缬沙坦对压力负荷心肌肥大钙调神经磷酸酶(CaN)通路的作用

目的探讨血管紧张素Ⅱ受体(AngⅡ,AT1及AT2)拮抗剂对致心肌肥厚的钙调神经磷酸酶(CaN)信号通路的影响.方法腹主动脉缩窄法建立大鼠压力负荷模型,实验动物分为手术组(n=8);缬沙坦组(n=8)手术组+缬沙坦(1 mg/kg·d);PD123319(AT2R受体拮抗剂)组(n=8)手术组+PD123319(30 mg/kg·d);假手术组(n=8).放射免疫法检测血浆、心肌AngⅡ浓度,免疫沉淀法检测心肌钙蛋白酶(u-calpain,m-calpain)及CaN蛋白表达及其磷酸化.结果缬沙坦组血浆AngⅡ浓度显著高于假手术组及PD123319组(P＜0.05),缬沙坦组心肌AngⅡ浓度则低于假手术照组及PD123319组(P＜0.05).手术组u-calpain蛋白表达显著高于假手术组(P＜0.01),缬沙坦组显著低于手术组及PD123319组(P＜0.05),手术组与PD123319组间差异没有显著性(P＞0.05).手术组CaN磷酸化显著高于假手术组(P＜0.01),缬沙坦组显著低于手术组及PD123319组(P＜0.05),手术组与PD123319组间差异没有显著性(P＞0.05).结论u-calpain参与激活高压力负荷下心肌组织CaN通路,u-calpain的上调通过AT1起作用,AT1受体拮抗剂的心脏保护作用与其抑制了m-calpain有关.     

着色性干皮病基因B对白介素-6介导的血管平滑肌细胞增殖及凋亡的影响

目的 探讨着色性干皮病基因B(xeroderma pigmentosum B,XPB)对白介素-6(IL-6)介导人血管平滑肌细胞( VSMC)增殖及凋亡的影响.方法 用脂质体转染法将重组质粒pcDNA3.1-XPB和空载质粒pcDNA3.1稳定转染VSMC,然后给予100 U/ml的IL-6孵育48 h.实验分为6组:(1)空白对照组;(2) pcDNA3.1组;(3) pcDNA3.1-XPB组;(4)IL-6组;(5) IL-6+ pcDNA3.1组;(6)IL-6+ pcDNA3.1-XPB组.用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白质免疫印迹法(Western blotting)检测XPB、Bcl-2、Bax和野生型p53(wt-p53)表达量的变化;用比色法(MTT)观察细胞增殖活力;用流式细胞仪检测细胞周期和凋亡率.结果 重组质粒pcDNA3.1-XPB转染使细胞XPB表达增高(P＜0.05或P＜0.01),同时Bcl-2表达降低、Bax和wt-p53表达增高(P＜0.05或P＜0.01),抑制IL-6促进VSMC的Bcl-2高表达、Bax和wt-p53降表达(P＜0.05或P＜0.01);XPB高表达抑制了细胞增殖活力(q=2.95,P＜0.05),并抑制IL-6促进VSMC增殖,IL-6+ pcDNA3.1-XPB组和IL-6 +pcDNA3.1组VSMC存活率分别为(102.6±6.2)％和(124.5+7.9)％(q=3.49,P＜0.05);流式细胞仪检测结果显示,XPB高表达引起细胞G0/G1期增加、S期减少、凋亡率增加(q值分别为2.99、5.39、3.05,P＜0.05或P＜0.01),并抑制IL-6促进VSMC G0/G1期减少、S期增加、凋亡率降低的作用,IL-6+ pcDNA3.1-XPB组和IL-6 +pcDNA3.1组分别为(70.9±6.7)％与(54.8±2.9)％、(20.2±3.6)％与(36.4±7.2)％、(5.9±2.1)％与(0.3±0.1)％(q值分别为6.91、8.54、7.53,均P＜0.01).结论 XPB基因能抑制VSMC增殖并促进其凋亡,并能抑制IL-6促进VSMC增殖和降低其凋亡的作用,有望成为治疗动脉粥样硬化的靶点.     

着色性干皮病基因D对白介素-6促进人血管平滑肌细胞增殖作用的影响

目的血管平滑肌细胞(vascular smooth musclecell,VSMC)过度增殖是促进动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)发生发展的一个关键因素。而且在AS损伤中,白介素-6(interleukin-6,IL-6)起到了刺激VSMC过度增殖的作用。有研究发现,着色性干皮病基因D(xeroderma pig-mentosum D,XPD)表达上调能促进某些类型细胞的凋亡。然而,XPD对VSMC的增殖和凋亡是否有影响目前未见相关报道。为此,本研究探讨XPD对IL-6促进人VSMC增殖作用的影响及其与AS之间的关系。方法用脂质体转染法将重组质粒pEGFP-N2/XPD和空载质粒pEGFP-N2稳定转染VSMC,然后给予100 U/mL的IL-6孵育48h。实验分为6组:(1)空白对照组;(2)pEGFP-N2组;(3)pEGFP-N2/XPD组;(4)IL-6组;(5)IL-6+pEGFP-N2组;(6)IL-6+pEGFP-N2/XPD组。用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白报告基因表达情况;用MTT法观察细胞增殖活力;用流式细胞仪检测细胞周期和凋亡率;用RT-PCR和Western blotting检测XPD、Bcl-2、Bax和野生型P53(wild type P53,wtP53)表达量的变化。结果在荧光显微镜下,可在转染了重组质粒pEGFP-N2/XPD或空载质粒pEGFP-N2的细胞中观察到绿色荧光,即转染成功;MTT结果显示,重组质粒pEGFP-N2/XPD的转染抑制了细胞增殖活力(P<0.01)。结论 XPD能抑制VSMC增殖并促进其凋亡,并能抑制IL-6促进VSMC增殖和降低其凋亡的作用,有望成为治疗动脉粥样硬化的靶点。     

NADPH氧化酶对培养的小鼠血管平滑肌细胞Toll样受体4介导的炎症表型的影响

目的 探讨NADPH氧化酶对培养的小鼠血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)介导的炎症表型中的作用.方法 分别采用NADPH氧化酶激动剂血小板衍生生长因子-BB(platelet-derived growth factor-BB,PDGF-BB)和抑制剂夹竹桃麻素(apocynin)处理培养的C57BL/6J和TLR4-/-小鼠胸主动脉VSMC.分别采用荧光探针二氯荧光素双醋酸盐染色法检测VSMC内活性氧(reactive oxygen species,ROS)含量,酶联免疫吸附法检测VSMC白细胞介素(interleukin,IL)-6、IL-1β和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-o,TNF-α)表达,四甲基偶氮唑蓝染色法和Boyden小室检测VSMC的增殖和迁移.结果 PDGF-BB处理可显著增高C57BL/6J和TLR4-/-VSMC内ROS含量,而夹竹桃麻素可抑制ROS生成.PDGF-BB处理可使C57BL/6J VSMC IL-6[(52.69±3.49)ng/ml对(35.04±2.74) ng/ml,P=0.001]、IL-1β[(79.68±2.33) ng/ml对(62.38±0.54)ng/ml,P=0.000]和TNF-α[(218.35±5.42)ng/ml对(124.74±4.59) ng/ml,P=0.000]表达显著上调,增殖(1.69±0.53对1.04±0.40,P=0.000)和迁移(42.ll±4.05对1.69±0.53,P=0.000)能力均显著增强,而夹竹桃麻素预处理则可显著抑制VSMC IL-6[(42.11±4.05) ng/ml对(52.69±3.49) ng/ml,P=0.010]、IL-1β[(67.57± 1.36)ng/ml对(79.68±2.33) ng/ml,P=0.000]和TNF-α[(156.18±6.98) ng/ml对(218.35±5.42) ng/ml,P=0.000]表达以及增殖(1.23±0.42对1.69± 0.53,P=0.000)和迁移(42.11±4.05对52.69±3.49,P=0.000).TLR4-/-VSMC经PDGF-BB和夹竹桃麻素处理后,IL-6、IL-1β和TNF-α表达以及增殖和迁移能力均无显著变化.结论 NADPH氧化酶衍生的ROS参与了TLR4介导的VSMC炎症表型以及增殖和迁移,可能是其影响动脉粥样硬化发生和发展的重要机制.     

缬沙坦对压力负荷心肌肥大钙调神经磷酸酶（CaN）通路的作用

目的探讨血管紧张素Ⅱ受体(AngⅡ,AT1及AT2)拮抗剂对致心肌肥厚的钙调神经磷酸酶(CaN)信号通路的影响。方法腹主动脉缩窄法建立大鼠压力负荷模型,实验动物分为手术组(n=8);缬沙坦组(n=8):手术组+缬沙坦(1mg/kg·d);PD123319(AT2R受体拮抗剂)组(n=8):手术组+PD123319(30mg/kg·d);假手术组(n=8)。放射免疫法检测血浆、心肌AngⅡ浓度,免疫沉淀法检测心肌钙蛋白酶(ucalpain,mcalpain)及CaN蛋白表达及其磷酸化。结果缬沙坦组血浆AngⅡ浓度显著高于假手术组及PD123319组(P<0.05),缬沙坦组心肌AngⅡ浓度则低于假手术照组及PD123319组(P<0.05)。手术组ucalpain蛋白表达显著高于假手术组(P<0.01),缬沙坦组显著低于手术组及PD123319组(P<0.05),手术组与PD123319组间差异没有显著性(P>0.05)。手术组CaN磷酸化显著高于假手术组(P<0.01),缬沙坦组显著低于手术组及PD123319组(P<0.05),手术组与PD123319组间差异没有显著性(P>0.05)。结论ucalpain参与激活高压力负荷下心肌组织CaN通路,ucalpain的上调通过AT1起作用,AT1受体拮抗剂的心脏保护作用与其抑制了m-calpain有关。     

血管紧张素Ⅱ对血管平滑肌细胞血管紧张素Ⅱ受体1、2mRNA表达的影响

目的:观察血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ,AngⅡ)对血管平滑肌细胞(VSMC)血管紧张素Ⅱ受体1(AT1R)、血管紧张素Ⅱ受体2(AT2R)mRNA表达的影响。方法:人脐带动脉平滑肌细胞体外原代培养,AngⅡ干预后RT-PCR测定VSMC的AT1R、AT2R mRNA的表达,并观察AT1R阻滞剂氯沙坦、AT2R阻滞剂PD123319对AngⅡ上述诱导作用的影响。结果:1AngⅡ作用于VSMC后,AT1R mRNA表达增强(P0.01),氯沙坦阻断AT1R后,AT1R mRNA表达显著下降(P0.01),PD123319阻断AT2R后,AT1R mRNA表达无显著性变化;2AngⅡ作用于VSMC后,AT2R mRNA表达无显著性增强,氯沙坦及PD123319作用后,AT2R mRNA表达也未见显著性变化。结论:1AngⅡ可诱导VSMC AT1R mRNA表达,AT1R在此过程中起重要介导作用,AT1R阻滞剂氯沙坦可有效抑制AngⅡ的这种诱导作用;2相对于AT1R,AngⅡ不能诱导VSMC AT2R mRNA表达增加。所以推测AngⅡ差异化诱导VSMC AT1R、AT2R mRNA表达,导致AT1R、AT2R失衡。     

D_3多巴胺受体对α肾上腺素能受体介导的促动脉平滑肌细胞增殖作用的影响

目的观察D3多巴胺受体对肾上腺素α受体介导的血管平滑肌细胞(VSMC)增殖的影响。方法用去甲肾上腺素(NE)刺激SD大鼠的VSMC,观察在D3受体激动剂(PD128907)存在的情况下,NE促增殖作用的变化,其中细胞增殖用3H-TdR掺入量表示。结果NE通过肾上腺素α受体促进SD大鼠VSMC增殖,该作用呈现浓度依赖性关系。PD128907低浓度(10-8、10-7mol/L)对VSMC增殖无影响,但高浓度(10-6、10-5mol/L)却促进VSMC的增殖[PD128907 10-6mol/L=(4982±529)计数/min、PD128907 10-5mol/L=(5782±483)计数/min与对照=(3798±438)计数/min相比,P<0.05],此作用可被α受体阻断剂酚妥拉明阻断。低浓度的PD128907(10-7mol/L)可通过D3受体减弱NE 10-6mol/L引起的VSMC增殖[NE 10-6mol/L=(6315±245)计数/min与NE 10-6mol/L+PD128907 10-7mol/L=(4898±286)计数/min相比,P<0.05。结论D3受体对NE所致的VSMC增殖具有抑制作用,该作用可能在高血压的发生、发展中发挥作用。     

长链非编码RNA转移相关肺腺癌转录本1及微小RNA-874对气道平滑肌细胞功能改善的调控

目的 探讨长链非编码RNA转移相关肺腺癌转录本1(lncRNA MALAT1)与微小RNA-874(miR-874)在血小板衍生因子(PDGF)-BB处理的气道平滑肌细胞(ASMCs)中的表达与功能。方法 采用PDGF-BB处理ASMCs建立哮喘细胞模型。将ASMCs分为正常培养的对照组(Control组)、PDGF-BB处理的PDGF-BB组[再根据处理时间分为PDGF-BB(6 h)组、PDGF-BB(12 h)组、PDGF-BB(28 h)组、PDGF-BB(24 h)组)]、PDGF-BB处理的转染sh-MALAT组(PDGF-BB+sh-MALAT组)、PDGF-BB处理的转染sh-NC组(PDGF-BB+sh-NC组)、PDGF-BB处理的转染miR-874 mimics组(PDGF-BB+miR-874 mimics组)、PDGF-BB处理的转染miR-NC组(PDGF-BB+miR-NC组)、PDGF-BB处理的共转染sh-NC与miR-NC组(PDGF-BB+sh-NC+miR-NC组)、PDGF-BB处理的共转染sh-MALAT1与miR-NC组(PDGF-BB+s...     

压力负荷下血管紧张素Ⅱ对心肌基质金属蛋白酶和纤连蛋白的影响

目的探讨压力负荷下心肌组织基质金属蛋白酶家族(MMPs)MMP-2、3、9与其抑制物-1(TIMP-1)的变化,及血管紧张素受体拮抗剂对MMP-2、3、9、TIMP-1及细胞外基质纤连蛋白(fibronectin,FN)的影响.方法腹主动脉缩窄法建立大鼠超压力负荷模型,实验动物分为手术组(n=8);缬沙坦(valsartan)组(n=8):手术组 缬沙坦(1 mg/kg·d);PD123319组(n=8):手术 PD123319(30 mg/kg·d)组;假手术组(n=8).免疫沉淀法检测心肌组织MMP-2、3、9及TIMP-1,免疫荧光检测FN分布.结果大鼠术后14 d,缬沙坦组血浆AngⅡ浓度显著高于假手术组及PD123319组(P＜0.05),缬沙坦组心肌AngⅡ浓度则低于假手术组及PD123319组(P＜0.05).手术组MMP-2、3、9蛋白表达显著高于假手术组(P＜0.01),手术组TIMP-1、FN蛋白表达显著低于假手术组(P＜0.01);缬沙坦组MMP-2、3、9显著低于手术组及PD123319组(P＜0.05),缬沙坦组TIMP-1、FN显著高于手术组及PD123319组(P＜0.05).MMP-2、3、9、TIMP-1及FN蛋白表达在手术组与PD123319组间差异没有显著性(P＞0.05).结论超压力负荷下,心肌组织MMP-2、3、9表达量的增高,细胞外基质FN,参与心肌重构的病理过程,主要通过AT1起作用.     

腺病毒介导gax基因转染在培养的血管平滑肌细胞中的表达

目的以腺病毒介导gax基因转染血管平滑肌细胞(VSMC),增强VSMC中gax基因的表达.方法采用位置特异性重组方法构建携带大鼠gax基因表达序列的复制缺陷型5型腺病毒载体(AdCMV-gax),经293细胞扩增,纯化制备高滴度病毒转染液;以病毒转染液常规转染VSMC后,应用RT-PCR、流式细胞仪和免疫细胞化学等方法分别检测VSMC中gax mRNA和蛋白质的表达.结果流式细胞仪检测和免疫细胞化学染色均显示AdCMV-gax转染VSMC后,VSMC的Gax蛋白表达率明显增高,转染后24小时即可达80%左右,高水平的表达可维持5天以上; AdCMV-gax转染前,PDGF-BB对gax基因转录和翻译水平的表达均有下调作用,AdCMV-gax转染后,无论有无PDGF-BB刺激,VSMC中gax基因的表达均比转染前显著增高.结论腺病毒载体可有效地介导gax基因转染VSMC,并且表达为蛋白质.这有利于进一步研究gax基因对VSMC生物学行为的影响.