整合素连接激酶反义寡核苷酸对卵巢上皮性癌细胞生长的抑制作用

目的 探讨整合素连接激酶(ILK)反义寡核苷酸(ASODN)对卵巢上皮性癌(卵巢癌)细胞生长的抑制作用.方法 将ILK-ASODN转染入卵巢癌细胞株H08910细胞,阻断其表达ILK.实验分为6组,分别为空白对照组(A组)、脂质体对照组(B组)、ILK-正义寡核苷酸(SODN)100 nmol/L组(C组)和ILK-ASODN 60 nmol/L组(D组)、ILK-ASODN 80 nmol/L组(E组)、ILK-ASODN 100 nmol/L组(F组).采用RT-PCR技术和蛋白印迹法检测各组H08910细胞ILK mRNA和蛋白表达量的变化;水溶性四氮唑1(WST-1)法及流式细胞术评价H08910细胞转染ILK-ASODN后对该细胞体外增殖的抑制作用及对该细胞周期和凋亡的影响.结果 ILK-ASODN转染后H08910细胞ILK mRNA表达量明显下降,D、E、F 3个实验组分别为0.307±0.011、0.198±0.008、0,与A、B两对照组(分别为0.343±0.006、0.342±0.009)比较,差异均有统计学意义(P＜0.05).ILK-ASODN转染后H08910细胞ILK蛋白表达量也明显下降,D、E、F 3个实验组分别为26.3±0.8、20.6±0.4、0;细胞生长受到明显抑制,细胞凋亡率明显增高,3个实验组分别为7.31%、8.84%、11.27%;G0/G1期细胞增多,3个实验组分别为49.25%、56.28%、67.61%.以上指标分别与A、B组比较,差异均有统计学意义(P＜0.01).结论 ILK-ASODN转染卵巢癌H08910细胞后可以明显抑制其生长.     

端粒酶RNA反义核酸联合其催化亚单位反义核酸对子宫颈癌Hela细胞生长的抑制作用

目的　探讨端粒酶RNA反义核酸 (反义hTR)联合端粒酶RNA催化亚单位反义核酸(反义hTERT) ,对宫颈癌Hela细胞生长的抑制作用及作用机理。方法　实验分为空白对照、脂质体对照、正义hTR、正义hTERT、反义hTR、反义hTERT及反义hTR +反义hTERT组。分别采用四甲基偶氮唑蓝 (MTT)法、PCR 端粒重复序列扩增 (TRAP) 酶联免疫吸附实验 (ELISA)、吖啶橙染色法、流式细胞术检测宫颈癌Hela细胞转染反义hTR和反义hTERT后细胞的增殖、端粒酶活性及细胞形态学、细胞凋亡和细胞周期阻滞的变化。结果　宫颈癌Hela细胞转染端粒酶反义核酸后 ,出现明显的细胞增殖抑制、端粒酶活性下降、细胞凋亡形态学改变、细胞凋亡率升高及细胞周期阻滞。反义hTR、反义hTERT组与空白对照、脂质体对照及正义hTR、正义hTERT组比较 ,差异有统计学意义 (P <0 0 1)。Hela细胞转染反义核酸 (0 2 μmol/L) 3d后 ,反义hTR +反义hTERT组 ,细胞增殖抑制率、相对端粒酶活性 (相对于空白对照组 )、细胞凋亡率分别为 6 9 3%、19 6 %、2 8 6 % ,与反义hTR组和反义hTERT组比较 ,差异均有统计学意义 (P <0 0 1) ,Q值分别为 0 86 7、0 919、1 0 75。反义hTR +反义hTERT组G0 /G1期细胞比例增加。结论　端粒酶反义核酸能通过特异性抑制端粒酶活性、诱导细     

人端粒酶催化亚基基因反义寡核苷酸对卵巢癌细胞端粒酶活性及细胞生长的影响

目的：探讨人端粒酶催化亚基（hEST2)基因反义寡核苷酸（AODN）对卵巢 癌细胞系SKOV3、COC1细胞端粒酶活性及细胞生长的影响。方法：分别采用逆转录聚酶链反应技术、端粒重复扩增法、四甲基偶氮唑蓝法、 绘制细胞生长曲线的方法检测hEST2基因AODN转染前后SKOV3、COC1细胞hEST2 mRNA表达、端粒酶活性的变化,以及对细胞增殖能力及细胞生长的影响。结果：hEST2基因AODN能够下调SKOV3、COC1细胞hEST2 mRNA的表达,降低端粒酶活性,抑制细胞的生长,作用具有明显的时效性。以浓度为30μmol／L的AODN治疗48h的作用最显著,SKOVE、COC1细胞hEST2 mRNA的表达分别下降54．6％、44．6％,对两 株细胞的端粒酶活性抑制率分别达到47．9％、42．7％,与相同浓度的随机寡核苷酸（RODN）、正义寡核苷酸（SODN） 相比,差异有显著性（P＜0．05)。结论：hEST2基因的反义治疗能够抑制卵巢癌细胞的增殖能力,该基因有望成为卵巢治疗的新方向。     

miR-101诱导上皮性卵巢癌细胞SKOV3凋亡及其与细胞内Ca~(2+)水平关系的研究

目的:研究microRNA-101(miR-101)对上皮性卵巢癌细胞SKOV3诱导凋亡的作用,并探讨凋亡发生与细胞内Ca~(2+)浓度的关系。方法:采用阳离子脂质体为载体将miR-101 mimics转染SKOV3细胞,随机分为空白对照组、miR-101 NC组和miR-101转染组;实时定量RT-PCR法检测细胞中miR-101表达量;流式细胞术检测细胞凋亡及细胞内Ca~(2+)浓度;Western blot法检测凋亡相关蛋白caspase-3表达。结果:实时定量RT-PCR检测结果显示,miR-101转染组的miR-101表达(5.302±0.069)较空白对照组(1.038±0.036)和miR-101 NC组(1.126±0.062)分别上调了5.10倍和4.70倍(F=5326.276,P=0.000)。流式细胞术检测结果显示,miR-101转染组的细胞凋亡率、细胞内Ca~(2+)浓度分别为(66.36±13.54)%和(228.94±19.51)nmol/L,较空白对照组[(40.60±5.97)%,(62.91±7.73)nmol/L]和miR-101 NC组[(41.54±3.89)%,(59.09±10.66)nmol/L]明显增加,差异有统计学意义(P=0.019);Western blot结果显示,miR-101转染组的细胞凋亡相关蛋白caspase-3表达(1.325±0.052)较空白对照组(0.817±0.073)和miR-101 NC组(0.820±0.062)增加,差异有统计学意义(P=0.000)。结论:miR-101过表达具有诱导上皮性卵巢癌细胞SKOV3凋亡的作用,其诱导凋亡与细胞内Ca~(2+)浓度增加有关。     

抑制mdr1基因对人宫颈癌细胞放射敏感性影响的实验研究

目的:探讨用反义技术抑制癌基因mdr1对宫颈癌细胞(HeLa)放射敏感性的影响。方法:设空白组、mdr1正义寡核苷酸组和脂质体组(仅加入等量的脂质体)为对照组以及mdr1反义寡核苷酸组,用RT-PCR检测宫颈癌细胞处理前后mdr1表达水平的变化。用集落形成试验检测各实验组照射后人宫颈癌HeLa细胞株集落形成率,AO/EB荧光染色法检测细胞凋亡率的变化,流式细胞仪测定Bcl-2蛋白的表达。结果:mdr1反义寡核苷酸能有效地抑制mdr1癌基因的表达,经脂质体介导的mdr1反义寡核苷酸作用的宫颈癌细胞经60Coγ射线照射后其集落形成率较正义寡核苷酸组及单纯照射组明显下降,而凋亡率明显增加,Bcl-2蛋白表达显著下调,与对照各组比较有显著差异(P<0.05)。结论:mdr1反义寡核苷酸通过抑制mdr1基因降低人宫颈癌HeLa细胞放射抗性。其辐射增敏作用可能与mdr1反义寡核苷酸增加照射后肿瘤细胞的凋亡率有关。     

bcl-2反义寡核苷酸逆转人卵巢上皮性癌细胞耐药的体外研究

目的探讨体外bcl2反义寡核苷酸(AODN)对人卵巢上皮性癌(卵巢癌)细胞顺铂(DDP)耐药的逆转作用。方法以卵巢癌DDP耐药细胞株A2780/DDP为模型,实验组以脂质体为载体,分别将bcl2AODN、bcl2正义寡核苷酸(SODN)、bcl2随机寡核苷酸(RODN)分别转染到A2780/DDP细胞内;阴性对照组细胞以同体积的培养基转染;空白对照组细胞不转染。采用计数法检测细胞增殖变化;RTPCR技术检测bcl2mRNA表达水平;免疫荧光技术检测bcl2蛋白表达。将DDP作用于细胞,观察实验组、阴性对照组、空白对照组对DDP敏感性的差异。采用DNA凝胶电泳检测细胞凋亡;四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测DDP对细胞的抑制率。结果实验组转染AODN的A2780/DDP细胞增殖被抑制,细胞倍增时间延迟了24h;A2780/DDP细胞的bcl2mRNA及蛋白的表达量下降,16μg/ml的AODN转染72h后,bcl2mRNA的表达量为0.76±0.01,bcl2蛋白表达量为171.30±3.09,分别与空白对照组bcl2mRNA(1.56±0.03)、bcl2蛋白(105.34±1.72)的表达量比较,差异均有统计学意义(P<0.01);与相同浓度SODN、RODN转染的A2780/DDP细胞以及阴性对照组A2780/DDP细胞分别比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。实验组转染AODN的卵巢癌细胞对DDP的敏感性提高,细胞抑制率为(97.49±1.00)%,与阴性对照组的(3.33±0.17)%比较,差异有统计学意义(P<0.01)。结论AODN可通过下调bcl2mRNA及bcl2蛋白表达水平,抑制细胞的生长,增加细胞对DDP的敏感性,在一定程度上逆转了卵巢癌细胞的耐药性。     

环氧合酶-2反义寡核苷酸对宫颈癌Hela细胞周期的影响

目的探讨环氧合酶-2(COX-2)反义寡核苷酸抑制Hela细胞增殖的机制及其临床意义。方法2004年5月至2005年5月在温州医学院附属一院将Hela细胞用MEM培养基培养,像差倒置显微镜下观察细胞的增殖情况。Hela细胞分4组培养:正常对照组、反义寡核苷酸(ASODNS)转染组、正义寡核苷酸(SODNS)转染组、脂质体处理组。细胞转染后48h,采用流式细胞仪检测各组细胞周期的变化。结果反义寡核苷酸转染组细胞的增殖受到了显著抑制,ASODNS处理的细胞与其它组比较,G2/M期细胞[(10.75±0.24)%]所占比例增高明显(P<0.05),S期细胞[(10.13±0.04)%]比例明显减少,差异有显著性意义(P<0.05),而G0/G1期[(79.12±0.06)%]无统计学意义的改变。结论ASODNS对Hela细胞的增殖具有抑制作用,其抑制机制可能与引起细胞周期再分布,降低S期细胞比例及阻滞细胞G2/M期有关。     

短发夹状RNA对卵巢癌细胞survivin mRNA表达及紫杉醇药物敏感性的影响

目的观察表达短发夹状RNA(shRNA)的mU6/survivin质粒转染卵巢癌细胞株OVCAR3细胞后,对OVCAR3细胞survivin mRNA表达的抑制作用,以及对OVCAR3细胞紫杉醇药物敏感性的影响。方法将表达绿色荧光蛋白的pEGFPC2质粒与脂质体按不同比例转染OVCAR3细胞,流式细胞仪检测其转染效率。根据转染效率最高时pEGFPC2质粒与脂质体的比例,将mU6/survivin质粒转染入OVCAR3细胞。实验分为3组未转染组、脂质体组、转染组,RT-PCR技术检测3组OVCAR3细胞中survivin mRNA的表达,流式细胞仪分析细胞周期及细胞凋亡率的变化。四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测3组OVCAR3细胞对紫杉醇的50%抑制浓度(IC50)。结果pEGFPC2质粒与脂质体按1∶2比例转染OVCAR3细胞时其转染效率最高,达23.6%。将mU6/survivin质粒与脂质体也按1∶2比例转染OVCAR3细胞24h后,未转染组、脂质体组、转染组细胞survivin mRNA的相对含量分别为0.81±0.05、0.79±0.12、0.26±0.04,转染组survivin mRNA相对含量下降至未转染组的32%,两组比较,差异有统计学意义(P<0.01)。转染组转染24h后,细胞凋亡率为(31.9±1.2)%,明显高于未转染组的(4.9±0.7)%和脂质体组的(5.6±0.5)%(P=0.000);转染组细胞周期被阻滞于G0/G1期,G2/M期减少,分别与未转染组比较,差异有统计学意义(P<0.01)。MTT比色法检测结果显示,未转染组、脂质体组、转染组OVCAR3细胞对紫杉醇的IC50分别为(0.305±0.032)、(0.157±0.031)、(0.019±0.001)μmol/L,转染组OVCAR3细胞对紫杉醇的IC50降低为未转染组的1/16,两组比较,差异有统计学意义(P=0.000)。结论shRNA可有效抑制卵巢癌细胞survivinmRNA的表达,并显著提高了卵巢癌细胞对紫杉醇的药物敏感性。     

核苷酸还原酶小亚基反义寡核苷酸对人绒毛膜癌细胞体外生长的影响

目的　探讨核苷酸还原酶小亚基 (RRM2 )反义寡核苷酸 (ASODN)对人绒毛膜癌细胞株JAR细胞体外生长的影响。方法　以脂质体为载体 ,将人工合成的分别位于RRM2mRNA核苷酸序列第 6 2 6～ 6 4 5 (编码区 )和第 15 72～ 15 91(3′端非编码区 )位点且全程硫代修饰的两条ASODN片断 (前者称ASODN1,后者称ASODN2 )导入JAR细胞中 ,用四甲基偶氮唑蓝 (MTT)比色法检测细胞存活率 ,免疫印迹法和RT PCR技术检测ASODN对RRM2蛋白和mRNA表达的影响。结果　 (1)ASODN1对JAR细胞的抑制作用呈剂量和时间效应 :10 0nmol/LASODN1作用后JAR细胞的生长抑制率为 (8 10±1 18) % ;随着ASODN1浓度的增加细胞生长抑制作用增强 ,ASODN1浓度为 4 0 0nmol/L时其细胞生长抑制率为 (2 7 70± 3 6 8) % ,与ASODN1浓度为 0时 [(0 16± 0 12 ) % ]比较 ,差异有极显著性 (P =0 0 0 0 )。 2 0 0nmol/LASODN1作用 2 4h后 ,细胞生长抑制率为 (13 98± 1 4 5 ) % ;4 8h[为 (18 90±4 85 ) % ]达到高峰 ,72h抑制作用 [为 (19 5 3± 5 0 0 ) % ]不再明显增强 ,分别与作用时间为 0时 [(0 16± 0 31) % ]比较 ,差异均有极显著性 (P =0 0 0 0 )。 (2 )JAR细胞RRM2蛋白和mRNA的表达 :2 0 0nmol/LASODN1作用 12h ,RRM2蛋白和mRNA表达水平开始下降     

Bax、Bcl-2ASODN联合转染增强宫颈癌HeLa细胞放射敏感性的实验研究

目的:研究凋亡抑制基因bcl-2反义寡核苷酸(ASODN)和促凋亡基因bax联合转染对宫颈癌HeLa细胞凋亡的影响,进而探求其放射增敏作用。方法:用逆转录病毒颗粒感染HeLa细胞,获得HeLa-bax细胞后,将bcl-2ASODN转染HeLa及HeLa-bax细胞,36h后放射治疗,通过MTT法、细胞形态学及流式细胞仪检测细胞增殖与凋亡,半定量RT-PCR测bcl-2及bax基因的表达。结果:(1)HeLa细胞经bcl-2ASODN及bax联合转染并放疗后,光镜观察有明显凋亡趋势;(2)MTT法及流式细胞仪检测其凋亡率明显高于单基因转染+放疗组(P<0.05);(3)RT-PCR结果显示,bax基因表达显著增强,而bcl-2基因表达较各对照组明显减弱。结论:凋亡抑制基因bcl-2ASODN和促凋亡基因bax联合转染诱导HeLa细胞凋亡效果明显优于单基因转染,可有效提高HeLa细胞的放射敏感性。     

脂氧素对子痫前期患者巨噬细胞增殖和分泌功能的影响

目的 探讨脂氧素对子痫前期患者巨噬细胞增殖和分泌功能的影响.方法 对温州医学院附属第一医院产科2007年3-7月收治的24例子痫前期孕妇(子痫前期组)和24例正常孕妇(正常妊娠组)的腹腔巨噬细胞进行体外培养.采用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定不同浓度脂氧素(0、10、100 nmol/L)作用两组孕妇腹腔巨噬细胞48 h后,上清液中肿瘤坏死因子α(TNF-α)的水平.用细胞生长抑制实验法检测两组不同浓度脂氧素(0、10、100 nmol/L)作用24 h后的巨噬细胞增殖抑制率.结果 (1)TNF-α水平:子痫前期组0、10、100 nmol/L浓度的脂氧素作用下,TNF-α水平分别为(1867.5±47.3)、(1836.9±4.5)、(1800.5±2.7)ng/L.正常妊娠组0、10、100 nmol/L浓度的脂氧素作用下,TNF-α水平分别为(791.3±62.2)、(789.4±2.3)、(781.5±1.9)ng/L.子痫前期组TNF-α水平显著高于正常妊娠组,两组比较,差异有统计学意义(P＜0.05).脂氧素对子痫前期组TNF-α水平的影响呈剂量依赖性抑制(P＜0.05),而其对正常妊娠组TNF-α水平变化无明显影响(P＞0.05).(2)增殖抑制率:子痫前期组0、10、100 nmol/L浓度的脂氧素作用下,增殖抑制率分别为(14.8±6.3)%、(32.9±3.6)%、(36.7±3.8)%.正常妊娠组0、10、100 nmol/L浓度的脂氧素作用下,增殖抑制率分别为(16.8±6.9)%、(16.7±5.4)%、(15.9±2.1)%.子痫前期组增殖抑制率比正常妊娠组明显升高,两组比较,差异有统计学意义(P＜0.05),脂氧素呈剂量依赖性抑制子痫前期组孕妇腹腔巨噬细胞的增殖抑制率(P＜0.05),而对正常妊娠组的增殖抑制率则无明显影响(P＞0.05).结论 脂氧素呈剂量依赖性地抑制子痫前期患者的巨噬细胞增殖和TNF-α分泌.     

端粒酶反义hTERT基因治疗对卵巢癌细胞生长抑制作用及其对顺铂疗效的影响

目的 :探讨端粒酶反义hTERT对卵巢癌细胞生长抑制作用及对顺铂疗效的影响。方法 :以TRAP PCR ELISA法检测卵巢癌SKOV3、ES 2细胞中端粒酶活性 ;以MTT法及流式细胞术测定反义hTERT对卵巢癌细胞生长的抑制作用、细胞周期阻滞及细胞凋亡的诱导作用及对CDDP疗效的影响。结果 :SKOV3及ES 2细胞中端粒酶活性分别为 2 .17U、2 .2 7U。反义hTERT能降低卵巢癌细胞端粒酶活性 ,以剂量依赖性方式抑制癌细胞生长 ;反义hTERT10 μmol L作用 2 4、72h后G1期细胞所占比例分别为 33 16%、5 3 4 7% ,细胞凋亡发生率分别为 11 66%、13 93% ;而联合应用顺铂时 ,G1期细胞比例分别为 4 2 17%、38 98% ,细胞凋亡发生率分别为 18 66%、2 7 61%。当反义hTERT取 10、2 0、4 0 μmol L时 ,卵巢癌SK OV3、ES 2细胞对顺铂的敏感性分别增加 10 4～ 2 5 5倍、11 7～ 2 0 2倍。结论 :端粒酶反义hTERT基因治疗能通过抑制端粒酶活性、增强细胞周期阻滞及诱导细胞凋亡等途径抑制卵巢癌细胞生长 ,与CDDP合用能增强对癌细胞的杀伤作用。     

反义核酸技术干预Ku70 mRNA表达增强Hela细胞辐射敏感性的研究

目的 研究反义核酸技术干预Hela细胞Ku70 mRNA表达对其辐射敏感性的影响.方法 2005年9月至2006年4月于军事医学科学院放射医学研究所采用脂质体转染法转染Ku70 mRNA反义寡核苷酸,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测转染组和未转染组Hela细胞Ku70 mRNA的表达,克隆形成法和MTT法检测转染和未转染组Hela细胞的辐射敏感性.结果 转染组Hela细胞的Ku70 mRNA表达水平低于未转染组,条带强度比和面积比是未转染组的18.4%和22.4%,而转染组2Gy照射后的细胞存活分数(SF2)明显低于对照组(分别是空白对照、脂质体对照、阴性对照组的50.6%、52.7%、54.1%),辐射剂量存活曲线较对照组左移,相同剂量辐射后转染组的OD值显著低于脂质体对照组(P<0.05)和阴性对照组(P<0.01).结论 反义核酸技术抑制Ku70mRNA表达能够增强Hela细胞辐射敏感性,可能成为宫颈腺癌临床辐射增敏治疗的有效途径.     

RelA反义寡核苷酸对卵巢癌细胞株COC1凋亡的影响

目的　探讨RelA反义寡核苷酸对卵巢癌细胞株COC1凋亡的影响。方法　应用不同浓度的肿瘤坏死因子 (TNF)α或泰素结合RelA反义寡核苷酸 ,分别处理COC1细胞株 ;应用间接免疫荧光、Westernblot、流式细胞术、DNA凝胶电泳等方法 ,检测RelA活化及COC1细胞凋亡。结果　 5 0nmol/L的泰素单独及其与RelA反义寡核苷酸联合处理COC1细胞 12h后 ,COC1细胞的凋亡率分别为 (12 3± 0 6 ) %、(2 7 4± 0 5 ) % ,两者比较 ,差异有极显著性 (P <0 0 1) ;2 4h后 ,COC1细胞凋亡率分别为 (13 0± 0 5 ) %、(31 7± 0 3) % ,两者比较 ,差异有极显著性 (P <0 0 1)。 5 0 μg/L的TNFα单独及其与RelA反义寡核苷酸联合处理COC1细胞 12h后 ,COC1细胞凋亡率分别为 (13 2± 0 4 3) %、(30 8± 0 3) % ,两者比较 ,差异有极显著性 (P <0 0 1) ;同样 10 0 μg/L及 2 5 0 μg/LTNFα单独及其与RelA反义寡核苷酸联合处理COC1细胞的凋亡率相比 ,差异均有极显著性 (P <0 0 1)。结论　RelA反义寡核苷酸可增加TNFα或泰素诱导卵巢癌细胞凋亡的敏感性。     

金雀异黄素调控Egr1/PTEN信号通路诱导卵巢癌SKOV3细胞凋亡的实验研究

目的通过金雀异黄素(genistein)诱导人卵巢癌细胞SKOV3细胞的凋亡,探讨即刻早期反应基因(Egr1)/细胞骨架蛋白同源在10号染色体有缺失的磷酸酶(PTEN)信号通路在金雀异黄素诱导SKOV3细胞凋亡过程中的作用。方法应用磺酰罗丹明B(SRB)染色法测定经金雀异黄素处理后的SKOV3卵巢癌细胞生长抑制率,组蛋白DNA酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测细胞凋亡,采用游离硝基苯胺(p NA)法检测细胞内半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶3(Caspase-3)的蛋白含量,实时荧光定量PCR(Real-time PCR)测定细胞内Bcl-2相关X蛋白基因(bax)和B淋巴细胞瘤-2基因(bcl-2)的基因表达变化,蛋白质印迹法(Western blotting)分析Egr1、PTEN、蛋白激酶B(AKT)、磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)蛋白的表达变化。结果金雀异黄素显著抑制卵巢癌细胞SKOV3的增殖(P0.05),并呈浓度依赖性。金雀异黄素处理24 h后,处理浓度高于40μmol/L时,与对照组相比,调亡指数、Caspase-3活性、bax的相对表达及细胞中Egr1蛋白和PTEN蛋白的表达量均显著增加(P0.05),Bcl-2的相对表达量及AKT蛋白的磷酸化水平p-Akt则显著降低(P0.05)。当同时给予50 nmol/L PTEN抑制剂Bpv后,p-Akt表达明显增加,细胞凋亡程度受到明显抑制。结论金雀异黄素可能通过上调Egr1/PTEN信号通路的表达抑制PI3K/Akt信号通路的激活诱导SKOV3细胞凋亡,进一步影响了调亡相关基因Bcl-2、Bax及Caspase-3的表达。     

雌、孕激素和促性腺激素对卵巢癌细胞存活率、Bcl-2和Bax表达的影响

目的:研究雌(E)、孕激素(P)及人绒毛膜促性腺激素(HCG)对卵巢癌细胞存活率以及Bcl-2、Bax表达的影响。方法:采集卵巢癌患者术中切除的组织标本进行细胞培养,按药物作用不同分为3组:雌激素组(E组)、孕激素组(P组)、人绒毛膜促性腺激素组(HCG组)。MTT法和流式细胞技术检测细胞凋亡率与细胞周期;药物作用48h后,荧光定量PCR法进行相对定量,检测雌、孕激素对癌细胞Bcl-2、Bax表达的影响。结果:(1)高浓度(10-4mol/L)雌、孕激素能降低癌细胞的存活率,呈时间-剂量依赖性(P0.001);低浓度(10-8mol/L)雌激素能提高卵巢癌细胞的存活率。低浓度(50U)HCG对卵巢癌细胞存活率的影响不明显。150U/ml和200U/ml HCG作用72h后,对卵巢癌细胞存活率的影响显著(P0.05)。(2)高浓度(10-4mol/L)雌、孕激素能促进卵巢癌细胞凋亡(P0.001),但当雌激素浓度为10-8mol/L时,却抑制细胞凋亡(P0.001);HCG对卵巢癌细胞凋亡率的影响无显著差异。雌、孕激素和HCG对卵巢癌的细胞周期均无显著影响。(3)高浓度雌、孕激素(10-4mol/L)能抑制卵巢癌细胞Bcl-2的表达(P0.05),促进Bax的表达(P0.001);低浓度E(10-8mol/L)上调Bcl-2的表达(P0.001),下调Bax的表达(P0.001)。结论:高浓度雌激素与孕激素对体外培养的卵巢癌细胞有促进凋亡、降低存活率的作用,这可能与下调Bcl-2的表达和促进Bax的表达有关。     

siRNA LSINCT5联合顺铂对卵巢癌SKOV3细胞增殖和凋亡的影响

目的:探讨沉默LSINCT5联合顺铂对人卵巢癌SKOV3细胞增殖及凋亡的影响。方法:选取SKOV3细胞株,采用小干扰技术将LSINCT5基因片段转入卵巢癌SKOV3细胞中,同时联合顺铂作用于卵巢癌细胞。按不同处理因素将SKOV3细胞分为5组:对照组、NC-siRNA组、顺铂组、LSINCT5-siRNA+顺铂组和LSINCT5-siRNA组。CCK-8检测转染后SKOV3细胞对顺铂的敏感性。显微镜下观察细胞的生长状况及形态变化。Western blot和RT-PCR法分别检测与凋亡相关的Caspase 3蛋白和基因表达水平。结果:CCK-8显示,3μg/ml顺铂作用于卵巢癌细胞的抑制率较为适中,故作为后续实验的处理浓度。沉默LSINCT5能显著提高卵巢癌细胞对顺铂的敏感性。LSINCT5-siRNA+顺铂组中Caspase 3蛋白和mRNA相对表达量均明显高于其他各组(P0.05)。结论:沉默LSINCT5提高了卵巢癌细胞对顺铂的敏感性。沉默LSINCT5联合顺铂能明显抑制卵巢癌细胞的增殖,促进卵巢癌细胞凋亡。     

脂质体转染白介素-12基因至卵巢癌SKOV3细胞检测VEGF表达及抗肿瘤作用探讨

目的:观察含mIL-12基因的质粒转染至SKOV3卵巢癌细胞,效应细胞存在情况下对卵巢癌细胞株血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响。方法:用脂质体转染技术将基因质粒及空质粒转染至SKOV3卵巢癌细胞(SKOV3/IL-12)及SKOV3/neo;用ELISA法检测IL-12及INF-γ的表达;用逆转录聚合酶联反应(RT-PCR)半定量法测定SKOV3/IL-12+S(脾细胞)0,12,24,36,48,60hVEGFmRNA含量;用ELISA法测定细胞培养上清液中VEGF蛋白含量及其抑制率。结果:基因转染至SKOV3可检测到IL-12蛋白表达;分泌的IL-12蛋白具有活性,使脾细胞产生INF-γ,12h时迅速出现,作用后24h表达量最高;SKOV3/IL-12细胞与脾细胞作用12h后即出现VEGFmRNA表达抑制,24h达到高峰,与对照组有显著差异(P0.05);培养24h后上清中VEGF蛋白含量减少,与对照组有显著差异(P0.05)。结论:将IL-12基因转染至SKOV3卵巢癌细胞并表达IL-12;分泌的IL-12蛋白具有活性,使脾细胞产生INF-γ;SKOV3/IL-12与效应细胞脾细胞作用后产生INF-γ能在核酸水平下调VEGF并能抑制VEGF蛋白的表达。     

BV6诱导人卵巢癌SKOV3细胞凋亡定量蛋白组学研究

目的:通过定量蛋白组学技术探讨Smac类似物BV6影响人卵巢癌SKOV3细胞生长的可能机制。方法:四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测各浓度梯度BV6干预SKOV3细胞48 h后的生长抑制率,计算抑制率为50%时的药物浓度为半数抑制浓度(IC50),以0.05、0.1、0.2μmol/L BV6进行后续实验;光镜下观察对照组与0.05μmol/L BV6处理组48 h后的细胞形态变化,应用同位素标记相对和绝对定量(iTRAQ)技术结合液相串联质谱策略筛选差异蛋白并行生物信息分析;蛋白质印迹(Western blotting)检测对照组、不同浓度BV6处理组半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase-3)的表达。结果:BV6可以抑制SKOV3细胞的生长增殖,且呈剂量依赖性,多组间方差分析及任意组间两两比较,差异均有统计学意义(均P0.05)。按公式计算BV6作用于SKOV3细胞48 h的IC50为0.40μmol/L。基于发现错误率(FDR)1%,对照组与0.05μmol/L BV6处理48 h组筛选到349个差异蛋白,其中251个蛋白表达上调、98个蛋白表达下调,经生物信息学分析显示差异蛋白与RNA转录、蛋白质翻译、细胞分裂增殖、凋亡信号调节及肿瘤血管生成密切相关。Western blotting结果显示高、中、低浓度BV6干预SKOV3细胞48 h后与对照组相比,Caspase-3蛋白表达增加,其中高BV6组的Caspase-3蛋白表达最高,组间差异有统计学意义(均P0.05)。结论:BV6通过抑制RNA转录、蛋白质翻译进程、细胞分裂增殖及肿瘤血管生成,促进Caspase-3凋亡信号活化介导SKOV3细胞死亡。     

内皮前体细胞转染TRAIL基因后治疗卵巢上皮性癌的实验研究

目的探讨内皮前体细胞(EPC)转染TRAIL基因后对卵巢上皮性癌细胞的体外杀伤作用。方法采用细胞表面特异性标志物CD133磁珠分离法,从脐血中分离EPC,并进行体外培养、扩增和鉴定。构建带有TRAIL基因的质粒(即TRAIL质粒),用脂质体将TRAIL质粒转染入EPC,酶标法测定培养上清液中EPC分泌的TRAIL蛋白的表达水平,流式细胞仪分析其对卵巢上皮性癌细胞的促凋亡作用。结果采用磁珠分离法可从脐血中分离出EPC,EPC占分离后细胞总数的(84±3)%。成功构建TRAIL质粒,转染TRAIL质粒后EPC分泌的TRAIL蛋白水平增加,转染72 h时可达532.8pg/m l;而仅转染脂质体及转染绿色荧光蛋白者为12.4及9.2 pg/m l。将转染TRAIL质粒后的EPC培养上清液与卵巢上皮性癌细胞共同孵育24 h后,卵巢上皮性癌细胞凋亡率最高可达24.1%。结论TRAIL基因转染EPC后,可使EPC分泌的TRAIL蛋白水平增加,并诱导卵巢上皮性癌细胞凋亡。提示,EPC可作为基因治疗的靶向性载体,有望应用于卵巢上皮性癌的治疗。