中国土拉弗朗西斯菌holarctica亚种的遗传多样性

目的 研究国内外土拉弗朗西斯菌的遗传进化关系。方法 选择17个单核苷酸多态性、4个插入/缺失和12个可变数目串联重复,采用单核苷酸多态性和插入/缺失、多位点可变数目串联重复分析方法单独和组合起来对39株土拉菌(10株中国土拉菌和29株已公布测序的土拉菌)进行系统进化分析。结果 组合分析显示,3株中国土拉菌和日本的FSC022被分配到B5;剩余3株中国土拉菌和瑞典的FSC200被分配到B1;3株和美国的OSU18被分配到B2;1株和法国的FTNF002-00、德国的F92与美国的OR96246一起被分配到B4。10株中国土拉菌分为4种亚型,研究表明中国土拉菌具有广泛的遗传多样性。结论 本研究针对土拉菌B型建立了一套简易高效的分型方法,并以此为基础得出土拉菌B型的起源可能是亚洲地区。     

河北省鼠疫菌CRISPR基因分型及流行病学分析

目的对河北省鼠疫菌株进行规律聚集间隔短回文重复序列CRISPR)基因分型。方法利用聚合酶链式反应(PCR),采用3对CRISPR引物,对河北省分离的128株鼠疫菌进行扩增,测定扩增产物核酸序列并进行分析,确定河北省菌株CRISPR基因型。结果 128株鼠疫菌在3个CRISPR位点上有8种间隔序列,包括al、a2、a3、b1、b2、c1、c2、c3,分为2个基因型。118株鼠疫菌株为Cb2型,另外10株鼠疫菌均为新基因型(命名为Cc△1型)。结论通过CRISPR分析显示河北省鼠疫菌株遗传进化比较稳定,建立了CRISPR基因库,为鼠疫菌种群遗传进化和鼠疫防控的研究提供参考。     

志贺菌毒力相关基因的PCR检测分析

目的：利用PCR方法对武汉地区近年来收集的17株志贺菌进行毒力相关基因检测并分析其分布情况。方法：采用8对引物set1A、set1B、shet2A、shet2B、ial、ipaH、stx1与virA分别对志贺菌中毒力相关基因进行检测,结合常规鉴定方法对PCR扩增结果进行分析。结果：SHET1仅在福氏志贺菌（福氏Ⅱ型、福氏Ⅳ型）分离株（包括其标准株）中存在;SH-ET2存在于各型志贺菌（包括其标准株）;ipaH基因存在于各种类型志贺菌（包括其标准株）;17株志贺菌中,引物shet2A和引物shet2B用于检测sen基因分别检出16株和13株;ial、virA在反复复苏的菌株中检出率有所下降,stx1基因只在痢疾志贺菌中检出。结论：志贺菌快速诊断方法（PCR）中应首选检测志贺菌相关毒力基因ipaH基因。     

复合探针荧光定量PCR检测土拉弗朗西斯菌

目的:建立检测土拉弗朗西斯菌复合探针荧光定量PCR方法。方法:对土拉弗朗西斯菌的FopA基因设计引物和探针,用荧光定量PCR检测,并对特异性、灵敏度和重复性进行评价。结果:本方法对所试验的土拉弗朗西斯菌纯培养物的最低检测浓度为100 CFU/ml,定量的检测变异系数小于5%。在模拟的污染血液样品中的检出限为1×103 CFU/ml。结论:本文建立的复合探针荧光定量PCR方法能高效、敏感、特异地检测土拉弗朗西斯菌。     

广东省脑膜炎奈瑟氏菌porA基因限制性片段长度多态性分型研究

目的 分析广东省在不同流行时期，特别是80年代后期以来脑膜炎奈瑟氏菌（Nm)的特点。方法 选择35株A、B、C群流脑菌株（1966－2000年）进行porA基因聚合酶链反应－限制性片段长度多态性（PCR－RFLP)分型研究，采用PCR反应扩增porA基因，PCR产物纯化后经限制性内切酶MspI酶切；10％聚丙烯酰胺凝胶（PAGE）电泳分离酶切产物，银染显色。结果 35株被检菌株分为5种RFLP型，20株A群菌株（病人17株，带菌3株）分3型，谱型与我国代表谱型相同（即a1、a2、a3型）；11株B群菌株分5型，其中6株病人菌株每两株1型，分为3型（即b20、b21、b21a2型），其中b20型与a3型谱型相同；4株C群菌株有3株与b21a2菌型相同。结论 不同的血清群可有相同的RFLP谱型；A群Nm不同的流行周期有自己优势菌型，广东省60年代与80年代后期至今的代表菌型相同，为a3型；B群RFLP谱型比A群变异程度大，同一时期分离到的菌株可有几种不同的RFLP谱型；广东省流脑流行存在由A群向B群变迁的趋势。     

福氏志贺菌血清型单重PCR鉴定方法的建立及应用

目的 建立基于O抗修饰基因的福氏志贺菌血清型PCR鉴定方法.方法 根据福氏志贺菌O抗原合成及修饰特异基因设计引物,以常见的14种福氏志贺菌血清型(包括1a、1b、1c、2a、2b、3a、3b、4a、4b、5a、Y、X、Xv和F6)为标准菌株,建立福氏志贺菌血清型单重PCR鉴定方法;并以痢疾志贺菌、宋内志贺菌、鲍氏志贺菌和腹泻相关的其他菌属菌株验证特异性;应用该方法对106株福氏志贺菌临床分离株进行PCR血清分型.结果 建立一种福氏志贺菌血清型单重PCR鉴定方法,通过8个PCR反应,能够鉴定目前已知的15种血清型中的14种(Xv除外).检测灵敏度在10 pg至1 ng DNA(20μl反应体系).对106株福氏志贺菌临床分离株的检测结果提示,PCR分型方法与玻片凝集法具有很高的一致性.结论 本研究建立的福氏志贺菌血清型单重PCR鉴定方法具有特异性、灵敏性,可用于临床检测.     

鲍氏不动杆菌β-内酰胺酶基因型及其同源性分析

目的分析鲍氏不动杆菌β-内酰胺酶基因型及同源性,了解其流行情况。方法采用PCR法检测β-内酰胺酶基因型并经DNA测序确证,用重复片段引物PCR判定基因的同源性。结果对46株鲍氏不动杆菌的耐药基因检测发现,单纯TEM阳性25株,占54.35%;单纯PER阳性5株,占10.87%;另6株(13.04%)同时含有TEM和PER基因;重复片段引物PCR显示,46株鲍氏不动杆菌基因为1～5条大小2000 bp的片段,共分为20个基因型,其中A型16株(34.78%),C型和E型各4株(8.70%),J型3株(6.52%),B、K、H型各2株(4.35%),其余类型各1株(2.17%)。结论鲍氏不动杆菌基因型以TEM型为主,重复片段引物PCR显示A型菌株为主要的流行株。     

分子生物学方法在儿童流行性感冒监测中的应用

目的：建立一种能够快速，特异，有效地直接从临床标本中检测流行感冒（流感）病毒并进行病毒型和亚型鉴别的方法，同时了解近年来北京地区A3型流感病毒因凝素重链（HA1）区基因的变异特点。方法：根据编码A、B型流感病毒膜蛋白M基因的核苷酸序列设计两对引物，用于同一逆转录（RT）－PCR反应中（多重RT－PCR），根据A、B型毒株扩增产物的大小（分别为506bp和261bp）鉴别A、B型流感病毒，另根据编码A1和A3型流感病毒糖蛋白HA基因的核苷酸序列设计两对引物，与B型M基因基因引物用同一RT－PCR反应中，可区分A1、A3或B型病毒HA基因和B型病毒M基因又设计了3对引物作为外侧引物，进行巢式－PCR反应。根据第二次PCR的扩增产物在1．2％的琼脂糖凝胶电泳中的大小即可确定型别。经PCR扩增1996－2002年间分离的北京地区A3型流感病毒株HA1区基因，测序并进行序列分析，结果：用上述多重RT－PCR鉴定流感病毒分离株156株，与血凝抑制试验阳性符合率为100％，用多重巢式－PCR检测92份已经病毒分离确定为流感的儿科临床呼吸道标本，与病毒分离和血凝抑制试验阳性符合率分别为76．9％（A1型）、57．1％（A3型）、86．5％（B型），对5株1996－2002年间A3间分离株HA1区基因序列分析结果显示，不同年份的分离株HA1区基因具有较高的核苷酸和氨基酸同源性，而且年份越近的毒株之间同生越测。为流感监测提供更加快速的新方法，北京地区A3型流感毒分离株HA1区基因持续不断地发生点突变，糖基化位点不断增多，可能是导致其抗原漂移的原因。     

串珠镰刀菌伏马菌素产毒株聚合酶链反应检测方法的研究

以伏马菌素生物合成所必需的多酮肽合成酶基因fum5为基础 ,设计了 3对特异性引物P1 P2、P3 P4和Fum5F2 1 Fum5 1,建立了串珠镰刀菌伏马菌素产毒株PCR检测方法。以 5株ATCC典型串珠镰刀菌及其他菌株为参考 ,其中ATCC 5 2 5 3 9为伏马菌素B1(FB1)产毒株 ,测定了PCR方法的特异性。ATCC 5 2 5 3 9扩增结果阳性 ,该 3对引物分别扩增出 880bp、70 2bp和 10 40bpDNA片段 ,非伏马菌素产毒株ATCC 3 8946、ATCC2 62 63、ATCC 12 763、ATCC 3 80 16及其他阴性对照菌株 (禾谷镰刀菌、梨孢镰刀菌、木贼镰刀菌、三线镰刀菌、黄曲霉、拟青霉和大肠杆菌O15 7)结果阴性 ,证明引物具有很好的特异性。同时以不同稀释度的ATCC 5 2 5 3 9DNA为模板 ,测定了 3对引物PCR的敏感性 ,P1 P2每PCR反应的检出限为 10 0pg ,P3 P4和Fum5F2 1 Fum5R1每PCR反应的检出限均为 10pg ,分别相当于每PCR反应检出 10 4和 10 3个孢子。 3对引物PCR检测国内不同地区分离的 3 2株串珠镰刀菌及交孢变种 ,2 6株为伏马菌素产毒株 ,6株为非伏马菌素产毒株。并对部分产毒株PCR(P3 P4)产物 ,应用内切酶EcoRV和BamHI,进行限制片段长度多态性 (RFLP)分析 ,分别产生 181bp、5 2 1bp 2个和 116bp、2 5 8bp、3 2 8bp 3个DNA片段 ,与文献报道值一致 ,确证了结     

中国11城市乙型肝炎病毒慢性感染者中乙型肝炎病毒基因型分布

目的了解中国乙型肝炎病毒（HBV）慢性感染者中HBV基因型的分布情况。方法收集北京、清远、深圳、石家庄、汉川、南京、长春、济南、聊城、宁波和温州市共1214份HBV DNA阳性的慢性HBV感染者血清样本,用型特异性引物聚合酶链反应法（PCR）进行基因型测定,并对其中部分样本以PCR产物直接测序验证。结果在1214份血清中,检测到A基因型9例,占0．7%;B基因型345例,占28．4%;C基因型709例,占58．4%;B、C混合基因型（B＋C）151例,占12．4%。未检测到其他基因型。北方地区（长春、北京、石家庄市等）慢性HBV感染者中,C基因型比例较高,分别为58．2%、67．5%和63．6%,山东省聊城和济南市的C基因型比例分别高达90．2%和87．9%。随地理位置南移,B基因型比例逐渐增加,广东省清远和深圳市的B基因型比例分别为71．4%和63．6%。结论HBV基因型分布有明显地区差异。在中国慢性HBV感染者中,HBV C和B基因型为主要流行株。北方地区以C基因型为优势株,而南方地区则B基因型较为多见。     

A Francisella tularensis subspecies novicida purF mutant, but not a purA mutant, induces protective immunity to tularemia in mice

Francisella tularensis subspecies novicida mutants have been made with deletions introduced into the purA or purF genes. These mutants demonstrated the expected growth requirement for purines and complementation with the wild type genes restored the ability to grow on purine deficient media. The mutants were at least 10,000-fold attenuated by the ip challenge route in Balb/C mice and defective for survival in J774A.1 mouse macrophages. Immunisation with the purA mutant did not provide protection against a subsequent challenge with 100 median lethal doses of F. tularensis subspecies novicida. Immunisation of mice with the purF mutant provided protection against a subsequent challenge with F. tularensis subspecies novicida but not against a subspecies tularensis challenge. These findings suggest that purine auxotrophs of F. tularensis should be further evaluated as live attenuated vaccines against tularemia, but that differential effects are seen depending on which step in the biosynthetic pathway is inactivated.     

空肠弯曲菌多重聚合酶链反应基因鉴定及其毒力相关基因分析

目的建立空肠弯曲菌、结肠弯曲菌多重聚合酶链反应（m-PCR）鉴定方法,并对菌株毒力相关基因cadF、virB11、flaA、cdtA、cdtB、cdtC的分布进行初步分析。方法利用m-PCR的方法对经过传统生物化学方法鉴定的65株弯曲菌进行鉴定,并通过空肠弯曲菌特异基因hipO、结肠弯曲菌glyA基因特异片段的PCR扩增对鉴定的结果进一步验证;利用特异引物PCR方法初步分析其毒力、毒素相关基因cadF、virB11、flaA、cdtA、cdtB和cdtC的分布。结果m-PCR扩增结果发现65株不同来源的弯曲菌,42株为空肠弯曲菌,23株为结肠弯曲菌。hipO、glyA基因PCR扩增结果与m-PCR扩增结果一致。16．9%菌株PCR鉴定结果与传统的生物化学鉴定结果不一致。100%（65/ 65）菌株cadF、flaA基因阳性,并且PCR扩增片段大小一致。virB的阳性率为10．8%（7/65）,其中空肠弯曲菌阳性率11．9%（5/42）,结肠弯曲菌阳性率为8．7%（2/23）。空肠弯曲菌、结肠弯曲菌cdtA的阳性率分别为100%（42/42）和78%（18/23）;空肠弯曲菌cdtB扩增的的阳性率为97．6%（41/42）。而23株结肠弯曲菌扩增结果均为阴性;空肠弯曲菌、结肠弯曲菌cdtC的阳性率皆为100%,但PCR扩增产物大小不一致,空肠弯曲菌为555 bp,结肠弯曲菌约为465 bp。结论m-PCR的方法可以有效的对空肠弯曲菌和结肠弯曲菌进行属内分型。中国菌株细胞溶涨毒素基因簇cdt基因的特征与文献报道国外菌株存在差异。     

Canonical insertion-deletion markers for rapid DNA typing of Francisella tularensis

To develop effective and accurate typing of strains of Francisella tularensis, a potent human pathogen and a putative bioterrorist agent, we combined analysis of insertion-deletion (indel) markers with multiple-locus variable-number tandem repeat analysis (MLVA). From 5 representative F. tularensis genome sequences, 38 indel markers with canonical properties, i.e., capable of sorting strains into major genetic groups, were selected. To avoid markers with a propensity for homoplasy, we used only those indels with 2 allelic variants and devoid of substantial sequence repeats. MLVA included sequences with much diversity in copy number of tandem repeats. The combined procedure allowed subspecies division, delineation of clades A.I and A.II of subspecies tularensis, differentiation of Japanese strains from other strains of subspecies holarctica, and high-resolution strain typing. The procedure uses limited amounts of killed bacterial preparations and, because only 1 single analytic method is needed, is time- and cost-effective.     

通用型基因悬浮芯片检测生物恐怖细菌的方法研究

目的 建立快速、高通量的基因悬浮芯片检测方法,用于生物恐怖病原体的快速筛检.方法 选择保守的细菌16 S rDNA序列,并针对炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis,B.a)、鼠疫耶尔森菌(Yersinia pestis,Y.p)、布鲁菌属(Brucella spp.,Bru)、土拉弗朗西斯菌(Francisella tularensis,F.t)和类鼻疽伯克霍尔德菌(Burkholderia pseudomallei,B.p)等5种生物恐怖细菌设计种(属)特异性探针,经16 S rDNA通用引物341A、519B扩增基因组DNA,用基因悬浮芯片方法进行检测,并对方法的灵敏度、特异度、重复性、检测能力进行验证.结果 经16 S rDNA通用引物扩增,特异性探针杂交检测,能将样本细菌鉴定到属水平,同属菌出现交叉反应;检出限分别为类鼻疽伯克霍尔德菌1.5 pg/μl,布鲁菌属20 ps/μl,炭疽芽孢杆菌7 pg/μl,土拉弗朗西斯菌0.1 pg/μl,鼠疫耶尔森菌1.1 pg/μl;15次重复检测各探针变异系数(CV)为5.18%～17.88%,具有较好的重复性;方法可正确检出模拟白色粉末样本中炭疽芽孢杆菌和鼠疫耶尔森菌.结论 建立了通用型基因悬浮芯片检测体系快速高通量筛查生物恐怖细菌的方法.     

三对引物同时PCR分型检测产毒素大肠杆菌的方法及在分子流行病学研究中的应用

在产毒素大肠杆菌（ＥＴＥＣ）肠毒素基因内设计合成三对引物，建立了三对引物同时ＰＣＲ检测ＥＴＥＣ的方法，一次ＰＣＲ即可扩增出６２７ｂｐ（ＬＴｈ）、２４０ｂｐ（ＳＴＩａ）和１６９ｂｐ（ＳＴＩｂ）三种肠毒素基因片段，可同时分型检测出ＬＴｈ、ＳＴＩａ、ＳＴＩｂ、ＬＴｈ－ＳＴＩａ、ＬＴｈ－ＳＴＩｂ五种基因型的ＥＴＥＣ，与非ＥＴＥＣ对照菌无交叉反应，最小检出量为１０ｃｆｕ，显示了很高的特异性和敏感性。将建立的方法用于山东省六县市６２３例大肠杆菌致泻标本的检测，阳性率为４０．３％，并能鉴别ＥＴＥＣ的基因型，为ＥＴＥＣ腹泻的分子流行病学研究提供了有效的检测手段     

宁夏地区2008年肠道病毒71型分离株基因特征分析

目的 研究宁夏地区手足口病患者中肠道病毒71型(EV71)分离株的基因特征.方法 采集手足口病患者标本进行病毒分离培养,阳性标本进行RT-PCR鉴定后,选取29株EV71分离毒株,对其VP1区进行核苷酸序列测定,并参考A、B、C各基因型的参考毒株和以往中国EV71的分离毒株进行同源性分析并构建系统发生树.结果 从439份标本中分离肠道病毒215株,经RT-PCR鉴定,93株为EV71.选取其中29株进行VP1基因全序列测定,根据VP1全基因序列构建系统发生树,29株毒株均在C基因型中,与C4亚型属同一分支,与C4亚型代表株核苷酸同源性为91.7%～99.4%,氩基酸同源性为96.6%～100.0%.结论 宁夏地区手足口病患者中分离的EV71毒株属C基因型的C4亚型.     

宁夏地区2008年肠道病毒71型分离株基因特征分析

目的 研究宁夏地区手足口病患者中肠道病毒71型(EV71)分离株的基因特征.方法 采集手足口病患者标本进行病毒分离培养,阳性标本进行RT-PCR鉴定后,选取29株EV71分离毒株,对其VP1区进行核苷酸序列测定,并参考A、B、C各基因型的参考毒株和以往中国EV71的分离毒株进行同源性分析并构建系统发生树.结果 从439份标本中分离肠道病毒215株,经RT-PCR鉴定,93株为EV71.选取其中29株进行VP1基因全序列测定,根据VP1全基因序列构建系统发生树,29株毒株均在C基因型中,与C4亚型属同一分支,与C4亚型代表株核苷酸同源性为91.7%～99.4%,氩基酸同源性为96.6%～100.0%.结论 宁夏地区手足口病患者中分离的EV71毒株属C基因型的C4亚型.     

宁夏地区2008年肠道病毒71型分离株基因特征分析

目的 研究宁夏地区手足口病患者中肠道病毒71型(EV71)分离株的基因特征.方法 采集手足口病患者标本进行病毒分离培养,阳性标本进行RT-PCR鉴定后,选取29株EV71分离毒株,对其VP1区进行核苷酸序列测定,并参考A、B、C各基因型的参考毒株和以往中国EV71的分离毒株进行同源性分析并构建系统发生树.结果 从439份标本中分离肠道病毒215株,经RT-PCR鉴定,93株为EV71.选取其中29株进行VP1基因全序列测定,根据VP1全基因序列构建系统发生树,29株毒株均在C基因型中,与C4亚型属同一分支,与C4亚型代表株核苷酸同源性为91.7%～99.4%,氩基酸同源性为96.6%～100.0%.结论 宁夏地区手足口病患者中分离的EV71毒株属C基因型的C4亚型.     

宁夏地区2008年肠道病毒71型分离株基因特征分析

目的 研究宁夏地区手足口病患者中肠道病毒71型(EV71)分离株的基因特征.方法 采集手足口病患者标本进行病毒分离培养,阳性标本进行RT-PCR鉴定后,选取29株EV71分离毒株,对其VP1区进行核苷酸序列测定,并参考A、B、C各基因型的参考毒株和以往中国EV71的分离毒株进行同源性分析并构建系统发生树.结果 从439份标本中分离肠道病毒215株,经RT-PCR鉴定,93株为EV71.选取其中29株进行VP1基因全序列测定,根据VP1全基因序列构建系统发生树,29株毒株均在C基因型中,与C4亚型属同一分支,与C4亚型代表株核苷酸同源性为91.7%～99.4%,氩基酸同源性为96.6%～100.0%.结论 宁夏地区手足口病患者中分离的EV71毒株属C基因型的C4亚型.