核因子кB在人角膜基质细胞中的表达

目的 探讨核因子кＢ（ＮＦ－кＢ）在人角膜基质成纤维细胞中的基础表达及激活情况。方法 取体外培养的第２或３代人角膜基质细胞,同步化后分为２组：无血清的ＤＭＥＭ液培养的不加药组;含质量浓度为１０μｇ／ｍｌ脂多糖的ＤＭＥＭ液培养６小时的加药组。均采用免疫荧光抗体染色、流式细胞仪计数法和核蛋白提取物凝胶迁移率法检测。结果 流式细胞计数法示,角膜基质细胞内ＮＦ－кＢ的基础表达率为９．４％,脂多糖作用后升高     

角膜基质细胞研究进展

角膜基质细胞,存在于角膜基质层中,在正常情况下,处于静止状态。但当角膜损伤时,不同上皮来源的因子及环境信号,将影响角膜基质细胞的应答反应,决定着角膜能否完全被修复或形成角膜瘢痕。本文就角膜基质细胞的分布、形态、受激后的应答反应情况及与角膜疾病的关系作一综述。     

重视角膜基质细胞的作用

位于角膜基质胶原纤维板层之间的角膜基质细胞处于静息状态,可以分泌胶原以及硫酸角质素,对角膜透明性的维持发挥着重要作用。当角膜受到损伤时,角膜基质细胞可发生凋亡,向成纤维细胞以及肌成纤维细胞等修复细胞表型转化,进而促进细胞再生,诱导角膜纤维瘢痕形成。此外,大量角膜基质细胞还具有干细胞特性。目前已知角膜基质细胞是多种机体功能的积极参与者,应重视角膜基质细胞的作用。     

核因子NF-κB在细菌内毒素诱导的实验性角膜基质炎中的表达

目的 :明确在细菌内毒素 (L PS)诱导的角膜基质炎中是否存在转录调节因子 -核因子 NF-κB的活化表达。方法 :青年 Wistar大鼠右眼及左眼分别给予细菌内毒素 L PS (4μg·μ1- 1 )及其溶剂 -灭菌 PBS各 10μl角膜内注射。注射后分别于 1小时、 3小时、6小时、 1天、 3天及 7天处死动物。每只角膜标本分为 2份 ,一份行石蜡切片病理学检查 ,一份行冰冻切片进行免疫组织化学分析。结果 :病理学检查 :L PS注射后 1小时即可见角膜缘血管内有炎症细胞聚集 ,随时间延长 ,中央角膜基质区域炎症细胞浸润明显 ,基质水肿 ,部分基质细胞溶解坏死 ,被巨噬细胞吞噬 ,至第 3～ 7天中周边基质内有新生血管生成 ,基质水肿渐减轻 ,细胞外胶原排列紊乱 ,呈典型的角膜基质炎的病理改变。免疫组化检查 :L PS注射后 1小时即出现 NF- κB阳性细胞 ,表现为部分基质细胞核内染色阳性 ,染色强度以 3小时和 6小时为最强 ,随时间延长逐渐减弱 ,至 7天时几乎无阳性细胞。结论 :核因子 NF-κB在实验性角膜基质炎早期存在活化表达。NF- κB在细胞核内出现 ,可能通过与相应致炎基因的启动子与增强子结合 ,促进相关基因的转录 ,从而在角膜基质炎中起到重要作用     

核转录因子NF-κB在角膜新生血管中的表达

致盲性角膜病常伴角膜新生血管，严重影响视力，治疗非常棘手。研究表明，多种促血管生成因子如血管内皮生长因子(vascular endotllelial growth factor，VEGF)、白细胞介素1(IL-1)等均受核转录因子(nuclear factor kappa B，NF-κB)的调控。通过建立大鼠角膜新生血管模型，我们探讨NF-κB在角膜新生血管形成过程中的作用及其机制。     

姜黄素对角膜基质细胞纤维化的抑制作用

背景角膜的创伤或手术可导致角膜基质细胞纤维化,进而形成瘢痕。研究表明姜黄素可明显减轻组织的纤维化程度,但姜黄素是否会影响角膜基质细胞纤维化的研究尚少。目的观察不同质量浓度的姜黄素对小鼠角膜基质细胞向成纤维细胞转化过程的影响,探讨姜黄素抗角膜基质纤维化的作用。方法150只6～8周龄BALB／c小鼠,分离角膜基质细胞并在含质量分数10％胎牛血清（FBS）的DMEM中进行培养,以原代角膜基质细胞重悬于DMEM中并分为5组：（1）空白对照组（DMEM＋10％FBS,含质量分数1％。DMSO,CG组）。（2）低剂量组（CG＋7．5mg／L姜黄素组）。（3）中剂量组（CG＋10mg／L姜黄素组）。（4）高剂量组（CG＋12．5mg／L姜黄素组）。（5）无诱导剂组（DMEM,含1％oDMSO）。上述因素干预7d后,用逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）法检测各组中细胞表型keratocan、醛脱氢酶（ALDH）、CD90、decorin、fibronectin一1的表达。用MTS法检测姜黄素对角膜基质细胞增生的影响。制备小鼠角膜冰冻切片,采用免疫荧光技术检测角膜基质细胞内fibronectin-1的表达。结果原代培养的角膜基质细胞呈梭形,为细胞质丰富且核大的角膜基质成纤维细胞。随着姜黄素质量浓度的增加,角膜基质细胞中keratocanmRNA、ALDHmRNA的表达量增加,CD90mRNA和decorinmRNA的表达量减少,差异均有统计学意义（P〈O．05）,fibronectin-1mRNA的表达变化差异无统计学意义（P〉0．05）。MTS法检测发现,随着姜黄素质量浓度的增加,对角膜基质细胞增生的抑制率逐渐增加（F=956．00,P〈0．05）。免疫荧光技术检测发现角膜基质细胞中fibronectin-1的表达呈红色荧光。结论姜黄素对离体小鼠角膜基质细胞纤维化有明显的抑制作用,可减轻角膜基质创伤修复过程中的过度纤维化。     

体外培养人角膜基质细胞ICAM-1的表达及调节

目的 探讨细胞间附分子－１（ＩＣＡＭ－１）在角膜基质细胞中表达,以及炎症介质对其表达的调节作用。方法 采用细胞培养、免疫细胞化学和流式细胞技术、观察人角膜基质细胞ＩＣＡＭ－１的表达及脂多糖（ＬＰＳ）和干扰素－γ（ＩＦＮ－γ）对此表达的影响。结果 体外２的基质中基础表达一定量的ＩＣＡＭ－１、ＬＰＳ和ＩＦＮ－γ可上调其表达水平至基础表达的１．４－４．６倍。结论角膜炎症反应中,炎症介质促进基质细胞表达Ｉ     

蛋白激酶Cα在人角膜基质细胞中的表达

目的 观察蛋白激酶Ca（PKCα）在原位及体外培养的人角膜基质细胞中的表达。方法标本来源于北京大学第一医院眼库。人角膜基质细胞体外原代及传代培养，应用免疫组织化学法检测PKCα在培养的人角膜基质细胞中的表达；制作人正常角膜组织冰冻切片，观察PKCα在角膜基质细胞中的表达。结果免疫组织化学法检测显示：正常人原位角膜基质细胞对PKCα无明显表达，而体外培养的人角膜基质细胞有明显阳性表达。结论特殊的角膜创伤模型——体外培养人角膜基质细胞中PKCα有明显阳性表达，提示PKC在角膜基质细胞增生过程中扮演了重要角色，抑制PKC的活性有可能成为治疗角膜瘢痕愈合的一个新途径。     

核转录因子κB在角膜生理病理过程中的作用

核转录因子κB（NF-κB）对炎症、免疫反应、细胞的增殖、分化和凋亡等方面的基因表达起着关键性的调控作用。在角膜的生理和病理过程中,NF-κB调控着角膜上皮细胞的发育,对角膜的不同细胞可发挥抗凋亡或促凋亡的作用,与角膜透明性和固有免疫防御的建立息息相关,参与了角膜炎症反应和新生血管形成等过程。     

细菌脂多糖及糖皮质激素对角膜基质成纤维细胞Toll样受体表达的影响

目的 通过研究细菌脂多糖（LPS）对人角膜基质成纤维细胞（HCF）Toll样受体（TLR）表达的影响,以及糖皮质激素对这种影响的调控作用,探讨TLR及糖皮质激素在角膜细菌感染中的可能作用.方法 选取人供体角膜细胞,对其进行分离、培养和鉴定,通过RT-PCR及quantitative Real-time PCR检测角膜基质成纤维细胞中TLR在mRNA水平的表达;并在细胞培养液中加入3种浓度LPS（1、10、100 ng/ml）共培养,检测TLR的表达.在此基础上,选择在10 ng/ml LPS的细胞培养液中加入糖皮质激素氢化可的松（1、10、100 μg/ml）进行干预,并通过Real-time PCR检测此种情况下HCF中TLR的表达.再通过免疫荧光组化来检测TLR2、TLR4在蛋白水平的表达.各组数据的差异性采用Student t检验和非参数秩和检验,Real-time PCR的倍数间的比较采用非参数统计.结果 TLR1-10 mRNA在HCF中均有表达,且表达量各不相同,其中TLR2、TLR4、TLR5、TLR7、TLR8、TLR10呈高表达.LPS能增加HCF中TLR mRNA的表达,且当LPS为10 ng/ml时,TLR的表达量最高.加入氢化可的松干预后,随着激素浓度的增加,HCF中TLR mRNA的表达却随激素浓度的增高而下降.免疫荧光组化结果显示,在10 ng/ml LPS刺激、10 ng/ml LPS＋10 μg/ml氢化可的松共同刺激以及正常条件培养3种情况下,TLR2、TLR4在HCF内均有表达,且强度不同,趋势与分子水平的表达一致.结论 TLR1～10 mRNA在HCF中均有表达.LPS能改变角膜基质成纤维细胞TLR mRNA的表达,提示该细胞表达的TLR与角膜抵御细菌的固有免疫密切相关;糖皮质激素可以调控LPS刺激的HCF TLR的表达,即对LPS刺激的HCF TLR的表达表现出抑制;提示当细菌的侵袭突破角膜上皮到达基质时,糖皮质激素起到了免疫抑制的作用.     

大鼠角膜碱烧伤后碱性成纤维细胞生长因子在角膜中的表达及意义

目的 探讨大鼠角膜碱烧伤后成纤维细胞生长因子（bFGF）在角膜中的表达和意义。方法 采用碱烧伤大鼠角膜建立角膜炎症性新生血管动物模型；免疫印迹法检测大鼠角膜碱烧伤后不同时间段bFGF在角膜中的表达；免疫组织化学方法检测大鼠角膜碱烧伤后bFGF在角膜不同组织层次的表达。结果 免疫印迹法检测显示：去除上皮后的正常大鼠角膜无bFGF表达；碱烧伤后96h，大鼠角膜可检测出bFGF表达，随着时间进展，bFGF蛋白表达量逐渐增加。免疫组化结果：正常大鼠角膜上皮层表达bFGF；碱烧伤后角膜上皮层bFGF着染程度逐渐增强，在碱烧伤后48h以前，基质层浸润的炎症细胞无bFGF着染，96h以后，浸润的炎症细胞和新生血管内皮细胞均呈bFGF阳性。结论 bFGF未参与碱烧伤后角膜新生血管增殖的早期诱导，对角膜炎症性新生血管的增殖仅起到后续支持作用。     

脱细胞猪角膜基质体外支持皮肤细胞生长的实验研究

目的 探讨脱细胞猪角膜基质体外是否支持皮肤细胞的生长.方法 制备脱细胞猪角膜基质(前期实验已完成).体外培养人皮肤表皮细胞和成纤维细胞,取第3代人皮肤成纤维细胞接种在脱细胞猪角膜基质的中间基质面,培养3 d后,将材料翻转,取第3代人皮肤表皮细胞接种在材料的上皮面上,再培养10 d后,取细胞-支架复合体制作石蜡切片,HE染色后光镜下观察.结果 组织学观察显示皮肤的表皮细胞和成纤维细胞体外均可在脱细胞猪角膜基质上黏附生长.接种10 d后,皮肤表皮细胞在材料表面形成复层结构,可见角化的细胞.接种13 d可见成纤维细胞存活并在支架层间生长.结论 脱细胞猪角膜基质有良好的细胞相容性,在体外能支持皮肤细胞的生长和增生.     

兔角膜成纤维细胞结缔组织生长因子的表达

角膜发生炎性损伤或机械损伤时，角膜基质细胞增生活化为角膜成纤维细胞，在角膜损伤修复过程中起着极其重要的作用，该过程涉及一系列复杂的细胞因子的参与，其中的机制尚未完全阐明。结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)是一类新近发现的多肽生长因子，是创伤处组织修复再生过程的主要调节因子。我们通过测定体     

微型角膜刀法与乙醇浸润法准分子激光角膜上皮瓣下磨镶术对角膜基质细胞影响的实验研究

目的探讨微型角膜刀法准分子激光角膜上皮瓣下磨镶术（Epi-LASIK）与乙醇浸润法准分子激光角膜上皮瓣下磨镶术（LASEK）对角膜基质细胞的影响研究。方法50只新西兰大白兔随机编号,其中48只（96只眼）随机一只眼行Epi-LASIK,另一只眼行LASEK,余2只（4只眼）未进行手术,作为对照组。采用核苷酸末端转移酶介导的dUTP缺口标记（TUNEL）法观察角膜基质细胞的凋亡情况、Ki-67和d平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的免疫组化和免疫印迹法测定角膜组织d-SMA蛋白来观察角膜基质细胞的增殖与向肌成纤维母细胞转化情况,进行计数与半定量分析,对haze形成影响进行分析。结果Epi-LASIK与LASEK术后角膜基质中均有较多的TUNEL阳性细胞出现,在术后24h达最高峰,LASEK术后1周内细胞凋亡情况较Epi-LASIK明显（t=3．63、7．80、4．34、2．95,均P〈0．01）。术后1周基质Ki-67阳性细胞表达增高,72h时达高峰,两组在1周内差异有统计学意义（t=3．81、5．85、5．09、5．59,均P〈0．01）。α-SMA阳性细胞在术后1周明显出现,3个月时仍有较高表达,在术后1个月时阳性细胞数达高峰,α-SMA蛋白表达量的情况与α-SMA阳性细胞数变化一致,均提示LASEK术后增高的情况较Epi-LASIK差异有统计学意义（t=2．97、7．19、6．73,均P〈0．01）。结论Epi-LASIK较LASEK有着更少的角膜基质细胞凋亡、更弱的增殖以及向肌成纤维母细胞的转化,提示Epi-LASIK较LASEK有着更轻的haze反应几率。     

核因子NF-KB在细菌内毒素诱导的实验性角膜基质炎中的表达

目的明确在细菌内毒素(LPS)诱导的角膜基质炎中是否存在转录调节因子一核因子NF-кB的活化表达.方法青年Wistar大鼠右眼及左眼分别给予细菌内毒素LPS(4μg@μ1-1)及其溶剂灭菌PBS各10μl角膜内注射.注射后分别于1小时、3小时、6小时、1天、3天及7天处死动物.每只角膜标本分为2份,一份行石蜡切片病理学检查,一份行冰冻切片进行免疫组织化学分析.结果病理学检查LPS注射后1小时即可见角膜缘血管内有炎症细胞聚集,随时间延长,中央角膜基质区域炎症细胞浸润明显.基质水肿,部分基质细胞溶解坏死,被巨噬细胞吞噬,至第3～7天中周边基质内有新生血管生成,基质水肿渐减轻,细胞外胶原排列紊乱,呈典型的角膜基质炎的病理改变.免疫组化检查LPS注射后1小时即出现NF-кB阳性细胞,表现为部分基质细胞核内染色阳性,染色强度以3小时和6小时为最强,随时间延长逐渐减弱,至7天时几乎无阳性细胞.结论核因子NF-кB在实验性角膜基质炎早期存在活化表达.NF-кB在细胞核内出现,可能通过与相应致炎基因的启动子与增强子结合,促进相关基因的转录,从而在角膜基质炎中起到重要作用.     

碱性成纤维细胞生长因子治疗兔角膜上皮及基质损伤的实验研究

目的 通过动物实验探讨碱性纤维细胞生长因子对角膜上皮细胞、基质细胞损伤的治疗作用。为受损角膜的愈合提供一条新的、有效的途径。方法 将２４只兔全麻下切除角膜前板层,直径８ｍｍ,约１／３角膜厚度。将其随机分为３组,分别滴生理盐水,０．１μｇ／ｍｌ及１．０μｇ／ｍｌ碱性成纤维细胞因子溶液。术后定期用计算机图像处理系统测量角膜损伤后愈合面积,并用放射自显影方法观察角膜基质细胞生长及分布情况。结果 术后１～     

核转录因子抑制剂对脂多糖诱导角膜基质细胞分泌细胞因子的影响

目的探讨二硫代氨基甲酸吡咯烷（PDTC）对绿脓杆菌脂多糖（LPS）诱导的人角膜基质细胞核因子κB（NF—κB）活化与细胞因子释放的干预作用及其机制。方法为实验研究。原代培养人眼角膜基质细胞（HCFs）,选取生长良好的传代HCFs分为对照组、LPS刺激组及PDTC预处理组。LPS组给予单纯LPS刺激,PDTC预处理组则在LPS刺激前先加PDTC培养30min,再给予相同浓度的LPS。在LPS刺激1、2、4及8h时,分别收集各组细胞和上清液,Western blot检测HCFs NF—κB的活化表达;酶联免疫吸附实验（EHSA）检测HCFs培养上清液中自细胞介素6（IL-6）和IL-8的分泌情况;逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）检测HCFs IL-6和IL-8 mRNA的表达。结果与对照组相比较,LPS刺激后,HCFs胞核NF—κB p65的表达明显升高,HCFs中IL-6与IL-8蛋白的分泌和mRNA的表达均显著升高。PDTC预处理30min后再给予LPS刺激,可部分抑制HCFs胞核中NF—κB p65的活化表达（t1h=9．3766,t2h=15．9011,t4h=12．5851,t8h=10．8346;均P〈0．01）;PDTC预处理可不同程度的下调LPS诱导的HCFs分泌IL-6、IL-8蛋白及IL-6、IL-8 mRNA的表达,二者均明显低于同时间点LPS组HCFs的表达,差异均有统计学意义（IL-6蛋白：t1h=7．9154,t2h=10．8630,t4h=8．2451,t8h=13．5063;IL-8蛋白：t1h=8．5663,t2h=20．5169,t4h=25．1580,t8h=34．8699;IL-6 mRNA：t1h=12．0235,t2h=13．2894,t4h=24．0799,t8h=27．2261;IL-8 mRNA：t1h=20．9424,t2h=24．1314,t4h=29．8580,t8h=47．9442;均P〈0．01）。结论绿脓杆菌LPS可引起HCFs NF—κB活化,促进细胞因子的表达,PDTC可部分抑制LPS对NF-κB的激活,下调相应细胞因子的表达。（中华眼科杂志,2008,44：6146）     

α-SMA在PRK和LASIK术后角膜成纤维细胞中的表达

目的通过检测角膜肌成纤维细胞(MFB)特征性标志α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达,探讨PRK和LASIK后早期角膜细胞的增生情况以及对角膜透明度的影响。方法新西兰白兔24只,随机分为两组,每组12只:A组,右眼行PRK手术,左眼为正常对照;B组,右眼行LASIK手术,左眼为正常对照。分别于术后3、10、20、35d取兔眼角膜,部分行光镜和电镜观察;另一部分用于免疫组织化学研究,检测成纤维细胞骨架的特征性标志α-SMA的表达,并计数成纤维细胞活化数量。结果PRK组术眼上皮细胞增生明显,成纤维细胞数量增多,基质浅层胶原纤维排列紊乱,上皮下α-SMA表达明显,表达量与上皮增生数量有关。LASIK组术眼仅角膜瓣周边区域上皮增生,基质层胶原纤维排列无明显紊乱,少量活化的成纤维细胞,角膜瓣边缘可见α-SMA表达。两组中的非手术眼均未见α-SMA表达。结论PRK去除了角膜上皮及前弹力层,术后上皮及浅基质层细胞增生明显,成纤维细胞活化增殖,新生胶原排列不规则,是导致角膜透明度下降的原因。LASIK术后角膜结构的完整性保持较好,除角膜瓣边缘外,其余部位无明显上皮增生,成纤维细胞活化数量少,手术区界面组织增生轻微,术后角膜保持透明。     

角膜碱烧伤中白介素-1与核转录因子κB表达的相关性研究

目的观察白细胞介素-1α（IL-1α）与核转录因子KB（NF-κB）在角膜碱烧伤中的表达变化及相关性，探讨其对角膜碱烧伤损伤修复的影响。方法制作大鼠碱烧伤模型，裂隙灯显微镜与病理组织学观察角膜炎症反应。应用western-blot测定角膜中NF-κB的表达；应用酶链免疫吸附实验（ELISA）测定IL-1d的表达。结果碱烧伤角膜炎症反应随时间延长而加重，第7d开始溃疡形成，21d左右趋于稳定。活化的NF-κB表达量与IL-1α质量浓度在碱烧伤后早期显著增加，伤后3d达到高峰，7d后回落，14dR至正常水平。相关性分析显示，角膜碱烧伤后IL-1质量浓度与NF-κB表达量为正相关，相关系数为0．808（P〈0．01）。结论 角膜碱烧伤后早期，NF-κB显著活化，提高IL-1α的表达，在角膜碱烧伤损伤机制中起着重要作用。