相似性达99％;SDS—PAGE显示,重组工程菌经IPTG诱导表达了分子量为20．0kDa的目的蛋白,占总蛋白的20％,经纯化后,目的蛋白纯度达85％以上;Western blot结果表明,该蛋白可与兔抗HP的多克隆抗血清发生特异的抗原抗体结合反应。结论成功构建了OMP18表达载体pQE30-OMP18,并在大肠杆菌中获得高效表达,为HP疫苗有效抗原筛选及诊断试剂的开发奠定基础。     

鼠疫耶尔森氏菌caf1和pH6基因的原核表达

目的利用DNA重组技术,在大肠杆菌中获得融合表达的鼠疫耶尔森氏菌caf1及p H6抗原基因。方法利用分子克隆技术克隆后,在原核系统中表达鼠疫菌重要功能蛋白caf1及p H6蛋白,根据云南玉龙菌株(D106004)全基因组序列设计引物,PCR扩增目的基因片段;采用p ET-32a(+)作为表达载体,通过双酶切和连接反应,将目的基因片段定向插入载体中,构建重组表达质粒;IPTG诱导,使重组质粒在其宿主菌E.coli BL21(DE3)中表达。结果根据酶切鉴定和PCR产物测序结果显示,目的基因caf1及p H6已成功连接到表达载体p ET-32a(+)上,SDS-PAGE结果显示表达产物的相对分子质量约为34.2 ku和35.5 ku,与理论分子量一致。结论成功克隆并构建了p ET32a-caf1及p ET32a-p H6重组基因原核表达系统,为鼠疫潜在诊断靶点及新型疫苗选择的可能性奠定了基础。     

恙虫病东方体sta56部分基因的克隆和表达

目的 构建恙虫病东方体sta56基因的重组表达质粒,并在E.coli中表达Sta56重组抗原。方法 从恙虫病东方体Karp株基因组中扩增出sta56基因的ORF及其中长1053bp的大片段,用TA克隆技术将此大片段克隆,并以重组质粒为模板,扩增编码Sta56抗原亲水氨基酸区的一段长342bp的DNA,插入pProEX HTb载体,转化大肠杆菌DH5a,IPTG诱导表达,用SDS-PAGE及Western blot进行分析。结果 从恙虫病东方体基因组中扩增出sta56基因的ORF,以截短片段构建了重组表达质粒pHTbOt342,SDS-PAGE显示蛋白表达带的分子量约为15.4kDa,Western blot证实该融合蛋白能被恙虫病患者阳性血清所识别。结论 在大肠杆菌中表达的Sta56重组蛋白具有免疫反应性。     

幽门螺杆菌融合蛋白HspA-UreB在大肠杆菌中的表达与鉴定

目的在大肠杆菌中表达幽门螺杆菌(简称Hp)HspA-UreB融合蛋白,并探索其免疫反应性,为Hp基因工程疫苗的研制奠定基础。方法用PCR方法扩增郑州分离Hp菌株MEL-HP27的hspA和ureB基因,分别克隆入pNEB193中。测序后,回收两种基因片段,并以hspA-ureB的顺序连接插入原核表达载体pMAL-C2x进行融合表达。采用蛋白印迹法对表达产物进行鉴定。结果特异PCR法和酶切鉴定证实融合基因hspA-ureB克隆入表达载体中;重组质粒转化大肠杆菌TB1后,经IPTG诱导3h,SDS-PAGE电泳显示在119kDa处出现一条特异蛋白带,即麦芽糖结合蛋白(MBP)与HspA-UreB的融合表达形式,约占细菌总体蛋白含量的31%;该融合蛋白与Hp免疫小鼠血清和Hp阳性病人血清的Westernblot分析结果显示,在119kDa处出现特异杂交带。结论成功地在大肠杆菌中实现了Hp融合蛋白HspA-UreB的高效表达,并证实其具有良好的免疫反应性。     

State of knowledge of helminth fauna of freshwater fishes of Poland

A total 89 fish and lamprey species has been recorded from Polish freshwater habitats. Twenty-seven of them (30.3%) have not been surveyed for parasitic helminthes. Some of the latter fishes are either rare or not easily accessible. Other live only in specific habitats in scattered localities. An important obstacle for studying parasite faunas of some fishes may be their status on an endangered species. Among the non-surveyed fishes, are those which have been relatively recently introduced to Poland or migrated there on their own. The present paper attempts to review all hitherto not studied helminthologically fish species, their habitats, localities and current protection status.