高糖对人视网膜色素上皮细胞神经钙黏连蛋白和纤维连接蛋白表达的影响

目的：体外建立高糖培养人视网膜色素上皮(hRPE)细胞模型,观察高糖条件下RPE细胞神经钙黏连蛋白(N-cadherin)和纤维连接蛋白(fibronectin)的表达变化,探讨高糖对RPE细胞发生上皮间质转化(EMT)的影响。

方法：体外培养hRPE细胞,以60mmol/L的葡萄糖建立高糖模型,实验分对照组(5.5mmol/L的葡萄糖)和高糖24,48,72h组,用免疫组织化学法及Real-time PCR技术检测各组RPE细胞N-cadherin和fibronectin的表达。

结果：高糖组RPE细胞出现排列紊乱,胞体变长变大,高糖72h组最明显。免疫组织化学法检测结果显示：与对照组相比,高糖组RPE细胞N-cadherin表达呈下降趋势; 而fibronectin表达出现并呈升高趋势。Real-time PCR检测结果显示：与对照组相比,高糖组RPE细胞N-cadherin mRNA表达水平在24h时出现下降,72h时降低最明显(F=12.252,P=0.000),24h组与对照组相比差异无统计学意义,48h及72h组分别与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05); 与对照组相比,高糖组RPE细胞fibronectin mRNA表达水平在24h时出现升高,72h时升高最明显(F=50.543,P=0.000),24h组与对照组相比差异无统计学意义,48h及72h组fibronectin mRNA表达水平明显升高,分别与对照组相比差异有统计学意义(P=0.000,P=0.000)。

结论：高糖条件下RPE细胞上皮标记物N-cadherin表达下调,间质标记物fibronectin表达出现,发生EMT改变,这一现象为探讨增生性糖尿病视网膜病变的发病机制及其防治提供新的思路。     

高糖对体外培养的人视网膜色素上皮细胞HSP47表达的影响

目的 探讨高浓度葡萄糖对体外培养的人视网膜色素上皮(RPE)细胞热休克蛋白47(HSP47)表达的影响.方法 RPE细胞分别在5.56 mmol/L葡萄糖(对照组)以及25 mmol/L葡萄糖(高糖组)的培养条件下,通过RT-PCR检测HSP47 mRNA的表达,使用Western blot检测其蛋白水平.结果 高糖条件下,HSP47 mRNA表达水平显著增加(P＜0.05),蛋白水平亦显著增加(P＜0.05).结论 HSP47作为一种胶原特异的分子伴侣,在高糖条件下RPE细胞内表达的增加可能是导致增生型糖尿病视网膜病变(PDR)发展的重要因素之一.     

高糖体外对视网膜色素上皮增生以及活性氧表达的影响

目的:研究高浓度葡萄糖对体外培养的视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞增生以及活性氧(reactive oxygen species,ROS)生成的影响。方法:体外培养人RPE(ARPE-19),随机分成4组,即正常对照组用含5.6mmol/L葡萄糖的DMEM/F12培养液,高糖组用30mmol/L葡萄糖的DMEM/F12培养液,高糖+SB203580组用p38-MAPK特异性阻断剂SB20358010μmol/L预处理30min后,再用含30mmol/L葡萄糖的DMEM/F12培养液,甘露醇组(渗透压对照组)用含5.6mmol/L葡萄糖和24.4mmol/L甘露醇的DMEM/F12培养液。各组培养48h用MTT法检测各组视网膜色素上皮细胞的增生活力,用CM-H2DCFDA荧光染色检测RPE细胞中ROS的产生量。结果:与对照组相比,高糖培养人视网膜色素上皮细胞48h可以导致RPE细胞的损伤,抑制RPE细胞增殖,并使ROS生成增加,在一定程度上,与p38-MAPK途径的激活有关。结论:高糖培养ARPE-19可致细胞损伤,抑制增殖,并使ROS生成增加。     

自噬抑制剂3-MA对高糖诱导的人视网膜色素上皮细胞增生的抑制作用

背景糖尿病视网膜病变(DR)是糖尿病常见的并发症之一,视网膜色素上皮(RPE)细胞作为视网膜重要的组成细胞在DR的发生和发展中至关重要. 目的 探讨自噬抑制剂3-MA对高糖培养的人RPE细胞(hRPECs)增生的影响.方法 将体外培养的hRPECs分为对照组、高糖组和3-MA+高糖组,对照组细胞用含5 mmol/L葡萄糖的DMEM/F12培养基进行培养,高糖组采用含30 mmol/L葡萄糖的DMEM/F12培养基进行培养,干预组细胞先在DMEM/F12培养基中添加10 mmol/L的3-MA处理1h后,再添加30 mmol/L葡萄糖溶液进行培养.将培养的细胞以1×105/孔的密度接种于24孔细胞培养板中,待细胞80％融合后用含体积分数0.5％胎牛血清的培养基继续孵育24 h,使细胞周期同步化.倒置光学显微镜和透射电子显微镜下观察各组jRPECs的形态及超微结构;采用CCK-8法检测各组hRPECs的增生率;采用Western blot法检测各组hRPECs中自噬相关基因微管相关蛋白轻链3B(LC3B)蛋白的表达.结果 对照组细胞生长状态良好,细胞排列整齐;高糖组细胞体积稍增大,细胞数量明显多于对照组,而3-MA+高糖组细胞形态不规则,排列紊乱.透射电子显微镜下可见对照组细胞核呈圆形或卵圆形,亚细胞器形态均正常,未发现自噬小体;高糖组细胞中可见自噬溶酶体,而3-MA+高糖组可见自噬小体.对照组、高糖组、3-MA+高糖组细胞的增生率分别为(100.0±2.0)％、(116.9±5.2)%和(103.7±4.7)％,总体比较差异有统计学意义(F=13.526,P=0.006),高糖组的细胞增生率明显高于对照组和3-MA+高糖组,差异均有统计学意义(均P＜0.05),3-MA+高糖组与对照组间细胞增生率的差异无统计学意义(P＞0.05).与对照组比较,高糖组细胞中LC3B-Ⅰ蛋白表达减弱,LC3B-Ⅱ蛋白表达增强,而3-MA+高糖组细胞中LC3B-Ⅰ和LC3B-Ⅱ蛋白的表达强度与对照组接近.对照组、高糖组、3-MA+高糖组细胞中LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ值分别为0.131±0.065、2.504±0.097和0.274±0.007,组间总体比较差异有统计学意义(F=1 694.676,P=0.000),高糖组细胞中LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ值明显高于对照组和3-MA+高糖组,差异均有统计学意义(均P＜0.05),3-MA+高糖组与对照组间细胞中LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ值的差异无统计学意义(P＞0.05).结论 高糖可激活自噬过程并促进hRPECs增生,而自噬抑制剂3-MA在一定程度上抑制自噬进程,从而发挥抑制细胞增生的作用.     

缺氧和高糖对视网膜色素上皮细胞增生及VEGF、TGF-β1表达的影响

目的 探究缺氧、高糖环境对体外培养的视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞生长、增生及血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)表达变化的影响.方法 采用酶消化法进行C57小鼠RPE细胞的体外原代培养.通过组织形态学观察和免疫化学染色对培养的RPE细胞进行鉴定.实验缺氧组:在DMEM培养液中加入CoCl2,使其浓度分别为50μmol·L-1、100μmol·L-1、200μmol·L-1;实验高糖组:在DMEM培养液中加入D-葡萄糖,使其浓度分别为15 mmol·L-1、30 mmol·L-1、45 mmol·L-1.分别向培养的RPE细胞中加入上述培养液,共6组,每组3份;正常对照组加入含5.5 mmol·L-1葡萄糖、不含CoCl2的培养液.观察各组细胞在不同培养条件下的活力、倍增时间及增生情况.采用ELISA法检测各组细胞在培养不同时间后(24 h、48 h、72 h)上清液中VEGF及TGF-β1表达量的变化.结果原代培养及传代早期的RPE细胞生长较为旺盛;在缺氧和高糖培养条件下所培养的细胞活力和分裂次数均较正常对照组有所降低或减少,而倍增时间较正常对照组延长.在缺氧和高糖培养条件下培养24 h、48 h、72 h后,细胞上清液中VEGF和TGF-β1表达量均较正常对照组高(P<0.05);当CoCl2浓度为100 μmol·L-1和D-葡萄糖浓度为30mmol·L-1时,VEGF和TGF-β1在24 h、48 h、72 h表达均高于其他浓度,缺氧状态下48 h表达量分别为(43.28±0.88)ng·L-1和(8.90±1.38)ng·L-1,高糖状态下分别为(39.76±0.56)ng·L-1和(8.81±0.92)ng·L-1;缺氧组2种细胞因子表达量在48 h达到高峰,而高糖组在72 h达到高峰.结论 应用酶联合消化法可获得纯度较高的体外C57小鼠培养RPE细胞;缺氧和高糖状态可对RPE细胞增生起到明显抑制作用,但能够明显上调RPE细胞的VEGF、TGF-β1表达量.     

曲安奈德对高糖培养RPE细胞ICAM-1和ILK表达的影响

目的 检测高糖诱导的视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞间黏附分子(intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)和整合素连接激酶(integrin-)linked kinase,ILK)的表达,并观察曲安奈德(triamcinolone acetonide,TA)时二者表达的影响,探讨炎症在糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy,DR)发病过程中的作用.方法 体外培养人RPE细胞,应用免疫荧光细胞染色法、Western-blot法,分别检测在低糖对照组(5.6 mmol·L-1葡萄糖的DMEM培养液)、高糖组(30.0 mmol·L-1葡萄糖的DMEM培养液)、TA组(0.1 mol·L-1TA+30.0 mmol·L-1葡萄糖的DMEM培养液)RPE细胞ILK和ICAM-1蛋白的表达,实时荧光定量PCR检测二者mRNA的表达.结果 Western-blot和免疫荧光细胞染色都显示RPE细胞在高糖组培养6 h时ICAM-1表达量最高,为0.378±0.012,是对照组0.220±0.008的1.71倍,TA对其表达有抑制作用,抑制率为26.98%(P＜0.05);高糖组作用2 h ILK蛋白表达量最高,是对照组的1.45倍,TA组中虽然ILK表达量较高糖组减少(为高糖组的76.20%),但差异无统计学意义(P＞0.05),TA对其表达无明显抑制作用.而实时荧光定量PCR检测显示在在高糖组作用1 h后RPE细胞表达ICAM-1、ILK mRNA开始上升,ICAM-1 mRNA表达在2 h达到高峰,2 h时TA对高糖组ICAM-1 mRNA的抑制率为83.67%,差异具有统计学意义(P＜0.05).TA组ILK mRNA的表达与高糖组差异无统计学意义(P＞0.05).结论 RPE细胞在高糖环境下能高表达ICAM-1和ILK,高糖对RPE细胞表达ICAM-1的上调作用能被糖皮质激素TA抑制,而ILK的上调不受其抑制,提示炎症在早期DR病理过程中有重要作用,RPE细胞可能通过这两种因子的信号途径参与DR的病变.     

高糖环境下视网膜微血管周细胞β1，4半乳糖基转移酶-1的表达

目的 了解高糖培养环境下牛视网膜微血管周细胞β1,4半乳糖基转移酶-1(galactosyltransferase-1,GalT-1)的表达情况以及细胞凋亡情况.方法 原代培养牛视网膜微血管周细胞,在含不同浓度葡萄糖的培养基(5 mmol/L,10 mmol/L,20 mmol/L,30 mmol/L)培养72 h,以5 mmol/L浓度葡萄糖培养组作为正常对照组.采用RT-PCR,蛋白凝集素染色法观察不同浓度葡萄糖培养下GalT-1表达的改变情况,同时采用流式细胞观察高糖诱导的细胞凋亡.结果 高糖培养环境下,视网膜微血管周细胞内GalT-1 mRNA表达上调,凝集素染色提示视网膜微血管周细胞蛋白由Galβ1→4GlcNAc糖基化基团的修饰表达上调;视网膜微血管周细胞凋亡加剧,各葡萄糖浓度组的凋亡细胞平均死亡率为7.35±1.82%,16.34±2.25%,29.85±6.66%,39.48±6.48%.结论 高糖环境下,牛视网膜微血管周细胞内β1,4半乳糖基转移酶-1的表达上调,其可能参与了高糖环境下的视网膜微血管周细胞凋亡,参与机制有待进一步研究.     

ghrelin-GHSR-1a对高糖环境下视网膜血管内皮细胞的保护作用

目的 观察ghrelin及其受体生长激素分泌素受体1a(GHSR-1a)在高糖环境下对视网膜血管内皮细胞的保护作用.方法 将体外培养的人视网膜血管内皮细胞(HRMECs)分为对照组和高浓度葡萄糖组.对照组细胞在含5.5 mmol·L-1葡萄糖的M199培养基中培养48 h,高浓度葡萄糖组细胞在含30.0 mmol·L-...     

6-磷酸果糖激酶-2/果糖-2，6-二磷酸酶（PFKFB3）抑制剂3PO对高糖环境下人脐静脉血管内皮细胞新生血管形成的影响

目的　探讨6-磷酸果糖激酶-2/果糖-2,6-二磷酸酶（6-phosphofructokinase-2/fructose-2,6-bisphosphatase 3,PFKFB3）抑制剂3-（3-吡啶基）-1-（4-吡啶基）-2-丙烯-1-酮［3-（3-pyridinyl）-1-（4-pyridinyl）-2-propen-1-one,3PO］对高糖环境下人脐静脉血管内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells,HUVEC）增殖、迁移和管腔形成的影响。方法　将传代培养的HUVEC随机分为4组:正常对照组（5.5 mmol·L^-1葡萄糖）、高渗组 （5.5 mmol·L^-1葡萄糖 +24.5 mmol·L^-1甘露醇）、高糖组 （30.0 mmol·L^-1葡萄糖）及高糖+3PO组（30.0 mmol·L^-1葡萄糖+ 10 μmol·L^-1 3PO）。细胞同步化后按分组情况更换相应培养基,继续培养细胞,用于后续实验。采用MTS实验检测细胞增殖率,细胞划痕实验检测细胞迁移率,体外管腔形成实验检测细胞成管情况,实时荧光定量PCR检测PFKFB3 mRNA表达,Western blot检测PFKFB3及ERK蛋白表达情况。结果　与正常对照组相比,高渗组细胞增殖能力降低（均为P<0.05）;24 h高糖组细胞增殖能力无明显升高（P>0.05）,48 h高糖组细胞增殖能力升高（P<0.05）。与高糖组相比,高糖+3PO组细胞增殖能力明显被抑制（均为P<0.05）。与正常对照组相比,高渗组细胞迁移率明显升高（均为P<0.05）;24 h高糖组细胞迁移率明显升高（P<0.05）,但在48 h高糖组中细胞迁移率升高不明显（P>0.05）。与高糖组相比,高糖+3PO组细胞迁移率明显降低（均为P<0.05）。与正常对照组相比,高渗组及高糖组细胞管腔形成能力均明显减弱（均为P<0.05）。与高糖组相比,高糖+3PO组细胞管腔形成能力减弱（P<0.05）。与正常对照组相比,高渗组PFKFB3 mRNA的表达水平变化不大（P>0.05）,高糖组PFKFB3 mRNA的表达升高 （P<0.05）。与高糖组相比,高糖+3PO组 PFKFB3 mRNA的表达明显降低（P<0.05）。与正常对照组相比,高渗组及高糖组中p-ERK/ERK蛋白比值及PFKFB3蛋白表达均升高（均为P<0.05）。与高糖组相比,高糖+3PO组p-ERK /ERK蛋白比值及PFKFB3蛋白表达下降（均为P<0.05）。结论　PFKFB3抑制剂3PO可明显降低高糖环境下HUVEC的增殖、迁移和管腔形成的能力,其作用机制可能与MAPK/ERK信号通路有关。     

高糖条件下胰岛13细胞株MIN-β细胞对视网膜色素上皮细胞的保护作用

背景糖尿病视网膜病变（DR）与高糖所致的视网膜色素上皮（RPE）细胞的氧化损伤密切相关,近年来人们广泛地致力于保护RPE细胞的研究。目的研究胰岛B细胞株MIN-6细胞对RPE细胞高糖损伤的保护作用。方法将RPE细胞体外培养4d,待贴壁生长良好后分为正常对照组、高糖对照组和MIN-6细胞共培养组,ABC法鉴定RPE细胞。用含5mmol／L葡萄糖的RPE细胞培养液进行培养作为正常对照组,高糖对照组用含30mmol／L葡萄糖的培养液进行培养,MIN-6细胞共培养组为含5×10^4个MTN-6细胞以及30mmol／L葡萄糖的培养液进行培养。各组继续培养24h后,应用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法测量高糖对已贴壁生长良好的RPE细胞的损伤作用以及MIN一6细胞对RPE细胞高糖损伤的保护作用。结果ABC法鉴定RPE细胞可见95％以上呈棕色着色,为阳性细胞。各组继续培养24h后,正常对照组、高糖对照组和MIN-6细胞共培养组RPE细胞的吸光度（A_540）值差异有统计学意义（F=19．94,P〈0．01）,正常对照组的A。值为0．44±0．02,高糖对照组为0．30±0．01,差异有统计学意义（t=6．85,P〈0．01）;MIN-6细胞共培养组的A。值为0．41±0．01,与高糖对照组的0．30±0．叭比较,差异有统计学意义（t=5．62,P〈0．01）。正常对照组RPE细胞的生存率为（97．5±3．3）％,高糖对照组为（68．2±4．5）％,差异有统计学意义（t=11．30,P〈0．01）。结论高糖导致贴壁生长良好的RPE细胞损伤,MIN-6细胞可以明显保护高糖所致的RPE细胞损伤。     

Strabisme Alternant - Etude clinique - traitement

The author defines motor and sensory alternation: the term alternation should not be used in isolation, it should always be accompanied by the name of the parameter concerned. Sensory alternation is always found together with motor alternation but the reverse is not true.The examining criteria for a diagnosis of sensory alternation are given, sensory alternation must not be confused with alternating inhibition. Working from clinical observations of cases of motor alternating strabismus, the author selects 2 types of binocular sensory relations which allow one to differentiate between:- cases of primary alternating strabismus- cases of secondary alternating strabismusThese forms will develop in different ways; in both cases a cure is possible providing that the right treatment is prescribed and once prescribed carefully followed, etc. It is always a case of serious forms of strabismus whose developmental period is spread over several years.According to the authors, the frequency of cases of true primary strabismus is from 1–3%, the frequency of cases of secondary alternating strabismus varies according to the type of therapy practised on cases of monocular strabismus with amblyopia. These latter will become cases of alternating strabismus under the influence of certain types of therapy carried out over several years (penalization, rocking, alternated occlusion, etc...).Experimental data on kittens confirm clinical data; kittens placed in abnormal environments during the sensitive period will show modification in the distribution of cortical cells and the absence of binocular cells (either because the excitation of the two eyes was not simultaneous, or not identical: artificial strabismus, occlusion, opaque glasses). This disturbances become irreversible after a certain period of exposure (a function of age, length of exposure, etc...).It is thus necessary to bear in mind: 1) the iatrogenic risks of certain orthoptic treatments, 2) the necessity for a binocular form of treatment as soon as possible, as once a certain stage is passed, cortical plasticity diminishes and the elaboration of normal binocular relations becomes impossible.

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