提前光照对氧诱导视网膜病小鼠模型的视网膜血管发育的影响

目的探讨提前光照对氧诱导视网膜病小鼠模型的视网膜新生血管发育的影响。方法48只健康C57BL／6J小鼠．随机取12只作为正常对照组，其余随机分为高氧模型组、提前光照组和高氧联合提前光照组。每组各12只小鼠。高氧模型组：将出生后第7天（P7）的小鼠置于舍75％高浓度氧的氧箱内，5d后取出，再置于正常空气环境中饲养；提前光照组：取出生后第4天（P4）未开睑新生小鼠。手术提前开启右眼睑裂。让右眼提早接受环境光及视觉刺激，左眼为自身对照：高氧联合提前光照组：取P4小鼠提前开启右眼睑裂．在P7时放入高浓度氧箱内饲养，5d后取出。各组均于小鼠生后第27天（P27）取材，应用HE染色、视网膜铺片ADP酶染色及视网膜新生血管计数等方法观察小鼠视网膜新生血管的生长情况。结果在P27时，正常对照组和单纯提前光照组小鼠视网膜均无显著新生血管生长；高氧模型组内皮细胞计数较正常对照组及单纯提前光照组明显增加，有显著统计学意义（P〈0．01），提示该组存在显著视网膜新生血管生长：在高氧联合提前光照组，双眼新生血管内皮细胞计数均较正常对照组明显增加（P〈0．05），但该组的提前光照眼新生血管内皮细胞计数较单纯高氧作用眼有所减少（P〈0．01）。结论对于小鼠，高氧可诱导视网膜新生血管的生成，提前光照可削弱高氧所致的小鼠视网膜新生血管的增殖。     

脂联素调控糖尿病大鼠视网膜一氧化氮合酶的表达及意义

背景糖尿病视网膜病变（DR）是糖尿病最常见的微血管并发症,其发病机制尚未完全阐明。脂联素可以通过抑制血管内皮细胞的炎症反应、降低血管细胞间黏附能力等影响糖尿病微血管病变的发生,脂联素与一氧化氮合酶（NOS）的作用关系报道较少。目的观察脂联素对糖尿病大鼠视网膜NOS表达的影响。方法选择8～10周龄雌性SD大鼠40只,按随机数字表法将大鼠分为正常对照组10只、脂联素组及糖尿病对照组各15只。脂联素组及糖尿病对照组大鼠用一次性腹腔注射四氧嘧啶法建立糖尿病模型,注射24h后测空腹血糖值〉16mmol／L、尿糖〉＋＋＋为造模成功,纳入研究共24只糖尿病大鼠。脂联素组大鼠给予10μg／kg重组脂联素注射。采用Westernblot法检测脂联素蛋白在正常对照组、脂联素组及糖尿病对照组大鼠视网膜中的定量变化,采用免疫组织化学法观察NOS在各组大鼠视网膜中的表达和定位。结果正常对照组、脂联素组及糖尿病对照组大鼠视网膜中脂联素蛋白含量（脂联素／p—actin）分别为0．85±0．21、0．79±0．17和0．42±0．08,总体比较差异有统计学意义（,=4．236,P=0．000）;糖尿病对照组大鼠视网膜脂联素蛋白较正常对照组和脂联素组明显下降,差异均有统计学意义（q=6．615,P=0．000;q=6．026,P=0．000）。正常对照组、脂联素组、糖尿病对照组NOS阳性反应强度的4值分别为0．244±0．035、0．262±0．032和0．367±0．066,总体差异有统计学意义（F=3．752,P=0．001）;糖尿病对照组NOS含量较正常对照组、脂联素组明显升高,差异均有统计学意义（q=3．488,P=0．002;q=3．079,P=0．005）。NOS主要表达于视网膜内核层和视网膜神经节细胞（RGCs）层。结论脂联素可下调糖尿病大鼠视网膜中NOS的含量,减少NO在视网膜中的生成,减轻NO对视网膜血管内皮细胞结构和功能的损伤,从而延缓DR的发生。     

MMP-2和VEGF在视网膜新生血管中的表达及意义

目的探讨基质金属蛋白酶-2（MMP-2）和血管内皮生长因子（VEGF）在视网膜新生血管中的表达及意义。方法取C57BL/6J小鼠60只,随机分为高氧组和正常组,各30只。以高浓度氧诱导小鼠建立视网膜新生血管模型。采用ADP酶视网膜铺片、苏木精-伊红染色及免疫组织化学法分别观察视网膜血管的改变、计数视网膜新生血管内皮细胞数并检测MMP-2、VEGF蛋白的表达。结果高氧组视网膜可见大量新生血管形成;突破视网膜内界膜的新生血管内皮细胞核数为（33.51±2.55）个,与对照组相比差异有统计学意义（t=9.345,P〈0.05）。高氧组与对照组比较,MMP-2、VEGF蛋白在神经节细胞层、内丛状层、内核层和突破视网膜内界膜的新生血管中高表达,且二者表达呈正相关（r=0.825,P〈0.05）。结论MMP-2、VEGF共同促进视网膜新生血管的形成,且二者可能具有协同作用。     

Ang-2在高氧诱导新生鼠ROP动物模型中的表达及意义

目的：研究Ang-2在高氧诱导新生鼠ROP动物模型中的表达,探讨Ang-2在视网膜新生血管形成中的作用。方法60只新生SD大鼠,随机分为高氧诱导组和正常对照组,将氧诱导组小鼠置于密闭容器中饲养,连接氧浓度测量仪,保持氧箱内氧浓度为75±2%,5d后将幼鼠取出置于常氧环境中饲养,正常对照组幼鼠置于普通空气中饲养。两组幼鼠均于出生后17d被处死,行眼球病理切片Ang-2免疫组织化学染色,了解Ang-2在视网膜新生血管的形成中的作用。结果高氧诱导组幼鼠生后17天视网膜新生血管和Ang-2的表达达高峰。P17d高氧诱导组幼鼠突破内界膜血管内皮细胞核数目（34.78±4.38）明显高于正常对照组（1.56±1.64）,两组比较差异有统计学意义（＜0.001）;P17天高氧诱导组幼鼠Ang-2表达明显高于正常对照组,其平均光密度值（OD值）分别为（117.25±10.67）和（83.29±9.15）,两组比较差异有显著性（＜0.001）。结论高氧诱导组幼鼠视网膜新生血管的形成同Ang-2的表达变化相一致,提示Ang-2在高氧诱导视网膜新生血管的形成中起一定作用。     

视网膜静脉阻塞家兔血管内皮生长因子的表达

目的研究血管内皮生长因子（Vascular Endothelial Growth Factor，vEGF）在视网膜静脉阻塞（Retinal Vein Occlusion，RVO）中的作用及在视网膜新生血管中的参与机制。方法经玻璃体眼内电凝法建立RVO家兔模型，利用荧光素眼底血管造影（Funds Fluorescein Angiomphy，FFA）观察视网膜及血管的情况，采用免疫组化观察对照组、模型组视网膜组织中VEGF蛋白的表达情况。结果正常家兔视网膜组织中VEGF免疫反应弱。模型组与正常对照组比较，阻塞近端术后2wk、4wk，P〈0．05（P=0．000，0．024），差异有显著性，而术后1wk，P〉0．05（P=0．144），差异不明显。各组两两比较，2wk组与1wk、4wk组，P〈0．001（P=0．000，0．000），差异有显著意义。结论VEGF蛋白表达在视网膜局部缺血时提高，在再通或侧支循环形成时降低，与RVO眼内组织缺血形成存在一定的时空对应关系。     

色素上皮衍生因子对高氧诱导的新生鼠视网膜病变的影响

目的观察色素上皮衍生因子（PEDF）对高氧诱导的新生鼠视网膜病变模型的影响。方法出生7dWistar大鼠50只,分为空气组、空气PEDF组、高氧组、高氧PBS组和高氧PEDF组5组。氧箱内饲养5d建立高氧诱导的新生鼠视网膜病变模型,12、14、16d时腹腔内注射PEDF或PBS。在鼠龄17d时,进行视网膜形态学及组织病理学检测,以及血管直径测量、周边视网膜血管覆盖率测定及视网膜新生血管计数。结果视网膜铺片可见高氧组、高氧PBS组较空气组、空气PEDF组新生血管丛增多,高氧PEDF组较高氧组、高氧PBS组视网膜新生血管减少。组织病理学检测突破视网膜内界膜的视网膜新生血管计数可见高氧PEDF组视网膜血管直径明显高于高氧组（P〈0.01）、与空气组比较差异无统计学意义（P〉0.05）;高氧组周边视网膜血管覆盖率明显高于高氧PEDF组（P〈0.01）、与空气组相比差异无统计学意义（P〉0.05）;高氧组视网膜新生血管数量明显高于高氧PEDF组（P〈0.01）、与空气组相比差异无统计学意义（P〉0.05）。结论 PEDF对高氧诱导的新生鼠视网膜病变模型具有抑制作用。     

Avastin玻璃体腔注射对小鼠氧诱导视网膜病变新生血管的抑制作用

背景早产儿视网膜病变（ROP）主要源于视网膜新生血管的形成，avastin可以同血管内皮生长因子（VEGF）的所有异构体发生高亲和力结合，拮抗其生理活性。目的观察玻璃体腔注射avastin对氧诱导视网膜病变模型新生血管的作用。方法取7日龄清洁级C57BL／6J小鼠90只，用随机数字表法随机分为6组：空气对照组、高氧对照组、高氧BSS组和低、中、高剂量avastin组，每组15只。空气对照组小鼠在空气中喂养，其他各组均置于体积分数75％±2％O，的高氧环境中饲养，连续5d，高氧BSS组大鼠玻璃体腔注射无菌BSS液0．5μl，3个avastin处理组小鼠分别玻璃体腔注射1．25、2．50、5．00g／Lavastin各0．5μl。17日龄时过量麻醉处死小鼠，摘除眼球制备视网膜组织切片，苏木精一伊红染色后计数突破内界膜的新生血管内皮细胞核数目；应用免疫组织化学染色法检测视网膜中CD34分子的表达；利用视网膜铺片技术观察低、中、高剂量avastin组大鼠视网膜新生血管的形态并进行比较。结果苏木精一伊红染色发现，高氧对照组小鼠视网膜突破内界膜的新生血管内皮细胞核数目明显多于空气对照组，差异有统计学意义（P〈0．01）；不同剂量的avastin组小鼠视网膜中突破内界膜的新生血管内皮细胞核数明显少于高氧BSS组和高氧对照组，差异均有统计学意义（P〈0．01）；高剂量avastin组与低剂量avastin组比较，突破内界膜的新生血管内皮细胞核数明显减少，差异有统计学意义（P〈0．05）。免疫组织化学检测显示，高氧对照组视网膜突破内界膜的内皮细胞CD34分子呈阳性表达。视网膜铺片可见空气对照组的血管自视盘向四周均匀放射，分支良好，结构清晰；高氧对照组、高氧BBS组可见大量新生血管，其结构紊乱，分布不均；各剂量avastin组随着剂量的增加，视网膜血管分布和走行接近空气对照组。结论玻璃体腔注射avastin可抑制视网膜新生血管的产生，其作用与avastin的剂量有关。     

重组人内皮抑素抑制角膜新生血管的实验研究

目的研究重组人内皮抑素（rHES）对碱烧伤诱导大鼠角膜新生血管（CNV）的抑制效应。方法60只Wistar大鼠按随机数字表法分为正常组、阳性对照组、rHES组3组，每组各20只。阳性对照组右眼角膜碱烧伤后不治疗；rHES组右眼角膜碱烧伤后立即100mg／mL rHES点眼，每日3次；20只正常鼠不做任何干预处理作为正常组。观察碱烧伤后1、4、7、10、14d各组角膜情况及CNV的生长面积。碱烧伤后第16天处死动物，取角膜行组织病理学检查。免疫组织化学、PCR检测血管内皮生长因子（VEGF）蛋白量和mRNA在角膜组织的表达，透射电镜下检查碱烧伤后角膜组织的超微结构变化。结果rHES组角膜在碱烧伤后各时间点新生血管面积均小于阳性对照组（t4d=3．294，P=0．040；t7d=5．391，P=0．000；t10d=6．560，P=0．000；t14d=10．346，P=0．000）。角膜碱烧伤后第16天各组VEGF蛋白表达量的差异有统计学意义（F=337．62，P=0．00），各组VEGF mRNA表达量的差异有统计学意义（F=114．43，P=0．00）。透射电镜检查显示正常组结构正常，rHES组较阳性对照组角膜结构变化小。PCR结果发现rHES组VEGF mRNA的相对表达量低于阳性对照组，但高于正常组。结论rHES用于眼表可有效抑制碱烧伤诱导的CNV。     

血管紧张素转换酶抑制剂抑制小鼠视网膜新生血管的实验研究

目的:探讨血管紧张素转换酶抑制剂(angiotensin converting enzyme inhibitors,ACEI)对视网膜新生血管(retinal neov-ascularization,RNV)的抑制作用。方法:采用随机对照实验研究。选取7天龄C57BL/6J新生小鼠36只,随机分为2组:高氧组和ACEI组,每组18只。ACEI组和高氧组小鼠建立氧诱导视网膜病变模型,出氧箱后每日分别ip卡托普利10mg/kg和等量生理盐水,连续5d。采用荧光素血管灌注视网膜铺片观察视网膜血管形态学改变;制作视网膜组织切片并进行HE染色计数突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核数;采用Western blot检测视网膜血管紧张素II(angiotensin II,Ang II)和血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)蛋白的表达。结果:荧光素血管灌注视网膜铺片:高氧组可见大量新生血管丛,伴明显荧光渗漏,ACEI组较高氧组视网膜新生血管减少,荧光渗漏减轻。突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核数:ACEI组较高氧组减少,差异具有统计学意义(P=0.00)。视网膜AngII蛋白表达水平:ACEI组较高氧组下调,差异具有统计学意义(P=0.00)。视网膜VEGF蛋白表达水平:ACEI组较高氧组下调,差异具有统计学意义(P=0.00)。结论:早期应用ACEI可一定程度抑制RNV形成。     

Tenomodulin抑制氧诱导视网膜病变小鼠模型新生血管形成的研究

目的探讨Tenoinodulin（TeM）蛋白对C57BL／6J小鼠早产儿视网膜病变模型（ROP）视网膜新生血管形成的抑制作用。方法将60只7d龄C57BL／6J幼鼠随机分为高氧组（ROP组）、正常对照组各15只和TeM组30只。将ROP组小鼠置于体积分数（75％±2％）的高氧环境中5d，随后回到正常氧环境中饲养5d；对照组小鼠饲养在正常氧环境中；TeM组是将鼠1只眼玻璃体腔内注射1μg TeM，对侧眼注射PBS作为对照，然后置于体积分数（75％±2％）的高氧环境中饲养5d，之后返回正常氧环境中。17d时处死全部小鼠，收集各组眼球。视网膜荧光素灌注铺片观察视网膜血管的改变、计算视网膜无灌注区的面积；计数突破内界膜的内皮细胞数反映视网膜血管增生情况，观察TeM蛋白对视网膜新生血管形成的抑制作用及对视网膜可能的毒性反应；Western blot检测TeM蛋白在视网膜内的表达。结果与高氧组（2．94±0．55）mm^2。及TeM组中对侧眼注射PBS（2．83±0．46）mm^2的视网膜铺片中央非灌注区面积（mm^2）相比，注射TeM的视网膜铺片（0．44±0．26）mm^2，其中央非灌注区面积差异有统计学意义（P〈0．01）；每个视网膜切面突破内界膜的内皮细胞核数（10．57±2．95）与前二者（44．93±6．78、41．07±7．31）比较差异均有统计学意义（P〈0．01）。注射TeM的视网膜冰冻切片未见炎症反应和细胞毒性破坏。Western blot检测结果显示注射TeM的视网膜呈阳性表达，注射PBS的视网膜未出现条带反应，TeM的相对分子质量约为16000。结论TeM可有效抑制视网膜新生血管的形成，预示着TeM在预防和治疗眼部新生血管方面具有潜在的作用。     

Murine ocular heparanase expression before and during infection with Pseudomonas aeruginosa

PURPOSE: To demonstrate the constitutive expression and regulation of heparanase (heparan sulfate endoglycosidase) in the normal mouse eye and in mice intracorneally infected with Pseudomonas aeruginosa. METHODS: Na?ve (unimmunized) and immunized C57BL/6J mice were infected with P. aeruginosa, and corneal heparanase gene and protein expression were detected by semiquantitative RT-PCR and immunoblot analysis. Immunohistochemistry was also applied to characterize corneal heparanase in na?ve mice. RESULTS: Heparanase mRNA and protein expression were detected in uninfected corneas of C57BL/6J mice. Immunohistochemical studies indicated heparanase protein expression was primarily in the corneal epithelium before corneal infection and was also in the corneal stroma after infection. Immunohistochemical studies of uninfected and infected whole eyes of na?ve mice indicated heparanase protein expression in most layers of the retina, but the expression did not appear to be upregulated during corneal infection. Staining was most intense in the inner photoreceptor layer of the retina. CONCLUSIONS: Heparanase was constitutively expressed in both the corneal epithelium and several retinal layers before intracorneal infection with P. aeruginosa. Temporal upregulation of corneal heparanase protein expression was detected in na?ve mice during infection, most likely due to heparanase positive infiltrating cells, but the protein was not upregulated in corneas from immunized mice because they had a lower inflammatory response, associated with the restoration of corneal clarity. There did not appear to be temporal upregulation of heparanase expression in the retina of infected mice, as determined by immunohistochemistry.     

Retinal heparanase expression in streptozotocin-induced diabetic rats

Objective: Heparanase, an endoglycosidase, exhibits strong proangiogenic capacity that can induce vascular endothelial growth factor (VEGF) expression in tumour angiogenesis. The purpose of this study was to evaluate heparanase expression and its relationship with VEGF in streptozotocin (STZ)-induced diabetic rats' retinas.Design: Experimental study.Participants: STZ-induced rats and non-diabetic control rats.Methods: Heparanase expression was initially evaluated in cultured human retinal microvascular endothelial cells (HRECs) under high-glucose conditions by Western blot. Diabetes was induced in Sprague-Dawley rats by STZ intraperitoneal injection. Retinal heparanase expression was assayed in rats by immunohistochemistry. Heparanase inhibitor (phosphomannopentaose sulfate) was administrated to high-glucose-treated HRECs and diabetic rats. VEGF levels were evaluated in HRECs and retinas using enzyme-linked immunosorbent assay.Results: Heparanase expression was increased in HRECs under high-glucose conditions compared with controls (p < 0.01). Immunohistochemical studies indicated that heparanase signals were intense in the retinal vascular endothelia of diabetic rats, but faint in those of nondiabetic control rats. Quantitative analysis showed that heparanase protein expression was increased by 3.2-fold in diabetic rats' retinas compared with nondiabetic rats' retinas (p < 0.01). VEGF level was increased, as was heparanase expression, in high-glucose-treated HRECs and in the retinas of diabetic rats, and these increases were significantly decreased by phosphomannopentaose sulfate administration (p < 0.01).Conclusions: Heparanase expression was upregulated and associated with an increase of VEGF expression in STZ-induced diabetic rat retinas. The data suggest that heparanase may be involved in the development of diabetic retinopathy and represents a possible novel target for therapeutic intervention.     

氧诱导视网膜新生血管模型小鼠中ephrin A家族基因的表达

目的 观察ephrin A家族的基因是否参与氧诱导的小鼠视网膜新生血管(RNV)形成.方法 利用氧诱导新生小鼠C57BL/6J制备氧诱RNV模型,用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCT)检测ephrin A1～A5在模型组小鼠视网膜和同龄正常小鼠(对照组)视网膜中的表达.结果 ephrin A1～A5mRNA均在正常视网膜发育的某一阶段或者发育的全程表达.在模型组小鼠视网膜中,ephrin A1 mRNA的表达量相对于对照组小鼠明显上调(t=3.19,P=0.019);ephrin A2 mRNA的表达量在15日龄的模型组小鼠中相对于对照组小鼠显著上调(t=3.71,P=0.033);ephrin A3～A5 mRNA在12、13日龄的模型组小鼠视网膜中相对于对照组小鼠表达下调或者缺失,而在15日龄的模型组小鼠视网膜相对于对照组小鼠视网膜显著上调(t=3.785,P=0.002).结论 ephrin A家族的基因参与视网膜的发育和视网膜病理性血管生成等重要的生理和病理过程.     

氧诱导视网膜新生血管模型小鼠中ephrin A家族基因的表达

目的 观察ephrin A家族的基因是否参与氧诱导的小鼠视网膜新生血管(RNV)形成.方法 利用氧诱导新生小鼠C57BL/6J制备氧诱RNV模型,用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCT)检测ephrin A1～A5在模型组小鼠视网膜和同龄正常小鼠(对照组)视网膜中的表达.结果 ephrin A1～A5mRNA均在正常视网膜发育的某一阶段或者发育的全程表达.在模型组小鼠视网膜中,ephrin A1 mRNA的表达量相对于对照组小鼠明显上调(t=3.19,P=0.019);ephrin A2 mRNA的表达量在15日龄的模型组小鼠中相对于对照组小鼠显著上调(t=3.71,P=0.033);ephrin A3～A5 mRNA在12、13日龄的模型组小鼠视网膜中相对于对照组小鼠表达下调或者缺失,而在15日龄的模型组小鼠视网膜相对于对照组小鼠视网膜显著上调(t=3.785,P=0.002).结论 ephrin A家族的基因参与视网膜的发育和视网膜病理性血管生成等重要的生理和病理过程.     

氧诱导视网膜新生血管模型小鼠中ephrin A家族基因的表达

目的 观察ephrin A家族的基因是否参与氧诱导的小鼠视网膜新生血管(RNV)形成.方法 利用氧诱导新生小鼠C57BL/6J制备氧诱RNV模型,用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCT)检测ephrin A1～A5在模型组小鼠视网膜和同龄正常小鼠(对照组)视网膜中的表达.结果 ephrin A1～A5mRNA均在正常视网膜发育的某一阶段或者发育的全程表达.在模型组小鼠视网膜中,ephrin A1 mRNA的表达量相对于对照组小鼠明显上调(t=3.19,P=0.019);ephrin A2 mRNA的表达量在15日龄的模型组小鼠中相对于对照组小鼠显著上调(t=3.71,P=0.033);ephrin A3～A5 mRNA在12、13日龄的模型组小鼠视网膜中相对于对照组小鼠表达下调或者缺失,而在15日龄的模型组小鼠视网膜相对于对照组小鼠视网膜显著上调(t=3.785,P=0.002).结论 ephrin A家族的基因参与视网膜的发育和视网膜病理性血管生成等重要的生理和病理过程.     

Role of unc5b in retinal neovascularization in mice with oxygen-induced retinopathy

AIM: To explore the role of unc5b in retinal neovascularization in murine oxygen-induced retinopathy (OIR). METHODS: On postnatal 7(P7), C57BL/6J mice were exposed to 75%±2% oxygen for 5 days. On postnatal 12(P12), the mice were brought back to the room air (21% oxygen) to induce retinal neovascularization. Western blot analysis was performed to examine the temporal expression of unc5b in murine retinas. Double staining for unc5b and isolectin B4 were employed to determine the location of unc5b in murine retinas. The effect of unc5b on retinal neovascularization was evaluated by intravitreal injection of unc5b-FC in mice with OIR. Retinal neovascularization was measured by counting neovascular cell nuclei above the internal limiting membrane and by angiography of flat-mounted retinas perfused with fluorescein dextran. RESULTS: Compared to age-matched normal mice, the expression of unc5b was significantly increased in retinas of OIR mice on P17 and P21. Unc5b was apparently expressed in retinal vessels of OIR while being negative in normal retinal vessels. Retinal neovascularization in eyes injected with unc5b-FC was significantly reduced. CONCLUSION: Unc5b-FC can effectively inhibit retinal neovascularization induced by OIR. It may serve as a powerful and novel therapy for ischemia-induced retinal disease.     

精氨酸-谷氨酰胺在幼鼠早产儿视网膜病变模型中的应用(英文)

目的:观察精氨酸-谷氨酰胺(Arg-Gln)对早产儿视网膜病变动物模型视网膜新生血管的抑制作用。方法:48只7日龄的C57BL/6J新生鼠暴露在750mL/L高氧环境中5d,然后回到正常空气中建立早产儿视网膜病变的动物模型。在鼠龄12d时实验组(36只)新生鼠每天两次腹腔注射Arg-Gln(剂量分别为1.0,3.0,5.0g/kg,每组12只),连续注射5d;对照组(12只)每天两次腹腔注射PBS,连续5d。所有小鼠均于17d处死,视网膜铺片,ADP酶染色观察视网膜血管情况。HE染色,在光学显微镜下观察并计数突破视网膜内界膜的血管内皮细胞细胞核数目。Real-time RT-PCR方法测量每组视网膜VEGF mRNA水平。结果:与对照组相比,实验组以剂量依赖方式无灌注区面积和新生血管团逐渐减少;实验组中最大剂量组[5.0g/(kg·d)]突破内界膜的内皮细胞细胞核数目比对照组大约减少75%(P<0.01);实验组视网膜VEGF mRNA水平与对照组相比明显下降。结论:Arg-Gln能够有效抑制早产儿视网膜病变动物模型视网膜新生血管的生成,可能为临床提供一种预防和治疗早产儿视网膜病变安全有效的新方法。     

高氧诱导小鼠视网膜新生血管模型中端粒酶逆转录酶的表达变化

目的 研究高氧诱导视网膜新生血管模型中小鼠端粒酶逆转录酶(TERT)基因表达水平是否有变化,为进一步研究视网膜新生血管疾病的预防和治疗提供新的靶点.方法 实验研究.选取7 d龄C57BL/6J新生小鼠32只,分高氧组和对照组,每组16只.高氧组小鼠以密闭氧箱内以75%±2%氧浓度饲养5 d后置于正常氧浓度环境中,正常对照组小鼠于正常氧环境中饲养.于小鼠生后12、14及19 d时分别取高氧组和对照组小鼠各2只(4只眼),经尾静脉行2%伊文思蓝溶液灌注并做视网膜铺片,荧光显微镜下观察视网膜新生血管的形成情况.高氧模型组和正常对照组生后19 d幼鼠3只,行HE染色,光学显微镜下观察视网膜血管形态,观察突破内界膜的内皮细胞核数.取生后19 d高氧组和对照组小鼠,分别取其视网膜组织并提取总RNA,反转录成cDNA后行反转录PCR,2%琼脂糖凝胶电泳并照相.提取视网膜总RNA,反转录成cDNA后(同RT-PCR),配制荧光定量实时PCR反应体系(总计20μl),在60℃检测荧光信号,分析图像.分别取高氧模型组和正常对照组P19小鼠行眼球切片,常规处理后TERT抗体孵育37℃ 60 min,HRP酶标二抗孵育30 min,DAB显色,中性胶封片,镜下观察并照相.结果高氧诱导模型小鼠牛后12 d眼底后极部出现大片无灌注区,生后14 d眼底后极部出现新牛血管迂曲、渗漏等视网膜血管病变.生后17～19 d视网膜新生血管形成达到高峰.正常小鼠视网膜组织切片HE染色基本看不剑突出内界膜的血管芽及血管管腔,内界膜下视网膜内的血管内皮细胞核散在分布、数量较少;高氧组见大量突出内界膜伸向玻璃体腔的血管管腔及血管芽,内界膜下视网膜内也有大量血管内皮细胞增生.19 d高氧模型组小鼠视网膜TERT及bFGF mRNA表达较同日龄正常对照组小鼠明显提高,二者差异有统计学意义(F=8.575,5.667;P＜0.05).生后19 d实时PCR检测高氧模型组小鼠视网膜TERT mRNA表达较同日龄正常对照组小鼠明显上调,差异有统计学意义(F=173.104,P＜0.05).生后19 d高氧诱导小鼠视网膜新生血管模型中视网膜新生血管TERT表达阳性,同日龄对照组新生小鼠视网膜血管TERT表达阴性.结论高氧诱导视网膜新生血管小鼠模型中端粒酶逆转录酶和新生血管形成相关因子表达水平明显上调,可能会成为视网膜新生血管疾病预防和治疗的新靶点.(中华眼科杂志,2009,45:199-205)     

NADPH氧化酶在rd小鼠遗传性视网膜变性中的活化表达

背景研究表明,小胶质细胞中烟酰胺二磷酸腺苷（NADPH）氧化酶的活化在中枢神经系统神经元损伤及神经变性疾病中发挥重要作用。已有研究证实NADPH氧化酶在rd小鼠视锥细胞退行性改变中的作用,但关于其在rd小鼠视网膜变性早期视杆细胞病变过程中的作用研究较少。目的研究NADPH氧化酶在rd小鼠感光细胞凋亡过程中的活化表达,探讨其在遗传性视网膜变性中的致病作用。方法取出生后8、10、12、14、16、18d的rd小鼠各18只,过量麻醉法处死后提取视网膜总RNA和总蛋白,并制备视网膜切片,分别用实时荧光定量PCR及Western blot法测定在rd小鼠感光细胞凋亡过程中视网膜中NADPH氧化酶亚单位gp91phox mRNA及蛋白的定量表达变化;采用免疫组织化学及gp91phox和CD11b免疫荧光双染法确定gp91phox在不同鼠龄rd小鼠视网膜中的表达及定位,并与其近交系C57BL／6N小鼠进行比较。结果实时荧光定量PCR研究证实,C57BL／6N小鼠视网膜中未见gp91phox mRNA的表达,而生后8d的rd小鼠视网膜中即有少量gp91phox mRNA的表达,随着鼠龄的增加,gp91phox mRNA表达量（gp91phox mRNA／β-actin）逐渐增加,生后14d达到高峰。不同鼠龄rd小鼠视网膜中gp91phox mRNA表达量差异有统计学意义（F=17．81,P=0．00）;生后10、12、14、16、18d的Td小鼠视网膜中gp91phox mRNA表达量均明显高于出生后8d小鼠,差异均有统计学意义（均P〈0．05）,以出生后14d表达量最高,为1．136±0．370。随着小鼠鼠龄的增加,视网膜中gp91phox蛋白表达量（A值）与其基因表达变化趋势一致,不同鼠龄及C57BL／6N对照小鼠间视网膜中gp91phox蛋白表达的差异有统计学意义（F=354．00,P〈0．01）,不同鼠龄rd小鼠出生后视网膜中gp91phox蛋白表达量均明显高于C57BL／6N对照小鼠,差异均有统计学意义（均P〈0．05）。免疫组织化学法检测表明,rd小鼠出生后10d视网膜内层gp91phox阳性细胞开始增多,出生后14d达到高峰,外核层也可见到gp91phox阳性细胞。免疫荧光双染结果显示,gp91phox与小胶质细胞标志物CD11b共表达,呈现橙色荧光。结论NADPH氧化酶在rd小鼠视网膜中的表达随着鼠龄的增长而增多,其表达与小胶质细胞活化及感光细胞的凋亡相平行,提示NADPH氧化酶可能在小胶质细胞活化导致的感光细胞凋亡中发挥致病作用。     

高氧诱导小鼠视网膜病变模型中血管内皮生长因子和色素上皮衍生因子的表达及意义

目的 研究高氧诱导小鼠视网膜病变模型中血管内皮生长因子(VEGF)和色素上皮衍生因子(PEDF)的表达和意义,并探讨两者在视网膜新生血管形成过程中的作用.方法 对照实验研究.对新生C57BL-6N系小鼠给予高氧后,置相对低氧环境中饲养,诱导产生视网膜新生血管.在小鼠生后第12、14及17天摘除眼球,通过逆转录聚合酶链反应和免疫印迹法及荧光素灌注造影,分别检测不同时间点全视网膜新生血管组织对VEGF与PEDF的mRNA和蛋白质的表达水平的差异,并观察视网膜新生血管的分布与形态变化,通过血管内皮细胞计数对新生血管进行量化.应用SPSS11.5统计学软件,采用析因设计方差分析,分别比较实验组与对照组mRNA与蛋白质表达水平的差异,以P<0.05作为差异有统计学意义.结果 在高氧环境中(出生第12天小鼠),OIR模型鼠VEGF蛋白质表达A值(0.47±0.12)较正常鼠(1.81±050)下降,PEDF蛋白质表达A值(5.35±0.94)较正常鼠(0.68±0.17)明显升高;而相对低氧环境中(出生第14和17天小鼠),VEGF蛋白质表达A值(2.15±0.46,5.49±0.97)较正常鼠(0.90±0.05,0.88±0.91)明显升高,PEDF蛋白质表达A值(2.07±0.35,1.37±0.48)较正常鼠(2.62±0.68,5.30±0.59)明显下降,尤以第17天下降显著.对不同时间点VEGF和PEDF蛋白质表达水平进行析因方差分析,结果显示各时间点的VEGF蛋白质表达水平差异有统计学意义(F=70.450,P=0.000),各时间点的PEDF蛋白质表达水平差异有统计学意义(F=160.237,P=0.000).出生第12、14及17天小鼠视网膜VEGF蛋白质的表达与正常对照组比较,差异有统计学意义(P=0.009,0.010,0.000),PEDF蛋白质的表达差异也有统计学意义(P=0.002,0.046,0.000);出生第12、14及17天小鼠视网膜VEGF mRNA的表达与正常对照组比较,差异有统计学意义(P=0.001,0.000,0.001),PEDF mRNA的表达差异也有统计学意义(P=0.000,0.001,0.000).伴随着视网膜组织的缺氧,出现了VEGF蛋白质表达水平升高和PEDF蛋白质表达水平降低,导致视网膜组织中VEGF与PEDF蛋白质表达失衡;VEGF与PEDF的mRNA表达亦发生类似变化,且较蛋白质改变提前发生.上述改变均伴随着同期视网膜新生血管的发生、发展及其严重程度而逐渐加重.结论 VEGF和PEDF的mRNA和蛋白质表达失衡可能足造成视网膜新生血管发生的机制之一.(中华眼科杂志,2008,44:734-740)