牛视网膜毛细血管周细胞的选择性培养

目的：选择性分离，培养牛视网膜毛细血管周细胞。方法：采用有限的胶原酶消化和筛网过滤，辅以细胞的克隆分离和除杂，培养近乎纯净的视网膜毛细血管周细胞。结果：原代培养时，视网膜毛细血管周细胞形态不规则，呈现出典型的非接触性抑制重叠融合生长，传代培养后增长速度明显加快，第3天进入对数生长期，第10天进入平台期。培养的视网膜毛细血管周细胞对单克隆抗体α-平滑肌肌动蛋白抗体染色显阳性，而对Ⅷ因子相关抗原抗体，抗GFAP抗原抗体染色显阴性。结果：此方法能简单、经济、有效地获得了较纯净的视网膜毛细血管周细胞（纯净度＞98％），并能连续传代，为研究与视网膜毛细血管周细胞有关的各种正常生理或病理过程提供了极大的方便。     

视网膜Müller细胞原代培养的技术研究

目的介绍一种新的视网膜Ｍüｌｅｒ细胞条件化原代培养的方法。方法使用ＣｏｎＡ活化脾细胞培养上清液作为条件化培养基，分别培养人、大鼠、小鼠的视网膜Ｍüｌｅｒ细胞，并进行形态学观察及免疫组织化学染色。结果用该方法原代培养不同种类的视网膜Ｍüｌｅｒ细胞，免疫组织化学染色显示９０％以上的视网膜Ｍüｌｅｒ细胞的神经胶质纤维酸性蛋白（ｇｌｉａｌｆｉｂｒｉｌａｒｙａｃｉｄｉｃｐｒｏｔｅｉｎ，ＧＦＡＰ）和Ｓ－１００蛋白染色阳性。结论视网膜Ｍüｌｅｒ细胞的条件化原代培养是一种可靠的、快速获得不同种类视网膜Ｍüｌｅｒ细胞的理想方法。     

人角膜缘干细胞体外培养的增殖与分化研究

目的了解角膜缘干细胞体外培养的增殖分化规律。方法组织块法培养细胞,测定细胞克隆形成率（ＣＦＥ）,免疫荧光染色检测干细胞表达角质蛋白Ｋ３的状况。结果原代培养２１天左右细胞生长达到饱和,传第１代７～１０天形成单层,ＣＦＥ为９．５２％±４．９７％;传第２代７天,ＣＦＥ为４．２５％±２．１０％（Ｐ＜０．０１）。正常角膜缘基底细胞不表达角质蛋白Ｋ３;原代培养的干细胞亦不表达Ｋ３,传第１代细胞有部分表达。结论人角膜干细胞位于角膜缘基底部,培养的角膜缘干细胞早期具有较高的增殖力并保持干细胞的分化特性。     

角膜干细胞增殖与分化表达实验研究

目的 了解角膜缘干细胞体外生长的增殖分化特性,检测上皮细胞生长因子对干细胞增殖的促进作用。方法 采用ＤＭＥＭ和Ｆ１２培养基进行兔角膜上皮细胞培养,用克隆形成率（ＣＦＥ）、免疫组化染色和蛋白质免疫印迹等方法检测细胞的增殖力和分化表达状况。结果角膜缘干细胞（ＬＣ）在本培养条件下能够正常传代生长５代,ＣＦＥ为（５．０７±２．３５）％,而角膜中央上皮细胞（ＣＣ）仅第１次传代生长,ＣＦＥ为（１．１２±０．８     

选择性培养牛视网膜血管内皮细胞和周细胞

目的　建立选择性培养牛视网膜血管内皮细胞和周细胞的简要方法。方法　采用机械除杂法或等密度沉降分离法 ,培养皿用不同的基质成分包埋 ,培养液中加入有利于细胞生长的添加物。结果　原代培养的牛视网膜血管内皮细胞和周细胞纯净度 >95 % ,能连续传代。周细胞在传代后不规则形状及细胞内微丝更明显。视网膜血管内皮细胞融合后呈“铺路石”样改变。视网膜血管内皮细胞对Ⅷ因子相关抗体染色阳性。视网膜周细胞对单克隆抗体α 平滑肌肌动蛋白抗体染色阳性。结论　用明胶包被培养皿 ,在培养液中加入肝素、内皮细胞生长因子及高浓度的胎牛血清可获得较纯的内皮细胞。而周细胞最适合的培养液为DMEM加入 2 0 g·L-1胎牛血清。利用Percoll分离液也可分离培养出较纯的牛视网膜血管内皮细胞和周细胞     

Mechanisms of apoptosis in retinal pigment epithelial cells

目的了解诱导视网膜色素上皮（ＲＰＥ）细胞在体外发生凋亡的因素，以推测该细胞凋亡在体内发生的可能机理。方法培养的人ＲＰＥ细胞分别给予低氧（３％），肿瘤坏死因子（ＴＮＦ），蛋白激酶Ｃ（ＰＫＣ）抑制剂及抗Ｆａｓ抗体处理２４～７２ｈ，同时也观察了纤维母细胞生长因子（ｂＦＧＦ）对体外凋亡诱导因子所致ＲＰＥ细胞凋亡的保护作用。以琼脂糖ＤＮＡ电泳及流式细胞计数法检测细胞凋亡，采用免疫组化染色及流式细胞计数法决定Ｆａｓ在ＲＰＥ细胞的表达。结果所用的细胞凋亡诱导剂均可使ＲＰＥ细胞发生典型的凋亡（ＤＮＡ片段形成），ｂＦＧＦ具有较强的抑制ＲＰＥ细胞凋亡发生的作用。３Ｈ胸腺嘧啶摄入表明，所有细胞凋亡诱导剂均能抑制ＲＰＥ细胞的生长。结论不同的诱导因子可诱导ＲＰＥ细胞在体外发生凋亡，其发生与多种凋亡信号系统调控和交互反应有关，因此，调节ＲＰＥ细胞凋亡可能会给某些视网膜变性类疾病提供新的治疗手段。     

增殖细胞核抗原与bc1-2在培养的人视网膜色素上皮细胞的表达

目的观察培养的人视网膜色素上皮细胞（ｒｅｔｉｎａｌｐｉｇｍｅｎｔｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｓ，ＲＰＥ）的增殖细胞核抗原（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅｃｅｌｎｕｃｌｅａｒａｎｔｉｇｅｎ，ＰＣＮＡ）和ｂｃ１－２的表达。方法用ＳＡＢＣ法对培养的人ＲＰＥ作鼠抗人ＰＣＮＡ单抗及兔抗人ｂｃ１－２抗体免疫组织化学染色。结果ＲＰＥ在接种后２４小时和４８小时，ＰＣＮＡ的阳性率分别为３１．２％和５０．６％，阳性染色位于细胞核内，斑块状。ｂｃ１－２的表达为７６％～９０％，阳性染色在细胞浆，细颗粒状。结论培养中一半ＲＰＥ有ＰＣＮＡ抗原表达，提示这些细胞处于Ｓ期；ｂｃ１－２抗原在大多数ＲＰＥ表达阳性。这些生物标记物可能与培养的ＲＰＥ生长活性有关。     

人眼小梁细胞培养及免疫组化特性研究

目的 在体外进行人眼小梁细胞培养，以探索成功的培养方法。对培养的小梁细胞进行免疫组化特性研究，探讨小梁细胞的胚胎来源和生物学特性基础。方法 细胞培养使用ＤＭＥＭ培养基，ＣＯ２孵箱３７℃下培育。原代培养加用２０％胎牛血清，或增加１０％人ＡＢ血清。第１次传代在原培养瓶中进行。小梁细胞免疫组化Ｓ－Ｐ法染色确定其免疫组化特性。结果 人眼小梁细胞原代生长缓慢，成功率低。免疫组化结果显示：小梁细胞神经原特异性     

大鼠视网膜微血管内皮细胞的分离和培养

目的探讨大鼠视网膜毛细血管内皮细胞(rat retinal capillary endothelial cells,RRCEC)的体外分离和选择性培养方法。方法采用单纯视网膜剪碎法获得的视网膜微血管碎片,结合0.25%胶原酶消化,经细胞筛网过滤,原代细胞悬液接种于纤维粘连蛋白(fibronectin,FN)包被的培养皿中,培养液为含20%胎牛血清(FBS)、100×103U·L-1肝素钠、10mg·L-1碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的DMEM液。原代培养5～6d细胞较少时,采用机械除杂法进行细胞分离,而在传代时利用进行选择性消化和贴壁法除杂分离以获得较纯RRCEC。应用Ⅷ因子相关抗体通过免疫组化方法对所培养的RRCEC进行鉴定。结果大鼠视网膜组织经过胶原酶适当消化后,产生大量具有良好生长能力的微血管碎片,贴壁后可见RRCEC自微血管碎片中游出,融合后呈铺路石样单层生长。传代培养时5～6d可融合生长。选择性培养获得的RRCEC纯度高,能连续传代,保持性状不变。对Ⅷ因子相关抗体染色阳性。结论视网膜剪碎、胶原酶、FBS、bFGF、培养皿处理及机械除杂法分离,选择性消化和贴壁等应用可获得较纯的RRCEC,方便简单,具有良好的重复性。     

缺氧促进视网膜微血管内皮细胞的增殖扩C—fos癌基因表达

目的 研究缺氧在视网膜新生血管形成中的作用。方法 采用细胞计数及免疫组化的方法，将培养的视网膜微血管同皮细胞接种于２４孔板，分别放入正常及缺氧（５０ｍｌ·Ｌ＾－１Ｏ２）环境中，３７℃进行培养。不同时间后进行计数及抗ＦＯＳ蛋白抗体染色。结果：缺氧组的细胞计数均高于正常组（Ｐ〈０．０１），抗ＦＯＳ蛋白抗体染色，缺氧组明显强于正常组。结论 缺氧可以明显促进视网膜微血管内皮细胞的增殖，其机理是通过诱导Ｃ－