兔角膜基质中核黄素含量测定的HPLC方法建立

目的:建立兔角膜基质中核黄素含量测定的高效液相色谱(high performance liquid chromatograph,HPLC)分析方法,并分析其专属性、灵敏度和准确性。方法:兔角膜组织匀浆经加热孵育和10%三氯乙酸去蛋白后离心,组织上清液经C18-SPE柱固相萃取后检测。高效液相色谱柱选择ODS-BP色谱柱(5μm,250mm×4.6mmID),以甲醇-纯水(体积比为2:3)为流动相,pH=7.0,流速:0.1mL/min;荧光检测器激发波长425nm,发射波长525nm。结果:核黄素在1.0×10-6～1.0×10-4mg/mL范围与峰面积呈现良好的线性关系(r2=0.999584),精密度结果显示:RSD=0.86%(n=10),样品溶液在24h内稳定性RSD=0.51%,测得的角膜样品核黄素加标平均回收率为99.3%,RSD为3.7%。结论:本实验中建立的样品前处理方法简单,HPLC方法专属性强、灵敏度高、准确性好,可作为紫外线A/核黄素角膜胶原交联法中角膜基质内核黄素含量测定的定量方法。     

角膜致病性丝状真菌药敏纸片扩散法与微量稀释法的对比研究

目的 对比临床常用的纸片扩散法与标准微量稀释法检测丝状真菌体外药物敏感的一致性.设计实验性研究.研究对象镰刀菌属20株和曲霉菌属18株,均分离自北京同仁医院眼科中心送检的角膜标本.方法 用纸片扩散法与NCCLS提出的微量稀释法(M38-P方案)平行检测丝状真菌体外药物的敏感性,对比两种方法结果的一致性.参试药物包括那他霉素、特比萘芬、两性霉素B、伊曲康唑、氟康唑、氟胞嘧啶、咪康唑、酮康唑.主要指标纸片扩散法的抑菌环直径(mm)和微量稀释法的最小抑菌浓度(μg/ml).结果 纸片扩散法与微量稀释法对比发现:对于镰刀菌属,两者结果的符合率大于80%者有:那他霉素(100%)、伊曲康唑(100%)、氟胞嘧啶(100%)、两性霉素B(88%)、咪康唑(85%)、氟康唑(85%)、酮康唑(80%);符合率低于80%者有:特比萘芬(0%).对于曲霉菌属,符合率大于80%者有:氟康唑(100%)、咪康唑(97%)、特比萘芬(94%)、酮康唑(94%)、氟胞嘧啶(83%);符合率低于80%者有:那他霉素(72%)、伊曲康唑(72%)、两性霉素B(67%).结论 纸片扩散法与微量稀释法检测多数药物的一致性较高.由于纸片扩散法具有简便、快速等优点,适用于眼科实验室.     

年龄相关性核性白内障晶状体核中不可逆聚集体的定性和定量分析

目的 鉴定分析在年龄相关性核性白内障(age-related nuclear cataract,ARNC)晶状体核中发现的不可逆聚集体的蛋白质组成.方法 用强解聚试剂和促溶剂溶解ARNC晶状体核(8例)和年龄匹配的正常晶状体核(8例),提取总蛋白,经十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离,在ARNC晶状体样品中发现的相对分子质量高的聚集体进行液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)鉴定分析,确定聚集体的组成成分,并根据Mascot搜索数据估算各成分的相对含量.结果 SDS-PAGE结果显示,与正常晶状体核相比,ARNC样品在相对分子质量≤20 000处蛋白含量显著减少(均为P＜0.05),但在相对分子质量高(＞200 000)处蛋白质含量显著增加(均为P＜0.01).在ARNC晶状体内存在不可逆的相对分子质量高的聚集体.LC-MS/MS分析显示,这些聚集体主要来源于各种晶状体蛋白,同时还包括Filensin、Phakinin和碳酰还原酶1.在所有组分中αA-晶状体蛋白含量最高(19.1％).αA-、αB-、γD-晶状体蛋白和DKFZp434A0627比其他晶状体蛋白更容易聚集.结论 晶状体蛋白,尤其是αA-晶状体蛋白在白内障产生和发展过程中发生不可逆的聚集,细胞骨架蛋白Filensin和Phakinin以及碳酰还原酶1可能参与和加速这一过程.     

眼外伤住院378例统计分析

我院眼科于1983年1月至1992年12月10年间共收治眼外伤378例,现统计分析如下:临床资料1.构成比:10年间我院眼科收治各种眼病1420人次,其中眼外伤378例,占26.62%.2.性别与年龄:378例中男335例,女43例;男女之比为7.8比1.年龄最大66岁,最小1岁. 10岁以下43例占11.38%,11～20岁92例占24.34%,21～30岁132例占34.92%,31～40岁60例占15.87%,41～50岁23例占6.08%,51岁以上28例占7.41%.其中以21～30岁组最多.     

线粒体DNA损伤与眼病的相关性

线粒体是核外唯一含有遗传效应物质的细胞器,能够独立进行基因的转录、翻译和蛋白质的表达.线粒体DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)占细胞内DNA总量的1%,比核DNA突变率高约10倍,损伤修复能力比核DNA低.目前,mtDNA损伤对眼组织细胞凋亡、基因改变、细胞活性的影响已成为眼科疾病研究的热点.本文就mtDNA损伤与眼病相关性研究的进展作一综述.     

比较蛋白质组学技术筛选葡萄膜黑色素瘤相关蛋白

目的 应用比较蛋白质组学技术,分析鉴定葡萄膜黑色素瘤与正常人葡萄膜差异蛋白质,筛选出葡萄膜黑色素瘤相关蛋白.设计实验性研究.研究对象手术中切除的人葡萄膜黑色素瘤标本4例以及正常人捐献眼葡萄膜标本4例.方法 研磨组织提取蛋白质后,应用双向凝胶电泳进行总蛋白分离,考马斯亮兰染色,Image Master 5.0软件分析蛋白胶图,基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)鉴定部分差异蛋白质点,通过MASCOT软件在NCBI数据库中检索蛋白质信息.主要指标差异蛋白质.结果 建立了葡萄膜黑色素瘤和正常人葡萄膜组织的双向凝胶电泳图谱,鉴定了葡萄膜黑色素瘤与正常人葡萄膜之间差异表达的蛋白质30种,其中24种蛋白只在葡萄膜黑色素瘤中出现.葡萄膜黑色素瘤中表达上调的蛋白5种,表达下调的蛋白1种.这些差异蛋白可能执行新陈代谢酶、信号转导调节、细胞骨架、免疫调节等生物学功能.结论 通过比较蛋白质组学初步筛选出与葡萄膜黑色素瘤发生演进相关的蛋白质.需要进一步验证蛋白的定位及功能.(眼科,2008,17:230-234)     

先天性白内障患者和正常人晶状体蛋白质组的差异分析

目的 鉴定并分析先天性白内障患者和正常人晶状体之间蛋白质表达的差异.方法 取10例(20眼)先天性白内障晶状体及8例(8眼)正常透明晶状体,提取晶状体核中的水溶性蛋白行二维电泳及考马斯亮蓝凝胶染色后,用Image Master 2D Platinum 5.0软件对获得的蛋白图谱进行分析,再利用MALDI-TOF-MS分析及数据库搜索对差异表达的蛋白质点进行鉴定.ELISA法检测差异蛋白的含量.结果 二维电泳结果显示,先天性白内障和正常晶状体蛋白均分布在相对分子质量为14 400 ～97 400、pI5～9区域内;高丰度蛋白质斑点分布在相对分子质量20000 ～ 31000、pI 6 ～8区域内.正常透明晶状体核水溶性蛋白二维电泳图识别出34个蛋白质斑点,先天性白内障蛋白二维电泳图识别出31个点有4个.对选取的蛋白质差异斑点进行MALDI-TOF-MS分析,经数据库检索后鉴定出4种蛋白质,分别为βA3晶状体蛋白、βB1晶状体蛋白、截断的βB1晶状体蛋白和αB晶状体蛋白.ELISA结果显示,正常晶状体βA3、αB和βB1晶状体蛋白质量浓度分别为(2.20±0.15)g·L-1、(0.85±0.08)g·L-1、(0.72±0.05)g·L-1,而先天性白内障βA3、αB和βB1晶状体蛋白质量浓度为(1.60±0.09)g·L-1、(1.02±0.09)g·L-1、(0.59±0.07)g·L-1.先天性白内障αB晶状体蛋白较正常对照含量上调,βA3和βB1晶状体蛋白含量下调.结论 αB晶状体蛋白上调、βA3和βB1晶状体蛋白含量下调可能与先天性白内障的发病相关.     

钝挫伤性白内障大鼠模型中晶状体可溶性蛋白和不可溶性蛋白分析及意义探讨

目的 研究大鼠慢性眼拍打伤后晶状体可溶性蛋白与不溶性蛋白的改变,并研究大鼠热休克或喂饲HSP70阻滞剂Quercetin后对钝挫伤性晶状体蛋白的影响.方法 实验研究.SpragueDawley (SD) 大鼠24只(24只眼),完全随机设计分成以下4组:A组(对照组):6只眼;B组(拍打组):6只眼,每次以20 g钢球20 cm高度拍打大鼠右眼100回,每周1次,连续5周;C组(热休克组):6只眼,温水浴(45℃)使大鼠体温提高至40.5～41.5℃ 8 min,常温下恢复2～3 h后拍打眼球同上.每周重复1次,连续5周;D组(Quercetin组):6只眼,喂饲大鼠Quercetin 100 mg/kg体重,2～3 h后拍打眼球同上.每周重复1次,连续5周.蛋白定量用Bradford法.对晶状体蛋白测定结果 ,采用完全随机设计的方差分析,并用q检验方法 进行组间两两比较.对透明晶状体和混浊晶状体蛋白测定结果 采用成组设计定量资料t检验进行分析.结果 拍打眼球5周后,热休克组的可溶性晶状体蛋白含量为22.71±1.99,较其他3组明显升高,差异有统计学意义(F=37.82,P＜0.01);拍打组的不可溶性蛋白含量为2.60±0.48,较其他3组高,差异有统计学意义(F=3.86,P＜0.05).可溶性晶状体蛋白的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析发现混浊晶状体眼在66 000处出现明显的高分子量蛋白带,随白内障程度增加更显著.结论 慢性拍打眼球可造成晶状体损伤,不可溶性蛋白含量增加.热休克可增加品状体可溶性蛋白含量,减少不可溶性蛋白.可溶性蛋白SDSPAGE分析结果 可以看出慢性拍打眼球引起晶状体蛋白质的变化向高分子蛋白移动.     

毛细管电泳在眼科的应用

毛细管电泳是八十年代发展的新型分析技术 ,它具有分离效率及灵敏度很高、速度很快、样品和试剂消耗很少之特性。最初用于蛋白质、多肽和氨基酸分析等方面 ,现已广泛用于医药领域。九十年代中期开始用于眼科研究。本文介绍毛细管电泳分析方法的基本原理、检测技术、分离模式及应用 ,特别是在眼科疾病及眼科药物、眼保健品等方面的应用     

水溶性及水不溶性晶状体蛋白质的研究

目的用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)的方法对水溶性及水不溶性晶状体蛋白质进行分离分析,以完善晶状体蛋白质组的研究.方法用12%分离胶对晶状体水溶性蛋白(WSF)及脲溶性蛋白(USF),碱溶性蛋白(ASF)及超声溶性蛋白(SF)进行SDS-PAGE.用8%及3%～8%的梯度分离胶对WSF及USF进行SDS-PAGE.结果USF,ASF,SF和WSF相比有明显差异.WSF及USF在相对分子质量＞100000处可显示出数条清晰的蛋白谱带.结论水溶性高相对分子质量晶状体蛋白及水不溶性晶状体蛋白在双向凝胶电泳中不能很好地分离,而在单向电泳中可分离出特异性蛋白谱带,此结果是对晶状体蛋白质组研究的一种有效补充.