肠出血性大肠杆菌O157∶H7 EspA与IntiminC300融合蛋白的构建表达

目的构建表达肠血性大肠杆菌(EHEC)O157∶H7Ⅲ型分泌蛋白EspA与紧密粘附素C-端免疫保护性片断(IntiminC300)的融合蛋白(EspA-IntiminC300)。方法采用PCR技术从EHEC O157∶H7基因组中扩增EspA的编码基因espA及IntiminC300的编码基因eaeC300,T-A克隆后依次构建至表达载体pET-28a(+),转化宿主细胞E.coliBL21(DE3),测序鉴定,IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测其表达量及表达形式,亲和层析法纯化目的蛋白,免疫印迹分析免疫反应性。结果PCR法自EHEC O157∶H7基因组中分别扩增出了约580bp(espA)和900bp(eaeC300)的目的片段,将二者融合构建了重组质粒pET-28a(+)-espA-eaeC300,测序结果与理论预测值一致性为99.9%(1501/1502)。融合蛋白在工程菌中表达量约40%,PAGE初步测定目的蛋白的相对分子量(Mr)约54×103Da,破菌后电泳证实目的蛋白主要以包涵体形式表达,包涵体洗涤后纯化,获得目的蛋白纯度约90%。免疫印迹显示融合蛋白能分别与兔抗EspA和IntiminC300血清发生免疫反应。结论高效表达了融合蛋白(EspA-IntiminC300),此融合蛋白具有良好的免疫反应性和免疫原性,为研制EHECO157∶H7多亚单疫苗奠定了基础。     

EPEC粘附相关蛋白融合表达载体的构建及表达

目的构建与EPEC粘附相关蛋白IntiminC300、EspA、BfpA融合表达载体,并进行表达。方法用PCR方法从EPEC染色体中调取intiminC300、espA、bfpA基因,用基因重组的方法把3个基因片段用2个(Gly4Ser)3连接肽串联克隆到载体pQE30的多克隆区,转化宿主菌M15,用IPTG诱导表达,用SDS-PAGE和Western blot检测表达的融合蛋白。结果酶切和测序表明成功构建了融合表达载体,SDS-PAGE检测表达蛋白的分子质量单位分别为36、43和76kd,与理论值相符,Western blot显示表达的融合蛋白均能被抗His标签抗体识别。结论本研究成功构建了EPEC粘附相关融合蛋白表达载体,并表达目的蛋白,为进一步研究融合蛋白的免疫原性奠定了基础。     

肠出血性大肠杆菌O157：H7 TccP基因克隆、表达及其抗原性鉴定

目的克隆表达肠出血性大肠杆菌（EHEC）O157：H7Tir细胞骨架偶联蛋白（TeeP）基因，并研究其抗原性。方法采用PCR法自EHEC0157：H7Sakai菌株基因组扩增TeeP基因，构建TeeP原核表达载体并在大肠杆菌中诱导表达。表达产物经初步纯化后，免疫新西兰白兔，制备兔抗TeeP多克隆抗体。抗体效价及特异性用ELISA法和Westernblotting法进行测定和分析。结果从EHECO157：H7Sakai菌株中克隆出了1014bp的TeeP基因。构建的重组质粒pET28a-TccP在大肠杆菌中获得了高效表达；以TeeP免疫家兔获得了高效价多克隆抗体，Westernblotting分析此抗体能与TeeP发生特异性抗原抗体反应。结论在大肠杆菌中成功克隆表达了TeeP基因，所获TeeP具有良好的抗原性，为进一步研究TeeP在EHECO157：H7致病机制中的作用奠定基础。     

细粒棘球绦虫FABP与Eg95融合基因的表达与抗原性鉴定

目的构建细粒棘球绦虫脂肪酸结合蛋白(FABP)和Eg95两个保护性抗原基因的融合基因,并研究其重组蛋白的免疫学特性。方法以细粒棘球绦虫青海绵羊株保护基因FABP和Eg95的cDNA为模板,通过编码4个甘氨酸残基的连接序列,用非对称聚合酶链反应扩增融合基因FABP·Eg95,克隆至表达载体pET28a(+)中,在大肠埃希菌BL21(DB3)中用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,表达产物以十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行鉴定。通过Ni-IDA亲和层析获得高纯度目的蛋白,利用蛋白质印迹(Western blotting)分析重组蛋白的免疫反应性。结果获得的融合基因FABP·Eg95长约795bp,双酶切和测序鉴定结果均显示pET-28a(+)-FABP-Eg95重组质粒构建成功。SDS-PAGE结果表明,重组质粒pET-28a(+)-FABP-Eg95在大肠埃希菌BL21(DB3)中获得高效表达,表达相对分子质量(Mr)约为31000的重组蛋白,主要以包涵体形式存在,经亲和层析获得目的蛋白。Western blotting分析结果显示,重组蛋白与细粒棘球蚴病患者血清有良好的免疫反应性,而不与健康人血清和血吸虫病患者血清反应。结论 FABP·Eg95融合基因构建成功,纯化的重组蛋白具有一定的抗原性。     

弓形虫致密颗粒蛋白4的原核细胞表达与纯化

目的 构建弓形虫致密颗粒蛋白4（GRA4）的pET原核细胞表达系统，并对其表达产物进行纯化及其免疫学活性测定。 方法 利用PCR扩增弓形虫GRA4基因片段，定向亚克隆入原核细胞表达载体pET-23a（+），转化大肠埃希菌（E.coli BL21 DE3），以组氨酸结合柱亲和层析法纯化表达产物，并对其进行抗原活性分析。将纯化的重组蛋白免疫小鼠，用ELISA检测其特异性抗体滴度。 结果 成功构建了弓形虫pET-GRA4原核细胞表达系统，其表达产物相对分子质量（Mr）约为 40 000，主要以包涵体形式存在，纯化后的重组蛋白能被人工感染弓形虫RH株速殖子的兔血清识别。免疫小鼠后可诱导产生高滴度的特异性IgG抗体。 结论 利用pET原核细胞表达系统成功表达和纯化了弓形虫GRA4重组蛋白，该蛋白具有一定的免疫学活性。     

弓形虫主要表面抗原1单链抗体与绿色荧光蛋白的融合表达及其生物活性初步观察

目的 构建、表达和纯化刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）主要表面抗原1（SAG1）单链抗体S1与绿色荧光蛋白（GFP）的融合蛋白，体外观察其与弓形虫速殖子的特异性结合能力。 方法 分别设计引物，构建原核表达质粒pET-26b-GFP和pET-26b-GFPS1，测序验证后转化大肠埃希菌BL21（DE3），以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG)诱导表达，荧光显微镜观察融合基因中GFP的表达情况。用Ni²⁺螯合柱亲和纯化融合蛋白GFPS1，十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）检测融合蛋白GFPS1。荧光显微镜观察融合蛋白GFPS1与弓形虫速殖子体外孵育后单链抗体S1对弓形虫速殖子的靶向作用。 结果 测序结果显示，弓形虫SAG1单链抗体S1与GFP的融合基因构建到原核表达载体pET-26b（+）中；IPTG诱导表达后，在荧光显微镜下可观察到E.coli BL21发出的特异性绿色荧光。SDS-PAGE检测到表达的融合蛋白GFPS1相对分子质量（Mr）约为53 000，多以包涵体形式存在。免疫荧光检测可见弓形虫速殖子表膜周围发出特异性的绿色荧光，表明纯化的GFPS1可特异性地结合到弓形虫速殖子表膜。 结论 弓形虫主要表面抗原1（SAG1）单链抗体S1与弓形虫速殖子表膜有较强的结合能力。     

肠出血性大肠埃希菌O157：H7外膜蛋白A的表达、鉴定和纯化

目的构建肠出血性大肠埃希菌O157：H7外膜蛋白A基因重组质粒，研究其在大肠埃希菌中的表达情况。方法用RT-PCR法从肠出血性大肠埃希菌O157：H7菌株克隆OmpA基因，构建重组质粒pET-30a（＋）-OmpA，经双酶切及基因测序鉴定后在E．coliBL21（DE3）原核表达系统中诱导OmpA的表达，通过蛋白质电泳技术检测蛋白的表达，用Western blot法测定和分析免疫反应性。结果获得的目的基因为1041bp，与预期值相符，测序结果与GenBank公布序列的同源性达100％，重组质粒pET-30a（＋）-OmpA在原核系统下可表达OmpA，Westernblot分析His-Tag单抗能与OmpA（His-Tag）发生免疫反应。结论OmpA重组质粒构建成功，表达产物具有抗原性。     

SARS冠状病毒M蛋白全长基因的克隆、表达与纯化

目的克隆SARS冠状病毒M蛋白基因编码序列，构建原核重组表达质粒pET23a-M，并在大肠杆菌BL21（DE3）中进行表达、纯化。表达产物用Western Blot检测其抗原性。方法RT-PCR扩增M编码基因目的片段，胶回收纯化，插入克隆载体pMD-18T载体并转化大肠杆菌DHSa。序列测定后亚克隆至表达质粒载体pET23a，构建重组体pET23a-M，转化大肠杆菌DH5α。筛选阳性克隆，以限制性酶切分析鉴定后，转化大肠杆菌BL21（DE3）以异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）进行诱导表达。用SDS-PAGE与免疫印迹分析表达产物。结果PCR扩增出约675bp的特异性片段，与预期片段大小相符，测序鉴定无有义突变；所构建的pET23α-M重组体阳性克隆经PCR与双酶切鉴定，与预期结果一致；SDS-PAGE显示表达产物约27kD；表达产物经金属螯和层析纯化；免疫印迹表明表达产物能被混合的SARS病人恢复期血清识别。结论成功克隆了SARS冠状病毒M蛋白基因编码序列，构建了pET23α-M表达质粒，诱导表达并纯化出了SARS冠状病毒M蛋白，并以免疫印迹鉴定。本研究的成功为进一步进行SARS病毒诊断试剂与疫苗的开发奠定了基础。     

结核分枝杆菌培养滤液蛋白21(CFP21)的基因克隆、表达及纯化

目的构建结核分枝杆菌培养滤液蛋白21 (Culture filtrate protein 21, CFP21)原核表达载体,获得CFP21蛋白。方法以结核分枝杆菌H37Rv株基因组DNA为模板,PCR 扩增cfp21基因,质粒PET28a ( + )为表达载体,构建PET28a（+）/cfp21质粒,转化入大肠埃希菌DH5α中,抽提质粒,PCR扩增,测序,转化到大肠埃希菌BL21中,用IPTG诱导表达,SDS PAGE分析,并用His Bind 蛋白纯化试剂盒纯化CFP21。结果构建、表达和纯化了CFP21,分子量约为24kD,主要以包涵体形式存在。结论目的基因克隆入宿主菌中并表达成功,纯化得到CFP21蛋白,为CFP21的进一步研究奠定基础。     

铜绿假单胞菌LexA蛋白在大肠杆菌中的表达与纯化

目的克隆铜绿假单胞菌PAO1株的LexA蛋白编码区，在大肠杆菌中表达并纯化表达蛋白。方法提取铜绿假单胞菌PAO1株基因组DNA，PCR扩增LexA蛋白编码区，A—T克隆于质粒pMD18-T载体中。阳性重组子经酶切后，回收目的片段连接至相应线性化的表达型载体pET-28a（＋）中，重组质粒经测序鉴定后，转化大肠杆菌BL21感受态，筛选高效表达株，表达产物经SDS-PAGE初步鉴定后，用镍珠吸附一步法纯化，表达蛋白转印PVDF膜后，经N-端测序证实。结果本研究成功克隆到PAO1株的LexA蛋白编码区并在大肠杆菌中获得表达，纯化表达蛋白经N-端测序证实确为PAO1的LexA蛋白。结论研究结果为铜绿假单胞菌PAO1株基因组中SOS盒的实验鉴定及LexA蛋白调控基因的筛选奠定了基础。