目标区域捕获技术鉴定一RP家系USH2A基因的新复合杂合突变

背景 RP为遗传性致盲眼病,其遗传方式和临床表型呈高度异质性,对患者的突变基因进行筛查和诊断对于进一步的基因治疗研究有重要意义. 目的 利用目标区域捕获技术确定中国一常染色体隐性遗传RP家系成员的临床表型及基因突变方式.方法 收集2013年暨南大学附属深圳眼科医院1个汉族RP家系,对该RP家系的4个成员进行眼科检查,抽取家系成员的外周血后,利用华大基因眼科芯片目标区域捕获技术对先证者进行基因突变检测,利用PCR以及Sanger测序法对RP家系中正常表型的成员进行基因突变点验证. 结果 该家系共3代5名成员,Ⅰ1、Ⅰ2、Ⅱ2和Ⅲ1均为表型正常者,Ⅱ1为先证者,自18岁出现夜盲及视力下降,呈管状视野缺损.先证者眼底检查发现视盘呈蜡黄色和视网膜骨细胞样色素沉积,荧光素血管造影可见片状遮蔽荧光和周边视网膜透见荧光.该家系遗传方式符合常染色体隐性遗传.芯片分析发现先证者USH2A基因存在由c.9958 G＞T(p.Gly3320Cys)错义突变和c.11156 G＞A(p.Arg3719His)错义突变组成的复合杂合突变,而其表型正常的父亲(Ⅰ 1)为c.9958 G＞T(p.Gly3320Cys)杂合突变,表型正常的母亲(Ⅰ 2)为c.11156 G＞A(p.Arg3719His)杂合突变,表型正常的女儿(Ⅲ1)为c.9958 G＞T(p.Gly3320Cys)杂合突变. 结论 该RP家系可能由USH2A基因的c.9958 G＞T和c.11156G＞A复合杂合突变导致.眼科芯片技术可以快速准确地筛查RP常见候选基因.     

目标区域捕获测序检测到一视网膜色素变性家系ABCA4基因新突变

目的研究我国一个常染色体隐性遗传的视网膜色素变性（RP）家系患者的临床表型及致病基因突变,并分析表型与基因型间的关系。方法实验研究。收集了宁夏人民医院眼科诊治的一个RP家系的临床资料,共有7名家庭成员参与研究,其中包括2名患者和5名正常成员。完善家系内所有参与成员的眼科检查,包括最佳矫正视力（BCVA）、视野、眼底照相、光学相干断层扫描（OCT）及全视野视网膜电流图（ERG）等。针对180个已知的遗传性视网膜疾病致病基因及9个高度可疑的候选基因设计目标区域捕获芯片,利用该捕获芯片对先证者（Ⅳ-4）进行目标区域内的高通量二代测序,借助优化的生物信息学分析对捕获的遗传变异进行筛查过滤,最终通过家系内共分离验证确认致病突变,进一步分析该突变与患者表型间的关系。结果临床检查结果表明该家系内的2名患者的临床表现均符合典型的RP改变,遗传学分析结果证实了ABCA4基因c.419G>A突变是该家系的致病突变。该突变导致了ABCA4基因所编码的蛋白第140号氨基酸由精氨酸变为谷氨酰胺（p.Arg140Gln）,保守性分析显示该突变位点在各物种中高度保守,PloyPhen-2软件预测结果表明该突变具有较高的致病性。结论本研究借助基于高通量二代测序平台的目标区域捕获测序,首次发现了ABCA4基因新突变p.Arg140Gln是一个常染色体隐性遗传RP家系的致病突变,进一步扩充了ABCA4基因的遗传突变谱及表型谱。     

应用新一代目标区域捕获测序揭示视网膜色素变性患者的EYS基因突变

目的应用新一代测序技术研究一例散发视网膜色素变性（RP）患者的致病基因突变位点及其临床表型。方法实验研究。 收集一散发的RP家系,共3名家庭成员参与研究。其中1名患者,2名正常家属。采集3 ml外周静脉血,提取基因组DNA,运用目标区域捕获测序技术来筛查目前已报道的201个遗传性视网膜疾病的致病基因,测序结果运用生物信息学分析得到候选基因,最后用Sanger测序验证。结果临床检查结果显示患者呈现典型的RP临床症状。遗传学筛查结果证实患者在EYS基因上存在2个复合杂合突变：1个杂合的错义突变（c.6416G>A,p.C2139Y）,1个杂合的无义突变（c.8012T>A,p.L2671X）。Sanger测序结果证实为阳性并且分别遗传自父亲母亲,为常染色体隐性遗传。EYS基因被报道为RP的主要致病基因之一。结论本例患者的EYS基因存在2个杂合突变,是导致RP的致病原因。     

应用外显子结合目标区域捕获测序芯片对一回族先天性白内障家系致病基因的检测

背景 先天性白内障是造成儿童盲和弱视的重要原因,其中约50％的先天性白内障具有遗传性.目的 应用眼遗传病外显子结合目标区域捕获测序芯片检测一常染色体显性遗传先天性白内障家系的致病基因.方法 于2011年在宁夏眼科医院收集一回族常染色体显性遗传先天性白内障家系,采集家系中患者及表型正常成员的临床资料.对家系成员进行眼科检查,抽取患者、表型正常家系成员及300名正常对照者的外周静脉血各5 ml,提取DNA,利用眼遗传病外显子结合目标区域捕获测序芯片筛查和检测候选致病突变位点.采用PCR和直接测序法对家系成员和正常对照者进行突变位点验证,最终确定致病突变位点.结果 该家系共6代61名成员,均为回族,先天性白内障患者18例,为5代遗传,符合常染色体显性遗传特征.患者中合并眼球震颤和斜视者7例,合并高度近视者4例,来诊前均已实施白内障摘出术.利用眼遗传病外显子结合目标区域捕获测序芯片检测结合生物信息学方法筛查后共得到8个候选致病突变位点,其中5个在非编码区,3个在编码区,通过PCR和直接测序法验证确定CRYGD基因上的P24T突变是该家系的致病突变位点.该突变与家系内所有患者表型共分离,在家系表型正常者及300名正常对照者均未发现此突变.结论 外显子结合目标区域捕获测序技术快速检测CRYGD基因P24T突变为该先天性白内障家系致病突变,该技术为临床表型多样、致病基因众多的先天性白内障的致病基因检测提供新的手段.     

汉族常染色体显性视网膜色素变性一家系的连锁分析及突变筛查

背景 原发性视网膜色素变性(RP)有明显的遗传异质性和表型异质性,目前已确定的致病基因较多,确定患病家系的致病基因是进行基因治疗的基础. 目的 对患常染色体显性遗传性RP(ADRP)的一个汉族家系进行致病基因的定位和基因突变分析.方法 此家系的5代21名成员纳入研究,包括12例ADRP患者和9名表型正常者.12例患者进一步接受中心视野、间接检眼镜、眼电图(EOG)、视网膜电图(ERG)检查.对22个已知的ADRP致病基因所在染色体位点进行连锁分析,以确定该家系与疾病连锁的染色体区域,随后对该区域附近的候选基因视紫红质(RHO)进行直接测序评估其突变情况. 结果 间接检眼镜检查该家系先证者眼底表现符合原发性RP表现,EOG和ERG表现为波形记录不到,视野呈向心性缩小.两点连锁分析结果显示,该家系致病基因位点与遗传标记D3S1292连锁,在θ=0.0时得到最大优势对数(LOD)值为3.6671.候选的RHO基因直接测序结果发现,该家系所有患者第53位密码子的第2个核苷酸均出现了C→G的突变,致其氨基酸由脯氨酸变为精氨酸(Pro53Arg),而该家系正常成员中未发现此突变. 结论 RHO基因的错义突变Pro53Arg与RP疾病出现共分离现象,可确定为该ADRP家系的致病基因.     

全外显子组测序技术对两个眼前节发育不良家系致病基因检测

目的 筛查两个眼前节发育不良(anterior segment dysgenesis,ASD)家系的致病基因突变.方法 对2个来自河北和河南的ASD家系进行分析.在获得受检者同意后,对家系成员进行详细的眼科检查,采集外周静脉血,提取全基因组DNA.依据测序需求选取家系1中2例患者及1名正常对照、家系2中1例患者及1名正常对照进行全外显子组测序,对测序结果筛选候选基因,运用Sanger测序进行验证.利用PolyPhen-2,SIFT HumanSplicing Finder软件进行突变危害性预测.结果 家系1连续3代均有患者发病,符合常染色体显性遗传特征,9例患者有均不同程度的双眼ASD.得到13个SNV和55个InDel候选突变,在候选基因PAX6中,家系1发现一已知错义突变c.T2A(p.M1K);家系2中共8名成员,其中2例患者,在测序中发现一已知剪切位点突变c.357+ 1g＞c.3个预测软件作出危害性预测.结论 外显子测序技术快速检测出PAX6基因中T2A(p.M1K)和c.357 +1g＞c突变,并确定其为ASD的致病突变.     

中国南方先天性白内障一家系GJA8基因C>G新突变

目的 对一个常染色体显性遗传先天性白内障（ADCC）家系进行候选基因筛查,以期寻找其可能的致病基因。设计 实验研究。研究对象 一个中国南方ADCC家系。方法 应用聚合酶链反应（PCR）和DNA直接测序方法,对该家系进行ADCC常见致病基因突变筛查。主要指标 基因序列。结果 临床眼科检查显示该家系先天性白内障类型为核性白内障。候选基因序列测定显示在GJA8基因c.565位置上存在C>G的突变,该突变导致在缝隙连接蛋白Cx50 p.189位置上的脯氨酸突变为丙氨酸,此氨基酸改变位点位于缝隙连接蛋白结构中第二个细胞外段。而该家系中非患者和100名对照者基因组序列均无此改变。结论 位于GJA8 的c.565C>G突变是导致此先天性白内障家系可能的致病原因,缝隙连接蛋白第二个胞外结构域对晶状体的透明性起着重要作用。（眼科, 2013, 22: 86-89）     

全外显子组测序法对一中国常染色体显性遗传先天性白内障家系GJA3基因突变位点的分析

背景 先天性白内障是儿童致盲的重要原因,多数先天性白内障与遗传有关.目前已知的与常染色体显性遗传先天性白内障(ADCC)有关的基因有39个. 目的 采用全外显子组测序法对一ADCC家系的致病突变基因进行筛查和分析.方法 纳入2014年8月-9月在郑州大学第一附属医院就诊的一ADCC家系,分别采集家系中14例患者和14名表型正常成员外周静脉血各10 ml,同期同法采集100名健康体检者10 ml的外周静脉血作为对照.用标准酚-氯仿提取法提取所有受检者基因组DNA,并采用全外显子组测序法将先证者的DNA进行全外显子组测序,与数据库对比后筛选出候选基因突变位点,设计突变基因位点引物后采用PCR技术对家系中受检者及100名健康对照者的该基因位点进行扩增并测序,以验证候选基因的致病性并分析其致病机制.结果 该家系共5代68名成员,患病者20例,遗传方式符合常染色体显性遗传方式.患者均双眼发病,晶状体混浊以皮质性为主.先证者全外显子组测序后分析发现,13号染色体GJA3基因的2号外显子第143位核糖核苷酸A突变为G(c.143A＞G),导致其编码的第48位氨基酸由谷氨酸变为甘氨酸(p.E48G).PCR扩增产物测序结果显示该家系中患病受检者DNA均有此突变,但该家系中表型正常的受检者及100名健康对照者该候选基因均不存在此突变.结论 GJA3基因c.143A＞G为该ADCC家系的致病基因突变位点,增补了GJA3基因的突变谱.     

中国一先天性无虹膜家系的遗传分析及PAX6基因突变位点的检测

背景 先天性无虹膜是双眼发病的遗传性疾病,目前的研究表明先天性无虹膜患者配对盒转录因子6(PAX6)基因突变位点具有多样性. 目的 通过目标序列捕获测序结合一代测序验证技术对1个中国先天性无虹膜家系进行基因突变位点的筛查和遗传分析.方法 采用横断面研究方法,本研究组于2016年3月纳入在郑州大学第一附属医院确诊的1个中国汉族先天性无虹膜家系,并对该家系成员进行致病突变基因检测.该家系全体成员均接受神经系统、口服葡萄糖耐量试验等全身体格检查以及眼科相关检查.采集现存家系所有成员前臂静脉血10 ml以提取基因组DNA,以先证者基因组DNA为模板行前房角发育异常致病基因的目标基因定点捕获测序分析,经与各基因库比对筛选出候选致病基因位点,采用PCR法对该家系成员行致病基因位点DNA片段扩增,采用Sanger测序技术在该家系除先证者以外的2例患病者和表型正常成员中进行候选致病基因验证. 结果 该家系共3代9名成员,Ⅰ1去世,现存8位成员,包括患病者3例(Ⅱ2及其子代Ⅲ1、Ⅲ2)和表型正常者5人,符合常染色体显性遗传模式.所有家系成员未发现神经系统异常,口服葡萄糖耐量试验结果均呈阴性.3例患病者视力均明显下降且不能矫正,眼压平均值为21 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa),患者均存在虹膜完全缺如、角膜基质层混浊、眼球水平震颤、黄斑中心凹发育不良症状.此外,Ⅱ2患者存在左眼上睑下垂、右眼先天性白内障表现,Ⅲ2同时存在双眼先天性白内障、双侧晶状体不全脱位.先证者目标序列捕获测序分析及数据库比对显示,所有患病者PAX6基因第6号外显子上碱基替换c.183C＞A,经Sanger测序验证后证实突变基因与表型共分离. 结论 PAX6基因c.183C＞A突变是该先天性无虹膜家系的致病突变位点.     

第二代测序技术在一中国先天性白内障家系致病基因检测中的应用

背景 某些遗传性疾病具有高度遗传异质性,因此传统的Sanger测序技术已经不能满足医学研究及临床工作的需求.第二代测序(NGS)技术由于具有费用低及检测速度快的优点而得到广泛应用,但在先天性眼病突变基因的检测中的应用效果有待验证.目的 探讨NGS技术对先天性白内障患者进行致病基因诊断和产前诊断的可行性.方法 于2013年1月收集来自河南省洛阳市的一汉族先天性白内障家系,抽取家系中3例患者(Ⅱ2、Ⅲ3、Ⅲ4)和3名表型正常者(Ⅱ3、Ⅲ1、Ⅲ2)的外周血各2 ml,EDTA抗凝,在河南省医学遗传研究所应用NGS技术对先证者进行基因突变位点检测,并采用Sanger测序技术对NGS结果进行验证,然后用Sanger测序技术对该家系其他成员的外周血样本进行突变位点的序列分析,根据确定的致病突变位点对先证者的胎儿进行产前诊断.本研究遵循赫尔辛基宣言,检测方案经河南省人民医院医学伦理委员会批准,所有研究对象均签署知情同意书.结果 该家系4代14位成员中共5例患者,其中男2例,女3例,分布于Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ代中,其他家系成员表型正常,符合常染色体显性遗传方式.NGS检测发现先证者Ⅲ3CRYBB1基因第6外显子上存在c.682T＞C(p.S228P)杂合突变,Sanger法验证了该点突变.Sanger法检测发现家系中患者均存在CRYBB1基因c.682 T＞C突变,而家系中表型正常者CRYBB1基因的c.682位点基因型为T/T野生型.产前诊断结果显示胎儿(Ⅳ1)CRYBB1基因c.682位点基因型为T/T野生型.结论 NGS可用于先天性白内障基因突变的快速检测,该家系致病性基因为CRYBB1基因c.682T＞C突变,应用NGS技术结合一代测序技术成功对先证者进行了产前诊断.     

Homeostasis of the retinal micro-environment: I. Magnesium,potassium and calcium distributions in the avian eye

The concentrations of Mg²⁺, K⁺ and Ca²⁺ in the intraocular fluids (IOFs) and blood plasma of chickens and pigeons were determined by atomic absorption spectrophotometry. The Mg²⁺ concentration in the IOFs of both species was greatest in the liquid vitreous adjacent to the retina followed by aqueous > blood plasma > plasma dialysate. In contrast the concentration of K⁺ in the IOFs of both chickens and pigeons was greater in the aqueous than in the liquid vitreous. The concentrations of Ca²⁺ in all IOF compartments of chicken eyes were virtually identical and were lower than that of blood plasma. The concentrations of Mg²⁺ in the IOFs of the chicken, especially in the liquid vitreous, was remarkably stable; experimentally lowering or raising the plasma Mg²⁺ concentration over a relatively wide range had little or no effect on the Mg²⁺ concentration in the IOFs of these animals. We can conclude that a high Mg²⁺ and low K⁺ concentration in the extracellular fluids of the retina is maintained in the avian eye, as in the mammalian eye, by active transport processes across the blood-retinal barrier systems. Because the avian retina is completely avascular, the site of these homeostatic transport processes must be the epithelium of the retinal choroid and/or the pecten. These findings support the concept that the contribution of the vitreous to the homeostasis of the retinal micro-environment is inversely related in vertebrates to the degree of retinal vascularization.     

Vergleich der Durchmesserreaktion retinaler Arterien und Venen auf Flickerlicht

ZusammenfassungZiel In dieser Studie soll die durch Flickerlicht verursachte Durchmesserreaktion retinaler Arterien und Venen hinsichtlich Ausmaß und zeitlichem Ablauf verglichen werden.Methoden In die klinische Studie wurden 26 gesunde Probanden einbezogen. Der Durchmesser der retinalen Gefäße jeweils eines Auges wurde kontinuierlich mittels eines Retinal vessel analyzer gemessen. Jede Untersuchung bestand aus 100 s Baseline sowie 5 Perioden von 20 s Flickerlichtstimulation, gefolgt von 80 s Beobachtung.Ergebnisse Unmittelbar nach Flickerlicht dilatierten die Arterien um 6,9±2,8% (MW±STD) und die Venen um 6,5±2,8% (Unterschied nicht signifikant). Der Quotient aus arterieller und venöser Dilatation (AVDQ) betrug 1,25±0,69 (Spannweite 0,2 bis 2,8). Es konnte keine signifikante Altersabhängigkeit der arteriellen bzw. venösen Dilatation oder des AVDQ nachgewiesen werden. Die arterielle Dilatation ging nach 25,9±10,8 s in eine leichte Konstriktion von –2,7±1,4% über. Im Gegensatz dazu waren die Venen zum Zeitpunkt des individuellen Konstriktionsmaximums noch um 0,5±1,3% dilatiert (p<0,001).Schlussfolgerungen Die flickerlichtinduzierte Durchmesserreaktion retinaler Arterien und Venen unterscheidet sich bei Gesunden nicht in ihrem mittleren dilatativen Maximum, aber in Form und zeitlichem Verlauf des Abklingens der Dilatation.Unterstützung durch: BMBF 13N7999.Vortrag gehalten auf der 101. Jahrestagung der DOG, Berlin, September 2003.     

Acute Multifocal Placoid Pigment Epitheliopathy Associated with Cavernous Sinus Thrombosis

Acute multifocal placoid pigment epitheliopathy (AMPPE) has been associated with disease of the central nervous system. In this case report, we discuss a patient presenting with AMPPE in the setting of a new central nervous system association: cavernous sinus thrombosis.     

Dual nonlinearities regulate contrast sensitivity in pattern discrimination tasks

Many current psychophysical models propose that visual processing in cortex is hierarchical, with nonlinearities sandwiched between linear stages of processing. In earlier publications, we proposed a model of this type to account for masking effects found with spatial frequency and orientation discriminations. Our model includes two nonlinear mechanisms that regulate contrast sensitivity in early cortical mechanisms. The first is a local within-pathway nonlinearity that accelerates at low contrasts but is compressive at high. The second is a pooled nonlinear gain control process that operates over a broad range of neurons with different tuning characteristics. Here, we test predictions of the model for spatial frequency discriminations. The model predicts that at low contrasts, adding a grating mask oriented parallel to test gratings will improve discrimination performance via operation of the within-pathway nonlinearity, analogous to the "dipper effect" found with contrast discriminations. Adding an orthogonally oriented mask is predicted to have no effect at low contrasts, where pooled gain control processes contribute little to performance. At high contrasts, the model predicts that performance will asymptote and become independent of contrast with either parallel or orthogonal masks. The results confirm model predictions.