NLRP3炎症小体在LPS诱导肠神经胶质细胞炎症环境中的作用以及短双歧杆菌的干预研究

目的：观察炎症小体在LPS诱导的肠神经胶质细胞炎性模型中的作用以及短双歧杆菌的干预研究。方法：将肠神经胶质细胞造模后分为空白组,炎症模型组,短双歧干预组,免疫荧光检测GFAP及NALP3的表达,PCR检测NALP3,Caspase-1, IL-1β, NF-KB RNA的变化,Western blot 检测NALP3,Caspase-1, IL-1β, NF-KB蛋白的变化.结果：免疫荧光显示肠神经胶质细胞在LPS炎性刺激激活后表达GFAP、NALP3,空白组仅表达GFAP；PCR及Western blot 显示肠神经胶质细胞在LPS炎性刺激后较空白组高表达NALP3,Caspase-1, IL-1β, NF-KB,而短双歧杆菌干预组较肠神经胶质细胞LPS刺激组明显下调NALP3,Caspase-1, IL-1β, NF-KB的表达。结论：本研究表明炎症小体作为固有免疫的重要组分,通过NF-KB信号通路、激活促炎症蛋白酶Caspase-1、 IL-1β,参与了肠神经胶质细胞在肠道炎性环境的发展过程。短双歧杆菌可能通过NF-κB通路抑制NALP 3炎症小体调节肠道胶质网络而发挥抗炎作用。     

双歧杆菌分泌型粘附素对肠上皮细胞应激反应的影响

目的 观察双歧杆菌分泌型粘附素对肠上皮细胞应激反应后核因子(NF)-κB DNA结合活性、细胞胞质核因子抑制蛋白κB(IκB)、细胞胞核NF-κB p65的表达和肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-1β、IL-8等细胞因子表达的影响.方法 经培养的肠上皮Lovo细胞分为5组,分别经LPS( 100 ng/ml)、H2O2( 200 μmol/L)直接刺激3h以及经双歧杆菌分泌型粘附素(30 μg/ml)预孵30 min后再予LPS( 100 ng/ml)、H2O2刺激(200 μmol/L)刺激3h,正常对照组未作任何处理.采用凝胶电泳迁移率试验(EMSA)方法检测NF-κB DNA结合活性;Western印迹法分别检测细胞胞质IκB和细胞胞核NF-κBp65的表达;RT- PCR方法检测TNF-α、IL-1β、IL-8等细胞因子mRNA的表达情况.结果LPS和H2O2刺激后,细胞表现出较高的NF-κB DNA结合活性[分别为正常对照组的(6.20±0.35)倍和(4.16±0.52)倍]和细胞胞核NF-κB p65的表达[分别为(0.64±0.05)和(0.67±0.06)],而细胞胞质IxB的表达则较弱[分别为(0.28±0.10)和(0.39±0.12)];以双歧杆菌分泌型粘附素预孵后,前二者活性明显降低,而后者的表达明显增强;LPS和H2O2处理后,TNF-α、IL-1β、IL-8等细胞因子mRNA的表达水平均明显增高[LPS处理组分别为(0.92±0.10)、(0.38±0.03)、(1.44±0.25),H2O2处理组分别为(0.89±0.13)、(0.36±0.06)、(1.42±0.18)],而粘附素预孵后则可显著降低它们的表达水平.NF-κB DNA结合活性与TNF-α、IL-1β、IL-8三种细胞因子的mRNA表达水平均呈显著正相关.结论 双歧杆菌分泌型粘附素对LPS和H2O2诱导的肠上皮细胞NF-κB DNA结合活性有显著抑制作用,NF-κB的活化可能与TNF-α、IL-1β和IL-8等炎性细胞因子的表达调控有关.     

细胞因子信号转导抑制蛋白1在小蘖碱抑制脂多糖和γ-干扰素诱导的N9小胶质细胞激活中的作用

目的探讨细胞因子信号转导抑制蛋白1(suppressor of cytokine signaling,SOCS1)在小蘖碱(berberine,BBR)抑制小胶质细胞激活中的作用。方法联合应用脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)和γ-干扰素(interferonγ,IFN-γ)激活N9小胶质细胞模拟神经炎症。将细胞分为对照组、模拟神经炎症组(10 ng/ml LPS+10 U/ml IFN-γ)、BBR处理组(1μmol/L BBR+LPS/IFN-γ)、SOCS1-siRNA处理组(SOCS1-siRNA+BBR+LPS/IFN-γ)和乱序-siRNA处理组(SC-siRNA+BBR+LPS/IFN-γ)。孵育24 h后,采用酶联免疫吸附法检测细胞培养液内肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factorα,TNF-α)和白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)表达水平,采用蛋白质印迹法检测诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)和核因子κB(nuclei factor-κB,NF-κB)蛋白表达水平,采用免疫细胞化学法观察细胞形态和iNOS表达。结果与对照组相比,LPS/IFN-γ可显著增高培养基内TNF-α和IL-6含量,上调iNOS和NF-κB表达水平(P均<0.05),并增大小胶质细胞体积。1μmol/L BBR可显著抑制小胶质细胞TNF-α和IL-6释放量,降低iNOS和NF-κB表达水平(P均<0.05),并改善细胞形态。SOCS1-siRNA能显著逆转BBR对小胶质细胞激活的抑制作用(P均<0.05)。结论BBR可能通过SOCS1分子介导抑制LPS和IFN-γ对小胶质细胞的激活。     

结肠灵通过调节NLRP3炎性小体活化对感染后肠易激综合征大鼠内脏敏感性的机制研究

目的探讨核苷酸结合寡聚化结构域样受体3(NLRP3)炎症小体在结肠灵调节感染后肠易激综合征(PI-IBS)内脏高敏感性中的作用及分子机制。方法选取SPF级雄性SD大鼠40只随机分配到4组:正常对照组、模型组、结肠灵组和阳性对照组。HE染色检测大鼠结肠组织中性粒细胞等炎症细胞浸润情况及黏膜损伤状况;利用腹壁回缩反射(AWR)评分和粪便含水量评估大鼠的内脏敏感性。ELISA检测大鼠血清中IL-18和IL-1β表达;Western blotting检测NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-18、IL-1β及NF-κB表达。结果正常对照组大鼠结肠黏膜完整,无炎症细胞浸润;模型组大鼠结肠黏膜受损,有大量炎症细胞(中性粒细胞等)浸润,AWR评分值显著升高(P0.01),粪便含水量也显著增加(P0.01);给予药物干预后黏膜组织完整性恢复,降低了炎症细胞浸润,AWR评分值和大鼠粪便含水量显著降低(P0.05)。结肠灵干预降低了大鼠血清中IL-18和IL-1β含量(P0.05),显著抑制NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-18、IL-1β及NF-κB蛋白表达(P0.05)。结论结肠灵可能通过NF-κB通路抑制NLRP3炎症小体活化,降低大鼠结肠黏膜炎症,改善PI-IBS大鼠内脏敏感性。     

绞股蓝皂苷对脂多糖诱导的小胶质细胞炎性反应的影响

目的：探讨绞股蓝皂苷(gypenoside, GP)对脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)诱导的小胶质细胞炎性反应的影响。方法对小鼠 BV-2小胶质细胞系进行体外培养。将细胞分为正常对照组、LPS 组(LPS 10 ng/ml )、GP + LPS 组(LPS 10 ng/ml,GP 20μg/ml)和 GP 组(GP 20μg/ml),培养24 h后采用酶联免疫吸附法检测肿瘤坏死因子-α( tumor necrosis factor-α, TNF-α)、白细胞介素(interleukin, IL)-1β和 IL-6含量,采用免疫细胞化学染色和蛋白质印迹分析检测小胶质细胞核因子(nuclear factor, NF)-κB 和细胞因子信号传导抑制蛋白1(suppressor of cytokine signaling 1, SOCS-1)表达水平。结果 LPS 组 TNF-α、IL-1β和 IL-6释放以及 NF-κB 蛋白表达水平较正常对照组显著增加(P 均<0．001)；GP + LPS 组 TNF-α、IL-1β和 IL-6释放以及 NF-κB 表达水平较 LPS 组显著下降(P 均<0．001),而 SOCS-1表达水平显著增高(P <0．001)；GP 组 TNF-α、IL-1β和 IL-6释放以及NF-κB 和 SOCS-1表达与正常对照组无显著差异(P 均>0．05)。结论 GP 可显著抑制 LPS 诱导的小胶质细胞炎性反应,SOCS-1可能参与了 GP 对 LPS 诱导的小胶质细胞炎性反应的抑制作用。     

紫杉醇水蛭素支架涂层复合物对LPS诱导的HCASMC炎性活化过程中核转录因子NF-κ B p65及其下游炎症因子的调控作用

目的探讨支架涂层复合物紫杉醇水蛭素对脂多糖(LPS)诱导人冠状动脉平滑肌细胞(HCASMC)炎性活化过程中核转录因子NF-κ B p65及其下游炎症因子表达的影响。方法选用4~6代的HCASMC,将细胞分为空白对照组(正常HCASMC,未做任何处理)、LPS模型组(LPS干预)、紫杉醇水蛭素高浓度组(1μmol/L紫杉醇+0.2 mg/ml水蛭素+LPS干预)、紫杉醇水蛭素低浓度组(1μmol/L紫杉醇+0.0125 mg/ml水蛭素+LPS干预)。每组设置3个复孔。ELISA法检测细胞上清肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)和白介素-1β(IL-1β)的表达水平,用Q-PCR法对各组细胞NF-κ B p65、TNF-α、IL-6和IL-1βm RNA进行检测,用Western Blotting检测NF-κ B p65蛋白表达水平。结果与空白对照组比较,LPS模型组NF-κ B p65、TNF-α、IL-6和IL-1β的m RNA表达水平明显升高,差异有统计学意义(P均0.05);HCASMC经高、低浓度紫杉醇水蛭素复合物预处理,LPS刺激后,上述指标低于LPS模型组,差异有统计学意义(P均0.05)。LPS模型组NF-κ B p65蛋白表达水平明显高于空白对照组,而紫杉醇水蛭素预处理组NF-κ B p65蛋白表达水平较LPS模型组明显降低,其中高浓度处理组降低更为显著。与空白对照组比较,LPS模型组TNF-α、IL-1β和IL-6表达水平升高,差异有统计学意义(P均0.05)。与LPS模型组比较,紫杉醇水蛭素低浓度与高浓度组TNF-α、IL-1β和IL-6水平明显降低,差异有统计学意义(P均0.05)。其中高浓度紫杉醇水蛭素干预后IL-1β表达下降较低浓度更为显著,差异有统计学意义(P0.05)。结论紫杉醇水蛭素支架涂层复合物对LPS诱导的HCASMC炎性活化过程中NF-κ B p65的激活具有明显的抑制作用,有效下调核转录因子NF-κ B p65的转录活性,显著抑制下游炎症因子TNF-α、IL-6和IL-1β的表达。     

血脂康胶囊对LPS诱导大鼠肝脏Kupffer细胞NF-κB表达的影响

目的探讨血脂康胶囊对脂多糖(LPS)诱导大鼠肝脏Kupffer细胞NF-κB表达的影响。方法将分离的Kupffer细胞按1×105个/ml接种于24孔板内培养48 h后,对照组:常规培养;LPS组:给予终浓度为100 ng/ml的LPS培养8 h;血脂康胶囊组:血脂康胶囊用生理盐水溶解,90 mg·kg-1·d-1,其余处理同LPS组。ELISA法检测上清肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)和白细胞介素-6(IL-6)水平。Western blotting检测胞浆IκBα、p-IκBα及胞核NF-κB p65蛋白表达水平。结果 LPS组细胞上清TNF-α、IL-1β和IL-6表达高于对照组(P0.05)。血脂康胶囊组细胞上清TNF-α、IL-1β和IL-6低于LPS组(P0.05),但高于对照组(P0.05)。对照组胞浆蛋白IκBα表达显著高于LPS组和血脂康胶囊组(P0.05),但LPS组明显低于血脂康胶囊组(P0.05)。LPS组胞核NF-κB p65和p-IκBα表达高于对照组和血脂康胶囊组(P0.05),但血脂康胶囊组表达低于LPS组(P0.05)。结论血脂康胶囊对LPS诱导的Kupffer细胞炎症因子分泌有一定的抑制作用。     

表没食子儿茶素没食子酸酯对脂多糖诱导胶质细胞炎症的保护作用

目的观察表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)对细菌脂多糖(LPS)所致大鼠神经胶质细胞炎症的保护作用。方法取新生乳鼠原代神经胶质细胞培养,利用LPS激活小胶质细胞引起炎症反应。荧光探针检测细胞内超氧化自由基的水平;酶联免疫吸附试验(ELISA)和Western印迹检测肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-1β、IL-8、诱导型一氧化氮合酶(i NOS)、炎性因子蛋白含量的变化。结果 LPS激活神经小胶质细胞,促进其释放超氧化自由基,诱导炎症因子的过度表达,大幅上调TNF-α、IL-1β、IL-8炎性因子和升高i NOS蛋白质水平(P0.05),EGCG明显抑制超氧化自由基及上述炎症因子的过度产生,减轻LPS对神经胶质细胞的毒性。结论 EGCG能减弱LPS引起的体外培养神经胶质细胞的炎症反应。     

沙眼衣原体pORF5质粒蛋白激活p38MAPK和NALP3信号通路调控THP-1细胞IL-1β分泌的研究

目的研究沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis,Ct)pORF5质粒蛋白诱导THP-1细胞产生IL-1β的分子机制,为阐明Ct致病机制提供实验依据。方法将原核表达重组体pGEX-6p/pORF5转化大肠埃希菌,表达并纯化GST-pORF5融合蛋白,融合蛋白经蛋白酶酶切后制备不含GST标签的pORF5蛋白;用不同浓度的pORF5蛋白体外刺激THP-1细胞,ELISA测定不同时间IL-1β水平;分别用NALP3siRNA、ASC siRNA、Caspase-1抑制剂和p38抑制剂预处理THP-1细胞,再用pORF5蛋白刺激THP-1细胞24h,ELISA测定IL-1β含量,Real-time PCR测定IL-1β和NALP3炎性体mRNA的表达,Western blot分析Caspase-1的表达及p38磷酸化水平。结果 pORF5蛋白以剂量和时间依赖的方式刺激THP-1细胞产生IL-1β,24μg/ml pORF5蛋白刺激24h时IL-1β的表达水平达到峰值(495.1±55.5pg/ml);pORF5蛋白能促进THP-1细胞中NALP3炎性体mRNA的表达;NALP3-siRNA、ASC-siRNA及Caspase-1抑制剂预处理THP-1细胞后,IL-1β分泌量分别降低37.7%、71.3%和40.1%;p38抑制剂能降低NALP3炎性体mRNA及IL-1β分泌量(P0.01),但抑制NALP3炎性体后p38磷酸化水平未受影响(P0.05)。结论 pORF5质粒蛋白通过激活p38MAPK和NALP3信号通路共同调控IL-1β的产生和分泌。     

白细胞介素37对Toll样受体4激活人冠状动脉内皮细胞核因子κB和细胞间黏附分子1表达的影响

目的探讨抗炎症因子白细胞介素37(IL-37)对人冠状动脉内皮细胞(HCAEC)中Toll样受体4(TLR4)激活后下游信号核因子κB(NF-κB)及细胞间黏附分子1(ICAM-1)表达的影响及机制。方法将HCAEC培养3~5代后进行实验,分为3组:对照组、IL-37干扰组、IL-37过表达组。利用脂质体转染将IL-37干扰序列加入IL-37干扰组,IL-37 DNA过表达质粒加入IL-37过表达组;孵育24 h后,用实时荧光定量PCR检测基因转染效率以确定转染成功。各组给予TLR4激活剂脂多糖(200μg/L)进行干预。Western blot检测干预24 h后ICAM-1蛋白的表达及干预30、60、120 min时磷酸化NF-κB蛋白的表达。结果对照组在TLR4激活后ICAM-1蛋白表达升高,与之相比,IL-37干扰组在TLR4激活后ICAM-1蛋白明显升高(P0.05),但在IL-37过表达组中没有升高(P0.05)。与对照组相比,IL-37干扰组TLR4激活后30、60、120 min各时间点磷酸化NF-κB的蛋白表达明显升高(P0.05),而IL-37过表达组磷酸化NF-κB蛋白表达并没有明显升高(P0.05)。结论 IL-37可以抑制TLR4激活HCAEC中炎症因子ICAM-1的升高,其机制可能是通过抑制NF-κB磷酸化的程度。IL-37的抗炎作用可以防治动脉粥样硬化。