云南省盈江县中缅边境恶性疟原虫对氯喹、哌喹体外敏感性研究

目的监测云南省盈江县中缅边境恶性疟原虫对氯喹、哌喹的体外敏感性,了解两种抗疟药有无交叉耐药。方法选取2007~2009年当地病人体内的恶性疟原虫,体外培养成活共28株,在体外进行对氯喹、哌喹的半效抑虫浓度(IC_(50))值测定;并对疟原虫的Pfcrt基因片段扩增,测序,比对。结果 28株恶性疟原虫株体外氯喹的IC_(50)值为(463.9±256.0)nm;哌喹的IC_(50)值为(9.0±6.7nm)和野生株3D7相比,均有显著性差异(P0.05)。28株(100%)恶性疟原虫对氯喹均耐药株;5/28(16.1%)的疟原虫对哌喹耐药;7/28(21.4%)的疟原虫对哌喹敏感。28株(100%)疟原虫的Pfcrt基因发现均有和氯喹耐药相关的76T变异。应用Pearson线性相关分析发现CQ和PPQ间存在叉抗药性(P0.001)。结论云南省盈江县中缅边境的恶性疟原虫对氯喹、哌喹耐药的情况严峻,尤其是氯喹。     

恶性疟原虫氯喹抗性机制的研究新进展

参照恶性肿瘤多药抗性(MDR)研究模式而发现的恶性疟原虫的pfmdr1基因不能完全解释其氯喹抗性,但通过氯喹敏感株HB3与氯喹抗性株Dd2杂交而发现的和氯喹抗性有关的cg2基因结合起来,或许能对恶性疟原虫的氯喹抗性作出较为满意的解释。恶性疟原虫的氯喹敏感株可被氯喹诱导发生细胞凋亡样改变而抗性株却不能,又为恶性疟原虫的氯喹抗性机制研究提供了新思路。     

恶性疟原虫对药物的敏感性--一种体外微量测定技术

本文作者报道了测定疟原虫对药物敏感性的微量技术。试验用的恶性疟原虫为对氯喹敏感的乌干达帕洛阿尔托株(FUP)和抗氯喹的越南奥克克诺尔株(FVO)。感染夜猴后采集血样约50微升,用下述微量技术测定不同浓度的氯喹对正常的成熟滋养体发育到裂殖体的抑制程度,以判断疟原虫对氯喹的     

巴拿马夜猴体内恶性疟原虫氯喹抗性的逆转

巴拿马猫头鹰夜猴(Aotus lemurinusLemurinus)为恶性疟原虫抗氯喹株的宿主。每头夜猴经静脉接种5×10~6恶性疟原虫氯喹高抗Vietnam Smith/RE株的滋养体,原虫血症达5×10~2/mm~3时分别经灌胃给予下列几种抗药性调节剂。     

阿托喹酮抗恶性疟原虫非洲分离株及克隆的体外作用

对抗寄生虫新药阿托喹酮(Ato-vaquone,566C80)正在进行后期临床试验,以观察此药用于治疗疟疾、弓形虫病和卡氏肺孢子虫肺炎的效果。本文用同位素半微量药物敏感试验对该药的抗恶性疟原虫体外作用进行评价,并与氯喹、奎宁、甲氟喹、卤泛曲林、蒿甲醚、乙胺嘧啶和环氯胍进行比较。恶性疟原虫来源于非洲,包括直接从61位自非洲旅行回法国的无免疫力的病人血中获得的新鲜分离株以及3株保存的克隆(对氯喹敏感的L-3,L-6;对多种抗疟药有抗性的FCM-29)。以50％抑制浓度(IC_(50))表明各种药物的作用。氯喹抗性株IC_(50)与氯喹敏感株IC_(50)之比为抗性指数。     

测定抗疟药体外杀恶性疟原虫配子体作用的新方法

本文报道用最小浓度的乙胺嘧啶抑制体外培养的恶性疟原虫无性体增殖,从而获得纯配子体的方法。同时将此培养纯配子体的方法用于观察Ⅲ期配子体对氯喹、卤泛曲林、乙胺嘧啶、奎宁的敏感性。使用的恶性疟原虫为NF54株,它对氯喹、乙胺嘧啶、卤泛曲林、奎宁均敏感。以不同方法配制药液。用蒸馏水配制1×10~(-3)mol/L的氯喹,0.5%乳酸配制1×10~(-2)mol/L乙胺嘧啶,70%乙醇配制2×10~(-3)mol/L卤泛曲林,蒸馏水配制1×10~(-3)mol/L的奎宁。用RPMI 1640完全培养液按不同浓度稀释药液。     

恶性疟原虫对青蒿酯钠抗性的体外培育

恶性疟原虫FCR_3在体外采用剂量递增间隔接触方法在青篙酯钠的作用下产生了对该药的抗药性。在接触药物前,青蒿酯钠对该虫株裂殖体成熟抑制的半数抑制浓度(IC_(50))为1.6ng/ml(4.1nmol/L),经过130d间隔接触药物后,虫株对青蒿酯钠的敏感性下降,其IC_(50)值增高至约为亲代系的3倍,即4.7ng/ml(12.2nmol/L)。抗性系在去除药物作用后,其抗性水平很快下降。     

我国恶性疟原虫Pfcrt和Pfmdr1基因多态性及与氯喹敏感性关系的研究

目的了解我国恶性疟原虫分离株Pfcrt基因K76T及Pf mdr1基因N86Y和D1246Y的点突变特征及发生率,并分析上述分子标志与恶性疟原虫对氯喹敏感性的关系。方法从我国恶性疟流行区云南和海南省采集恶性疟现症患者血样,根据恶性疟原虫Pfcrt基因和Pf mdr1基因序列设计巢式PCR引物,以血样中的恶性疟原虫DNA为模板,进行巢式PCR-RFLP分析,并对部分PCR产物进行测序验证。采用世界卫生组织制定的体外微量法测定同一批血样中恶性疟原虫对氯喹的敏感性。结果云南、海南省恶性疟原虫Pfcrt基因K76T的突变发生率分别为86.7%和64.3%;云南、海南省恶性疟原虫Pf mdr1 N86Y突变发生率分别为46.5%和3.4%。未发现云南、海南省恶性疟原虫分离株存在Pf mdr1 D1246Y突变。体外微量测定法显示Pfcrt 76T突变发生率氯喹抗性株与敏感株间差异有统计学意义（χ^2=24.70,P〈0.01）。Pf mdr1 86Y突变发生率氯喹抗性株与敏感株间差异无统计学意义（χ^2=0.20,P=0.65）。结论在云南省和海南省现场未发现恶性疟原虫Pf mdr1 D1246Y点突变,抗氯喹恶性疟原虫的Pf mdr1 N86Y突变发生率与敏感株间无显著差异。Pfcrt K76T作为分子标志在我国恶性疟原虫氯喹抗性监测中具有应用价值。     

抗恶性疟原虫单克隆抗体的研究

在二次细胞融合中,经2～4次克隆后已建成28株抗恶性疟原虫(FCC-1/HN)的杂交瘤。其中针对裂殖子和成熟裂殖体抗原的McAb有9株,仅对裂殖体特异的有4株,对裂殖体和滋养体期原虫产生荧光反应的有15株。 应用间接荧光抗体技术,检查这28株McAb对7种不同疟原虫的交叉反应。结果,仅有93D4和94B5属株特异性McAb,其余各株均对恶性疟原虫(安徽株)有明显荧光反应。有5株McAb(92A3,94A2,94A6,94B3和96B5)对间日疟原虫也有交叉,而96B5株还对诺氏疟原虫和含蟹猴疟原虫产生交叉反应。     

恶性疟原虫氯喹敏感株与抗性株对青蒿素类药物体外敏感性的研究

目的 测定恶性疟原虫氯喹敏感株与抗性株对青蒿素类药物的体外敏感性. 方法 运用体外微量法与酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)测定青蒿琥酯、蒿甲醚及双氢青蒿素等3种青蒿素类抗疟药物对体外培养的恶性疟原虫氯喹敏感株与氯喹抗性株的体外敏感性,并比较两种方法测定的IC50值. 结果 体外微量法测定的3种药物对恶性疟原虫氯喹敏感株的IC50值依次为3.12 nmol/L、4.30 nmol/L、2.18 nmol/L,对恶性疟原虫氯喹抗性株的IC50值依次为4.31nmol/L、3.90 nmol/L、3.17 nmol/L;同时,将体外微量法与ELISA法所获的结果进行相关性分析,两种方法结果基本一致(r2=0.93,P＜0.001). 结论 恶性疟原虫氯喹抗性株对青蒿素类药物无明显的交叉抗性;ELISA法可用于恶性疟原虫对抗疟药物的体外敏感性检测.     

云南省恶性疟原虫抗萘酚喹株的体外培育

目的培育恶性疟原虫萘酚喹抗性虫株,为恶性疟原虫抗性的深入研究提供实验虫株。方法采用恶性疟原虫FccSM/YN株,用Trager法进行体外连续培养,待其正常生长后,在培养基中间断添加不同浓度的萘酚喹进行克隆筛选,培育抗性,在培育前及用药后不同时段同步化处理疟原虫,使疟原虫小环状体率达95%以上,然后用Rieckmann体外微量法测定萘酚喹对培养虫株的半数抑制浓度(IC50)。结果药物刺激前(亲代)IC50为3.03 nmol/L;药物刺激后166 d IC50为43.07 nmol/L,为药物刺激前的14.22倍;停止药物刺激后25 d的IC50为18.98 nmol/L,较药物刺激后166 d下降55.94%。但仍然较亲代高6.26倍。结论连续体外培养药物间断刺激方法可以筛选培育出高度抗萘酚喹恶性疟原虫虫株。该株恶性疟原虫抗性不稳定,停药后抗性程度有所下降。     

喹哌及羟基喹哌对抗氯喹恶性疟原虫的药效测定

应用体外培养恶性疟原虫对氯喹敏感株及抗氯喹株测试喹派及羟基喹哌的药效,并以氯喹为对照。原虫培养用Trager和Jensen氏法;药效用体外微量法测定,观察48小时后的减虫率,求得氯喹、喹哌、羟基喹哌对敏感株恶性疟原虫的ED_(50)为81、59及56nM,对抗性株的为563、61及60nM。实验未发现抗氯喹株恶性疟原虫对喹哌及羟基喹哌有明显的交叉抗性。抗氯喹株体外连续培养17天,不加氯喹刺激,抗药性从7倍降至3.4倍。     

梭链孢酸在体外抗恶性疟原虫的活性

梭链孢酸(Fusidic acid)是一种蛋白质合成抑制剂,主要用于金黄色葡萄球菌的感染,在体外抗恶性疟原虫也有效。本试验用了4种恶性疟原虫培养系:来由坦桑尼亚的对氯喹和乙胺嘧啶敏感株D_(32),来自泰国的对氯喹和乙胺嘧啶敏感株KI,抗氯喹而乙胺嘧啶敏感株克隆96,以及既抗氯喹又抗乙胺嘧啶株克隆102。4个虫株保持在连续培养液中。4ml含4%红细胞悬液(血型A阳性)的培养液,盛于50ml瓶中,放于37℃烛缸内。培养基每24小时更换一次。培养物每周2次用A型阳性红细胞悬液转移到新培养基中,并最终稀释到含虫血细胞为0.4%。皆不加抗菌素。     

恶性疟原虫抗药性的分子遗传学

恶性疟原虫对二氢叶酸还原酶抑制剂和氯喹的抗性,已被定位于单一的基因位点。二氢叶酸还原酶基因的特定点突变造成了对两种二氢叶酸抑制剂即环氯胍和乙胺嘧啶的抗性,抗性程度随点突变的位置和所涉及的氨基酸残基的不同而有所差异。氯喹抗性位点已被定位于恶性疟原虫杂交株第7号染色体中的一个400kb的片段之上。阐明该片段内基因的特性将有助于理解引起氯喹抗性的药物快速外流机制。     

用体外微量法测定培养的恶性疟原虫对药物的敏感性

用体外微量法测定恶性疟原虫对药物的敏感性,操作简便,需血量少。为了测定恶性疟原虫抗氯喹株对当前广泛应用于治疗抗氯喹恶性疟疾的磺胺-乙胺嘧啶合剂(Fan-sidar)的敏感性,作者用这种方法测定了一株泰国的抗氯喹虫株对乙胺嘧啶和磺胺嘧啶的敏感性。     

恶性疟原虫等位基因Pfmdr1与氯喹抗性的关系

恶性疟原虫药物抗性的出现,使疟疾防治形势更趋严峻。目前已分离出恶性疟原虫氯喹敏感株(CQS)和氯喹抗性株(CQR),并且找到了2种复合药物抗性基因(Pfmdr1,Pfmdr2),一般认为Pfmdr1基因的突变位点与氯喹抗性的出现有关。为证实这一观点,本文作者进行了研究。     

恶性疟原虫对乙胺嘧啶的抗性机制

作者在体外观察了恶性疟原虫FCR株(乙胺嘧啶敏感株,IC_(50)=3)和W_2株(乙胺嘧啶抗性株,IC_(50)=30000)对[(14)C)乙胺嘧啶的摄入、乙胺嘧啶的代谢以及二氢叶酸还原酶(DHFR)酶促反应的动力学特征。实验采用含8％高度同步化的14小时龄环状体原虫与20μM的[~(14)C]乙胺嘧啶共同孵育24小时,液体闪烁计数器测定[~(14)C]乙胺嘧啶的放射性,并推算疟原虫摄入乙胺嘧啶的量。结果,FCR株与W_2株摄入量无差异。对照组每10~9正常红细胞摄入乙胺嘧啶0.07nmol,感染疟原虫的红细胞摄入0.24nmol,另用放     

应用体外方法观察恶性疟原虫对氯喹反应的初步研究

应用体外方法确定恶性疟原虫对氯喹的敏感度是根据培养管内不同浓度的氯喹对疟原虫从小滋养体发育到裂殖体的抑制作用而做出判断的。方法是在每个培养管中加入一滴50%的无菌葡萄糖液,并分别加入0.25、0.5、0.75、1.0、1.5、2.5和3毫微克分子量的氯喹(毫微克分子=10~(-9)克分子)。另设不加药的对照管,在每管内加入1毫升脱去纤维蛋白的血,在38.5～40℃中培养20～30小时,于培养20小时后,用火焰消毒过的定量吸管从对照管中吸取一滴血制成薄血膜,观察疟原     

恶性疟原虫海南分离株pfcrt基因同氯喹抗性的相关性分析

目的探讨恶性疟原虫海南株pfcrt基因多态性同氯喹抗性的关系。方法采集确诊恶性疟患者血样42份，应用套式PCR方法体外扩增pfcrt基因含有编码第76和356位氨基酸的基因片段，并对扩增产物进行限制性酶切分析。结果1）76位点：22个氯喹抗性虫株中有18个发生K76T突变型（81．82％），20个氯喹敏感虫株中野生型和突变型各占50％；2）356位点：所有42个样本的356位点均为野生型。结论我国海南省恶性疟原虫pfort基因的K76T突变与氯喹抗性存在一定关联，而356位点可能与氯喹抗性无关。     

抗氯喹恶性疟原虫体外连续培养及其抗性程度的变化

目的建立抗氯喹恶性疟原虫体外连续培养株,观察其对氯喹和喹哌的抗性变化. 方法按Trager等常规恶性疟原虫体外培养方法和Reckmann等分别进行体外连续培养和药效测试.结果所解冻培养的3虫株,在培养初期疟原虫生长细弱,且能产生配子体,并以低配子体率维持一定时间,随着配子体消失,疟原虫无性体健壮,繁殖良好;对药敏测定,3株疟原虫对氯喹皆具高程度抗性(分别为32、64和32 pmol/#);对喹哌也具抗性(分别为64、64和32 pmol/#),但连续培养一定时间后,对氯喹抗性程度逐渐下降,最后皆转变为敏感(分别为第1 70、110和第80 d).而对喹哌抗性则无变化.结论3株抗氯喹恶性疟原虫对氯喹抗性不稳定,可能与原抗性程度不高和易逆有关.