志贺菌成簇规律间隔短回文重复序列相关蛋白基因cas1 和cas2 研究

目的 研究成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）相关蛋白基因cas1和cas2在志贺菌中的分布,并分析cas1和cas2基因突变与细菌耐药的关系。方法 采用PCR扩增196株志贺菌cas1和cas2基因。对3株志贺菌（Z23、2003135、2008113）的cas2、cas1（a）和cas1（b）基因进行测序,分析其突变与耐药之间的关系。结果 196株志贺菌均检出CRISPR相关蛋白基因cas1和cas2。测序结果显示,cas2 的一致性为 96.44%,cas1（a）的一致性为 97.61%,cas1（b）的一致性为96.97%。菌株 2003135 的 cas1（b）基因有 2 个突变位点：3177129 位点（C→G）及 3177126 位点（G→C）,Z23、2008113 对应位置没有突变。药敏结果显示菌株 2003135 的耐抗生素种类和耐抗生素数目均大于菌株Z23、2008113。结论 志贺菌中CRISPR基因广泛存在。cas1（b）基因突变菌株与未突变株比较,耐药性增强。cas1（b）基因突变可能是引起耐药程度不同的原因之一。     

甘肃省鼠疫耶尔森菌规律成簇间隔短回文重复序列位点多态性分析及地区分布

目的 研究甘肃省鼠疫耶尔森菌（鼠疫菌）的规律成簇的间隔短回文重复序列（CRISPR）位点多态性及地区分布。方法 选取1962－2014年分离的203株鼠疫菌,培养并提取DNA。采用3对CRISPR引物对菌株DNA进行PCR扩增,对PCR产物进行测序。根据菌株CRISPR位点的间区序列种类和排列情况,确定菌株的基因型（类群）,采用BioNumerics 5.10软件进行聚类分析。结果 203株鼠疫菌发现有16种间区序列,包括YPa位点9种、YPb位点4种、YPc位点3种,发现新的间区序列a1''。共发现5个CRISPR基因簇,分别为Cb2、Ca7、Ca7''、CaΔ5''、Ca35''。不同的基因簇呈现区域性特征：Cb2主要分布在会宁县、平川区,Ca7主要分布阿克塞哈萨克族自治县;Ca7''主要分布在夏河县;Ca35''主要分布肃北蒙古族自治县、玉门市;CaΔ5''主要集中在肃南裕固族自治县。结论 CRISPR分子分型方法能够较好地区分甘肃省不同疫源地的菌株,且各基因簇呈现一定的区域性特征。对研究甘肃省鼠疫菌进化规律和人间疫情分子生物学溯源有一定意义。     

志贺菌中成簇的规律间隔短回文重复序列的 相关基因检测

摘要:目的　建立检测志贺菌CRISPR相关基因的斑点杂交方法。方法　分别采用PCR 法制备地高辛标记DNA 探针和人工合成的寡核苷酸探针,与志贺菌CRISPR相关基因进行斑点杂交。结果　设计出志贺菌CRISPR的相关基因探针;实现了志贺菌CRISPR系统的探针制备及杂交方法的建立。结论　斑点杂交可以快速大量检测志贺菌CRISPR的相关基因。     

CRISPR1上游侧翼序列用于大肠埃希菌和志贺菌鉴定的效果评价

目的 探讨基于成簇规律间隔的短回文重复序列（CRISPR）1上游侧翼序列对大肠埃希菌和志贺菌鉴定和评价效果。方法 通过BLAST重复序列识别并获得全基因组测序大肠埃希菌和志贺菌的CRISPRs和CRISPR相关基因（CRISPR-associated,cas）,并分析其种系;选取CRISPRs上、下游各500 bp侧翼序列,使用Clustal X进行序列比对;采用PCR方法扩增CRISPR1上游侧翼序列,以确定其对大肠埃希菌和志贺菌鉴定和评价效果。结果 73.4%（149/203）的大肠埃希菌存在I-E型CRISPR/Cas系统,包含了A、B1、D种系;8.4%（17/203）的大肠埃希菌存在I-F型CRISPR/Cas、17.2%（35/203）的大肠埃希菌不存在CRISPR/Cas,这2种大肠埃希菌均属于B2种系;9株志贺菌均存在I-E型CRISPR/Cas。在大肠埃希菌（B2种系外）、志贺菌CRISPR1上游和大肠埃希菌（B2种系）各存在61 bp侧翼序列,序列一致性为99%,且有种属特异性,PCR扩增此区域鉴定大肠埃希菌和志贺菌的灵敏度和特异度均>91%。结论 基于CRISPR1上游序列可用来鉴定大肠埃希菌和志贺菌,且具有很好的效果。     

O26:H11及NM大肠埃希菌CRISPR的分子分布特征及其与stx噬菌体的关系

目的 探讨O26：H11及NM血清型大肠埃希菌中成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）的分子分布特征及其与stx噬菌体的关系。方法 135株O26：H11及NM血清型大肠埃希菌从NCBI数据库获取,利用CRT软件及CRISPR Finder提取CRISPR信息,并用Excel软件对间隔序列进行编号及分析CRISPR亚型,并分析CRISPR与stx噬菌体之间的关系。结果 135株O26：H11及NM血清型大肠埃希菌中均存在CRISPR结构,CRISPR1包括19个亚型,CRISPR 2.1包括22个亚型,CRISPR2.2包括1个亚型,CRISPR3-4包括1个亚型。stx噬菌体在CRISPR群组C中出现,stx⁺ 菌株比stx^-菌株拥有更多的间隔序列。结论 CRISPR位点在O26：H11或NM血清型大肠埃希菌中广泛存在,且存在着不同的亚型,stx噬菌体与CRISPR的分子分布特征有关,可能作为鉴定高毒菌株的分子靶标。     

基于CRISPR/Cas的大肠埃希菌分子标志物的监测研究

目的 探讨基于CRISPR/Cas的大肠埃希菌分子标志物的监测研究。方法 通过BLAST收集GenBank数据库中135株全基因组测序大肠埃希菌、203株鸟枪法测序大肠埃希菌的CRISPR/Cas和PCR扩增、测序获得本实验室保存361株大肠埃希菌（包括38株大肠埃希菌O157：H7）的CRISPR序列,应用CRISPR Finder在线软件分析CRISPR特征、DNAMAN软件进行间隔序列的比对,使用Clustal Ⅹ进行cas多序列比对和Mega 5.1软件构建系统进化树。结果 本研究以全新的视角对大肠埃希菌的CRISPR/Cas位置进行描述;结果显示,135株全基因组测序、203株鸟枪法测序和361株本实验室测序的大肠埃希菌中分别有77.04%、100.00%和75.62%的大肠埃希菌具有CRISPR1,分别有74.81%、100.00%和92.24%的大肠埃希菌具有CRISPR2,分别有11.85%、0和1.39%的大肠埃希菌具有CRISPR3和CRISPR4;GenBank数据库下载的全基因组测序的1株和本实验室测序的2株大肠埃希菌存在4个CRISPR位点;缺少cas的CRISPR1下游有插入序列存在。在699株大肠埃希菌中,8株O55：H7、180株O157：H7、8株O157：HNM、40株O104：H4、4株O145：H28有独特的CRISPR;间隔序列的缺失可发生在CRISPR中间;依据I-E和I-F的cas构建系统发育树,均可分为两类。结论 大肠埃希菌的CRISPR/Cas可能作为鉴定强毒株大肠埃希菌或者新型菌株的分子标志物。间隔序列的缺失或获得可能与噬菌体有关。     

基于不同方法的大肠埃希菌分型效果评价

目的 评价并验证成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPRs）、血清学和多位点测序分型（MLST）方法对大肠埃希菌分型的效果。方法 使用CRISPRsFinder分析大肠埃希菌全基因组序列的CRISPRs间隔序列,使用在线软件SeroTypeFinder和MLST获得血清型和序列型（ST）;采用PCR扩增并分析349株大肠埃希菌CRISPRs,使用CRISPRs间隔序列预测血清型和ST,并比较血清学和MLST分型结果。结果 将I-E型CRISPR/Cas、I-F型CRISPR/Cas和CRISPR3-4分别命名CT-Ⅰ、CT-Ⅱ和CT-Ⅲ。根据CRISPRs间隔序列构成和排列进一步进行分型,203株大肠埃希菌被分为79个CT型别,76个血清型和66个ST。CRISPRs分型的区分能力最强,辛普森指数为0.936。CRISPRs和血清学的关联程度最高,调整兰德指数为0.908。CRISPRs型能进一步区分相同血清或ST产志贺毒素的大肠埃希菌［O157∶H7（ST11）、O104∶H4（ST678）和O26∶H11（ST21）］菌株。扩增实验室菌株的CRISPR1、CRISPR2、CRISPR3、CRISPR4和CRISPR3-4,检出率分别为81.1%、94.5%、1.4%、1.4%和4.6%;根据CRISPRs间隔序列预测O157∶H7（ST11）和ST131准确率分别为95.0%和100.0%。结论 基于CRISPRs的大肠埃希菌的分子分型方法呈现较好的分型效果和临床应用效果,预期可以成为大肠埃希菌分型的重要分子标志物。     

沙门菌基因间共有重复序列-PCR分子分型方法的优化及应用初探

目的优化沙门菌基因间共有重复序列-PCR(ERIC-PCR)分子分型方法,分析沙门菌标准菌株及流行分离株基因组DNA ERIC-PCR指纹图谱。方法提取鼠伤寒沙门菌基因组DNA作为模板,根据ERIC核心片段设计引物,运用ERIC-PCR技术扩增沙门菌基因组中的靶序列,PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后用凝胶成像分析仪对图谱进行观察分析。反应体系中模板量、Mg2+浓度、引物浓度和退火温度的优化实验则采用对优化项目设置梯度、其它条件不变的方法进行。以优化好的ERIC-PCR方法对16株沙门菌及1株大肠杆菌进行分析。结果在总体积为25μl的反应体系中,选择DNA模板量为100ng/25μl,Mg2+浓度为2.0mmol/L,引物ERIC1R、ERIC2浓度分别为0.4μmol/L,退火温度为52℃时,扩增产物的电泳图谱条带最清晰完整。不同血清群、型和来源的沙门菌株间基因组DNA ERIC-PCR指纹图谱带型差异较大,可在250～5000bp范围内出现3～13条条带,并在250bp处出现一条特征条带。结论优化了沙门菌ERIC-PCR的重要反应条件。ERIC-PCR法能区分不同来源的沙门菌,可用于沙门菌病的流行病学调查和同源性追踪,弥补传统分型方法的不足。     

Single nucleotide polymorphism (SNP)-based differentiation of Shigella isolates by pyrosequencing

Analysis of single nucleotide polymorphisms (SNPs) is an important genetic tool that provides molecular markers for rapid differentiation of closely related strains. We have applied SNP discovery and analysis for distinguishing each of the four Shigella serogroups (Boydii, Dysenteriae, Flexneri, and Sonnei) and for discriminating individual strains within the same serogroup by using 24 SNPs selected from nine genes. Five SNPs were identified from sequence analysis of two housekeeping genes (gapA and thrB) used previously in our lab to differentiate Shigella isolates into distinct lineages. The remaining 19 SNPs were identified by in silico analyses of eight Shigella genomes and are within the genes lpxC, sanA, yaaH, ybaP, ygaZ, yhbO, and ynhA. A total of 118 Shigella strains comprising 20 Boydii, 29 Dysenteriae, 42 Flexneri, and 27 Sonnei isolates were analyzed using the SNP typing scheme reported here. The combination of the 24 SNPs resulted in the identification of 26 SNP genotypes among the four Shigella serogroups and also provided some discriminatory resolution among individual strains within the same serogroup. The SNPs presented here should prove useful in identifying Shigella using PCR amplification and rapid sequence typing strategies.     

Genetic diversity of Shigella species from different intercontinental sources

One hundred and twenty three strains of Shigella spp. (mostly Shigella sonnei and Shigella flexneri) were isolated between 1995 and 2000 from patients suffering from traveller's diarrhoea. Seventy nine of them have been typed by digestion of their chromosomal DNA with Xba I and pulsed field gel electrophoresis. Results show a high degree of heterogeneity in both S. sonnei and S. flexneri isolates. This is the first time that the molecular typing of such a high number of geographically unrelated isolates of Shigella sp. is carried out, showing a high level of genomic re-arrangement.     

1978~1991年北京丰台区痢疾菌菌型分布与变迁的调查分析

北京丰台区1978~1991年共检出志贺氏菌386株,均经生化、血清学鉴定,对其中108株作了药敏试验。菌型分布于4个群、20个血清型(亚型),其中福氏志贺氏菌始终占优势(72.80%),以F₂a、F₃a为主,宋内氏志贺氏菌为第二位(17.10%),B:D比值为4.3。此外,对菌型变迁的因素进行了初步探讨,为志贺氏菌病的防治提供了参考依据。     

4株志贺菌无抗生素压力下连续传代90次的耐药表型及CRISPR/Cas系统变化

目的 分析无抗生素压力下连续传代90次的4株志贺菌耐药表型及成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）/CRISPR相关蛋白（Cas）基因变化。方法 对临床分离的4株耐药谱不同的志贺菌进行无抗生素压力连续传代90次,传代结束后用琼脂稀释法检测传代前、后志贺菌最小抑菌浓度;用PCR对CRISPR位点进行扩增并测序,CRISPR Finder和Clustal X 2.1分析CRISPR位点的变化。结果 经无抗生素压力传代90次后,4株志贺菌对某些抗生素的敏感性有不同程度的增加：mel-sf1998024/zz对氨苄西林、头孢氨苄、头孢噻肟、氯霉素的耐药性降低,mel-s2014026/sx对诺氟沙星、甲氧苄啶的耐药性降低,mel-sf2004004/sx对氨苄西林、头孢呋辛、头孢噻肟、氯霉素、甲氧苄啶的耐药性降低,mel-sf2013004/bj对氯霉素的耐药性降低;志贺菌mel-sf1998024/zz和mel-sf2013004/bj经无抗生素压力传代后,CRISPR3位点3''的重复-间隔序列丢失,其中间隔序列匹配基因的编码产物是Cas蛋白。结论 志贺菌在无抗生素压力下,可降低或丢失对某些抗生素的耐药性。部分志贺菌CRISPR3位点的结构发生了变化,CRISPR3位点与cas基因可能存在共进化。     

农村井水中耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌及耐药基因分子流行病学特征

目的:分析农村井水中耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌（PA）及耐药基因的分子流行病学特征。方法:依据《饮用天然矿泉水检验方法》（GB 8538-2016）对山东省巨野县农村井水采集112份水样进行检测,并对检出的PA分别进行PFGE分型和药物敏感性试验。PCR鉴定碳青霉烯类耐药基因后,采用S1-PFGE和Southern杂交确...     

Pfcrt K76T mutation and its associations in imported Plasmodium falciparum malaria cases

Over 3 years (1999-2002), 305 cases of falciparum malaria were diagnosed in Toulouse, France. After retrospective analysis, only 131 patients entered the study. The diagnosis of malaria was ensured by optical methods (QBC then thin smear examination), the results of which were checked from 1999 to mid-2001 by a conventional PCR method, replaced at that time by a real-time PCR using LightCycler. To detect Pfcrt K(lysine)76T(threonine) mutation, a real-time PCR assay was developed, the sensitivity of which was one mutated parasite per microliter, or 2% mutant asexual forms in a mixed population. Eighty-one patients harbored only mutant parasites, and 11 had a K76K/T76-mixed infection. The distribution of K76T mutation was significantly affected by the use of a chloroquine + proguanil (CQ + P) prophylaxis (P = 0.00037). Among 96 subjects who had no exposure to chloroquine or any history of CQ + P prophylaxis, the mean parasitemia was higher in K76-infected patients (P = 0.038), which suggested a lack of virulence in the falciparum mutant population.     

Towards the molecular epidemiology of Mycobacterium leprae: Strategies, successes, and shortcomings

Mycobacterium leprae, the causative agent of leprosy, is an unusual organism that presents unique challenges to those studying the disease through molecular epidemiology. As a consequence, many basic aspects of disease transmission and biology remain unilluminated. In this review, we explore the general principles of molecular epidemiology, and the special difficulties surrounding the application of molecular epidemiology to M. leprae. We briefly discuss the computational tools commonly employed in molecular epidemiology studies. The past decade of developments in molecular strain typing approaches through VNTRs and SNP loci, and their merits and limitations, are discussed. We summarize what has been learned about the transmission and historical origins of leprosy through molecular epidemiology and Bacterial Population Genetics, to date. Lastly, we critically evaluate the strengths and shortcomings of leprosy research, and present recommendations for future work that will hopefully shed light on some of the disease’s most fundamental mysteries.     

黑龙江省4个市肉鸡生产链中沙门菌分子分型研究

目的 了解黑龙江省4个市肉鸡生产链中沙门菌分子分型的情况。方法 参照美国CDC PulseNet实验方法,对2012年黑龙江省4个市肉鸡生产链环节中（孵化、养殖、屠宰和配送分销）分离到的沙门菌进行PFGE分型,利用BioNumerics软件对分离菌株的指纹图谱进行聚类分析并初步建立数据库。结果 4个环节中屠宰环节的污染最为严重（13.84%）。150株肠炎沙门菌和65株印第安纳沙门菌分别有89个和55个带型,带型存在多样性。肠炎沙门菌在不同环节或是不同地区具有相同的带型;印第安纳沙门菌在所有不同环节和地区没有相同的带型。HLJ2的肉鸡肠炎沙门菌污染已溯源到孵化环节的种鸡。结论 黑龙江省4个市肠炎沙门菌和印第安纳沙门菌的带型有地区差异,不同环节的优势带型各不相同。屠宰加工过程存在交叉污染,部分地区污染源可追溯到孵化环节。