荧光定量-聚合酶链反应法快速检测麻疹病毒核酸

目的：采用荧光定量一聚合酶链反应（FQ-PCR）法，检测麻疹病毒核酸，用以建立和推广一种敏感、特异、快速的麻疹检测新技术。方法：TaqMan特异性荧光标记探针法，进行特异性、敏感性和麻疹疑似患者临床标本的检测。结果：FQ-PCR法检测麻疹病毒核酸具有高度的特异性和敏感性，本次试验检测灵敏度达0．1TCID砷。在14份麻疹患者咽拭子标本中，有13份标本检出麻疹病毒核酸，从核酸提取至完成检测仅需3h。结论：FQ-PCR法为麻疹病毒核酸检测提供了一种可靠的方法。     

TaqMan荧光定量PCR技术快速检测霍乱弧菌方法的建立

目的：建立特异、灵敏、快速的TaqMan荧光定量PCR方法用于快速检测霍乱弧菌。方法：根据GenBank上的霍乱毒素（cholera toxin，CT）基因序列，在其保守区域设计特异性引物与TaqMan探针，并对荧光定量PCR体系与反应条件进行优化，同时验证方法的特异性、敏感性和重复性。结果：本方法对霍乱弧菌的检测具有高度特异性，与副溶血性弧菌、沙门菌、志贺菌、变形杆菌、大肠埃希菌、蜡样芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌等均无交叉反应；检测灵敏度达10cfu／ml；反应体系具有很高的稳定性；整个操作过程仅需2h。结论：本研究建立的TaqMan荧光定量PCR方法特异、灵敏、快速．适用于霍乱弧菌的日常监测和爆发疫情的应急诊断。     

荧光实时定量PCR检测铜绿假单胞菌方法建立及价值

目的建立荧光实时定量PCR（FQ-PCR）定量测定铜绿假单胞菌的方法，检测该方法的灵敏度并与传统细菌培养比较其特异性吻合率。方法选择铜绿假单胞菌的oprI基因为目的基因设计探针引物，建立Taqman探针FQ-PCR体系定量检测5种标准菌株、3种病毒株、白色念珠菌、肺炎支原体、人基因组DNA及临床培养96株菌株。结果31株铜绿假单胞菌、铜绿假单胞菌与其它菌种或人全血的混合液均产生特异扩增信号，标准曲线的相关系数为0．997；其他菌种（76株）无扩增；乙肝病毒、巨细胞病毒及肺炎支原体及健康人全血均无扩增，与传统培养相比特异性吻合率达100％，铜绿假单胞菌标准株按等级浓度稀释后其拷贝数也呈等级梯度递减，实际可检测到的最小菌落数为100个／ml，全程检测〈4h。结论荧光实时定量法检测oprI基因可以运用于铜绿假单胞菌的快速检测。     

TaqMan荧光PCR技术在霍乱弧菌毒力基因检测中的应用

目的利用快速灵敏的TaqMan实时荧光定量PCR方法检测分离到的81株霍乱弧菌的毒力基因。方法根据霍乱弧菌毒力基因ctxAB和zot分别设计特异性引物和探针,在对2组引物和探针进行灵敏度、特异性和重复性评价的基础上对分离到的菌株进行毒力基因的检测。结果81株霍乱弧菌中,有20株菌（24.7%）产CT毒素,来自于外环境的有19株;25株菌（30.9%）携带zot毒素基因;5株菌（6.2%）CT阴性而zot毒素基因阳性。使用这两套系统检测其他肠道致病菌无交叉反应,检测限可达到2～20cfu/ml。结论本研究所采用的TaqMan荧光定量PCR检测霍乱弧菌毒力基因灵敏度高,特异性好,为今后霍乱日常监测和疫情应急处理提供快检的平台。     

食品中副溶血弧菌荧光定量PCR方法快速检测

目的利用荧光定量PCR技术，建立食品中副溶血弧菌污染的快速、准确的定量检测方法。方法根据副溶血弧菌gyrase基因序列设计合成副溶血弧菌FQ-PCR诊断试剂盒，研究其灵敏度、特异性，并应用于模拟食品样本检测。结果在31株不同菌株的检测中，8株副溶血弧菌结果均为阳性，而其他23株弧菌科及其他菌属的菌株均为阴性；纯菌条件下定量检测低限10cfu／ml；对模拟样本直接进行，检测低限为10^3cfu／g，经培养增菌后，检测低限则达到2cfu／g。结论该方法特异性强、敏感性高，操作简便快速，检验周期仅需36h，扩增与检测在封闭单管进行，可避免常规PCR方法易污染缺陷，具有很好的推广应用前景。     

实时荧光定量PCR检测O139群霍乱弧菌研究

目的：利用荧光定量PCR技术,建立一种快速、准确、特异检测O139群霍乱弧菌的定量方法。方法：选取O139群霍乱弧菌糖基转移酶基因（LPSgt）作为检测的靶基因,设计引物和TaqMan探针,探针的两端均进行荧光标记。对PCR扩增体系进行优化,进一步评价实时荧光定量PCR方法的特异性、灵敏度、重复性后,对收集的临床样本进行鉴定。结果：本文所建立的实时荧光定量PCR方法可准确、特异的检测和鉴定O139群霍乱弧菌,其他菌株均无阳性结果产生;该方法的灵敏度可达到10 cfu/ml;定量检测的批间和批内的变异系数均小于5%;对85例临床样本进行评价,结果获得9例O139群霍乱弧菌阳性,与常规培养法结果完全一致。结论：本文建立的检测O139群霍乱弧菌实时荧光定量PCR方法快速、准确,结果可靠,实用性强,可对结果进行定量分析,为O139群霍乱弧菌的实验室诊断和现场流行病学调查提供了较好的分析手段。     

荧光实时定量PCR检测铜绿假单胞菌外膜蛋白oprI基因的标准品的构建

目的构建荧光实时定量PCR(FQ-PCR)标准品测定铜绿假单胞菌oprI基因,以此测定铜绿假单胞菌菌量。方法以铜绿假单胞菌的oprI基因为目的基因设计探针引物,提取细菌基因组DNA,与pMD 18-T Vector连接并转化到大肠杆菌中。用氨卞青霉素筛选出白色菌落,提取含目的基因质粒,并用HindⅢ限制酶进行线性化处理,通过直接PCR、OD值测定及DNA片段测序鉴定其特异性。根据OD值确定浓度,制备FQ-PCR梯度浓度参考标准品,做出标准曲线,检测各样品菌菌量。结果铜绿假单胞菌oprI基因的目的片段成功制备,获得稳定的重组质粒,保持了目的片段的特异性和序列完整性,并获得很好的标准曲线(相关系数0.994),成功检测了铜绿假单胞菌标准菌株、培养株的菌量,而大肠杆菌及阴性对照无扩增。结论成功构建FQ-PCR检测铜绿假单胞菌oprI基因的定量参考标准,荧光实时定量法可以快速检测铜绿假单胞菌。     

自身淬灭荧光技术定量检测临床分离的淋病奈瑟菌DNA

目的 探讨自身淬灭荧光定量聚合酶链反应（FQ-PCR）检测临床分离的淋病奈瑟菌DNA的临床应用价值。方法 以建立的淋病奈瑟菌自身淬灭FQ-PCR方法为基础，对59例疑为淋病奈瑟菌感染患者的标本进行检测，并与分离培养法进行分析比较。结果自身淬灭FQ-PCR标准品浓度为10^2～10^7拷贝／μ时，方法能够保持良好的线性关系，标准曲线为：Y=-0．273X＋10．781，相关系数为0．9895。自身淬灭FQ-PCR阳性检出率为64．41％，高于培养法52．54％（χ^2=5．14，P〈0．05）；两者特异性均为100％。结论 自身淬灭FQ-PCR用于临床分离的淋病奈瑟菌DNA检测，敏感性、特异性均高，对淋病的诊断有较高价值，实现了PCR扩增、荧光探针杂交及检测一体化，简便省时。     

FQ-PCR检测ICU病人耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的临床应用

目的探讨荧光定量PCR(FQ-PCR)技术检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的临床作用。方法选取从医院ICU病人分离出的32株金黄色葡萄球菌(金葡菌)和22株非金黄色葡萄球菌。利用荧光PCR技术和传统检测方法分离培养进行检测,对检测结果不符的菌株最终进行测序鉴定,依据鉴定效果进行比较,确定FQ-PCR法的特异性及灵敏度。结果 FQ-PCR与传统培养法对金葡菌检测准确率为100.00%,均测出32株阳性。FQ-PCR与培养药敏试验检测MRSA的符合率为93.75%,而培养药敏试验法检测为阴性而PCR法检测为阳性的2株经最后确定为阳性。结论 FQ-PCR法可用于临床对MRSA的实时检测,具有较高的临床诊断价值。     

荧光实时定量PCR检测铜绿假单胞菌外膜蛋白oprⅠ基因的标准品的构建

目的构建荧光实时定量PCR(FQ-PCR)标准品测定铜绿假单胞菌oprⅠ基因,以此测定铜绿假单胞菌菌量.方法以铜绿假单胞菌的oprⅠ基因为目的基因设计探针引物,提取细菌基因组DNA,与pMD 18-T Vector连接并转化到大肠杆菌中.用氨卞青霉素筛选出白色菌落,提取含目的基因质粒,并用HindⅢ限制酶进行线性化处理,通过直接PCR、OD值测定及DNA片段测序鉴定其特异性.根据OD值确定浓度,制备FQ-PCR梯度浓度参考标准品,做出标准曲线,检测各样品菌菌量.结果铜绿假单胞菌oprⅠ基因的目的片段成功制备,获得稳定的重组质粒,保持了目的片段的特异性和序列完整性,并获得很好的标准曲线(相关系数0.994),成功检测了铜绿假单胞菌标准菌株、培养株的菌量,而大肠杆菌及阴性对照无扩增.结论成功构建FQ-PCR检测铜绿假单胞菌oprⅠ基因的定量参考标准,荧光实时定量法可以快速检测铜绿假单胞菌.     

检测霍乱弧菌的基因芯片的制备

目的研制快速、特异、灵敏的检测霍乱弧菌基因芯片.方法选择霍乱弧菌特异的编码外膜蛋白的ompW基因和毒素ctxA基因,设计引物和探针,并制备检测芯片,通过2次PCR扩增,制备荧光标记的靶序列,并与芯片进行杂交,检测霍乱弧菌和非霍乱弧菌病原体.结果所有霍乱弧菌菌株在采用单一和多重PCR2种方法制备的荧光标记靶序列与芯片杂交,均在芯片相应探针处出现阳性信号,非霍乱弧菌菌株杂交结果均为阴性.结论霍乱弧菌基因检测芯片的研制,为霍乱弧菌感染的诊断提供了准确、快速、灵敏的方法,还可选择更多的基因位点设计探针以提高检测的可靠性,可以达到高通量、集成化和自动化的要求.     

温州口岸外环境水体中致病性弧菌的监测

〔目的〕了解温州口岸外环境水体中致病性弧菌的分布情况,为预测霍乱疫情以及制定防治策略和措施提供科学依据。〔方法〕收集口岸内有代表性的外环境水样(包括淡水、沿海水域、下水道排放口和集中式供水网点),进行弧菌科的分离鉴定,并对调查资料进行统计分析。〔结果〕(1)96份样品中55份检出了弧菌科,总检出率为57.3%。检出弧菌共分2属7种85株,其中弧菌属68株(80%);气单胞菌属17株(20%);优势菌为溶藻弧菌、河流弧菌和创伤弧菌。(2)4类外环境水样中弧菌检出率由高到低顺序为:淡水、海域水、下水道排放口、集中式供水网点,其中集中式供水网点无致病性弧菌检出。淡水、海域水、下水道排放口3类水的检出率和构成比之间差异无显著性(P检出率=0.37,P构成比=0.99);(3)6个月中,共检出2株非O1、非O139群霍乱弧菌。〔结论〕在温州口岸外环境水体中未检出所监测的O1群O139群霍乱弧菌,但检出了非O1/非O139群霍乱弧菌。     

核酸纯化对蝎型探针定量PCR准确检测结核分枝杆菌DNA的必要性研究

目的探讨经煮沸、Chelex100树脂处理、核酸纯化三种方法平行处理的标本在进行结核分枝杆菌蝎型探针荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测中的有效性,以得到标本的最佳处理效果。方法收集42例结核确诊患者的多种标本和14例非肺结核患者的痰标本,对其分别用上述3种方法平行处理后,采用蝎型探针荧光定量PCR法进行检测,并分析其结果。结果核酸纯化法处理的标本阳性检出率为100%,明显高于煮沸法57.14%和Chelex100树脂法52.38%(分别为P=0.0103,P=0.0233);尤其是外观呈血性和菌阴性的标本,采用核酸纯化法处理标本后检测所得结核DNA量较其他方法处理所得量高约1~2个数量级。结论标本的处理对于结核分枝杆菌蝎型探针荧光定量PCR检测十分重要,煮沸(裂解)法和Chelex100树脂法不适合用以处理临床标本,而应使用核酸纯化法。     

食品中副溶血弧菌FQ-PCR快速检测方法的研究

目的利用荧光定量PCR技术,研制适合各层次实验室使用的,快速、准确地检测鉴定食品中副溶血弧菌污染的定性、定量方法。方法根据副溶血弧菌gyrase基因序列,设计并合成特异性引物和荧光标记探针,将扩增后的特异片断制成阳性模板,绘制标准曲线。以副溶血弧菌菌株8株及同源、非同源参考菌株24株,做特异性检测;将阳性污染菌按梯度加入阴性样品为模拟样本,做敏感性检测。同时使用PE7000型定量PCR仪和国产DA620微量荧光检测仪检测。结果该方法有良好的特异性:8株副溶血弧菌结果均为阳性,而其它24株菌株均为阴性(其中8株是弧菌科,16株分别来自不同的菌属);该方法有良好的敏感性:阳性模板浓度与定量曲线循环阈值之间相关系数达到0.9871。在纯培养的条件下,其检测低限为10cfuml。对32个模拟样本直接进行定量检测,则检测低限在102cfug;经过24小时增菌培养,检测低限可达2cfug。结论该方法特异性强、敏感性高,操作简便快速,能避免常规PCR方法易污染的缺陷,在国产仪器上测试同样取得较好的敏感性和特异性,便于基层实验室使用,具有很好的推广应用前景。     

广州海珠地区非O1/非O139群霍乱弧菌流行状况调查及生物学特征研究

目的 了解广州海珠地区2001-2009年非O1/非O139群霍乱弧菌的流行、分布状况及生物学特征,为防控该类病原菌引起的急性腹泻病提供科学依据.方法 参照<霍乱防治手册>(第5版)中的检测方法,对本区珠江河水、饮用水、养殖水、各种海(水)产品、市售熟食等外环境标本764份、健康人群标本189份及肠道门诊腹泻患者标本3398份,共计4351份标本进行非O1/非O139群霍乱弧菌的检定.结果 4351份标本共检出非O1/非O139群霍乱弧菌101株,总检出率为2.32%;其中有66株可分型,分属于26个血清型,分型率为65.3%;VBO9、VBO38和VBO76为优势菌.外环境与腹泻患者标本中分离到9株同型别非O1/非O139群霍乱弧菌,提示两者可能存在关联.结论 非O1/非O139群霍乱弧菌在本地区的血清型分布呈现多样性,在人群中有一定的感染率;外环境中该类菌群广泛存在,对人群是一个潜在的危害因素.     

佛山市外环境水体非O1群霍乱弧菌生物学特性和流行病学研究

目的　了解佛山市外环境水体中非O1群霍乱弧菌的菌型分布及毒素携带情况。方法收集外环境水样 ,用常规的细菌培养方法分离非O1群霍乱弧菌。采用分子生物学PCR技术检测霍乱肠毒素 (CT)基因 ,用ELISA检测耐热肠毒素 (ST)和不耐热肠毒素 (LT)。结果　共检测水样 16 4 4份 ,分离到非O1群霍乱弧菌 4 78株 ,分离率为 2 9 0 7% ;血清学分型显示近年佛山市外环境水体中非O1群霍乱弧菌的主要菌型为VBO7。霍乱肠毒素基因检测阳性率为 1 91% ;耐热肠毒素、不耐热肠毒素的检出率分别为 13 14 %和 12 17%。结论　个别非O1群霍乱弧菌可同时带有多种毒力因子 ,提示佛山市外环境水体中存在的非O1群霍乱弧菌具有潜在的致病性 ,加强监测对做好感染性腹泻的防治工作实属必要。     

我国沿海五省市致病性弧菌的分布调查及病原学研究

为了解致病性弧菌在我国沿海地区的分布情况及致病规律 ,对沿海 5省市 10个地区的 51份水样及食品进行了微生物学检测和病原学调查 ,结果共检出致病性弧菌 4 5株 ,以豚鼠气单胞菌( 2 6.7% )、溶藻弧菌 ( 2 2 .2 % )和副溶血弧菌 ( 11.1% )占多数 ,这与从急性感染性腹泻病人粪便中分离的弧菌主要菌种基本相同。东海、南海和黄海致病性弧菌的分离率相近 ,在 67%～ 77%。 2 9份水源水中有 2 7份检出致病性弧菌 ,检出率为 93.1% ,共检出 38株菌 ,主要分布在江水 ( 31.5% )、河水 ( 2 6.3% ) ,其次为海水和塘水 (均为 2 1.1% )。结果表明 ,致病性弧菌在水源水中的分布与其致病性密切相关 ,应加强致病性弧菌的监控、诊断和治疗 ,以降低发病率。     

广州珠江河口地区水体中副溶血弧菌定量研究

目的了解广州珠江河口地区不同生态环境中副溶血弧菌的分布情况，为副溶血弧菌型食物中毒防控提供可靠的依据。方法2008年7月至2009年6月，根据广州珠江河口地区水网主要特征对南沙区内25个采水点（海水10个、河涌水15个）及10家养殖场、2家餐厅养殖水样的副溶血弧菌污染情况进行监测；海水、河涌水及养殖场分别对深层水与浅表水水样进行监测；海水、河涌水每月采集涨退潮的水样各1份，养殖水每月采集1次。副溶血弧菌定量分析按照GB／T4789—2003中方法进行；部分阳性菌株采用荧光定量PCR法进行毒力基因（tdh和trh小基因）的检测。结果共检测1368份水体样品，检出副溶血弧菌阳性样品373份，总阳性检出率为27．27％，海水、河涌水、养殖水的阳性栓出率分别为30．00％（144／480）、28．61％（206／720）、13．69％（23／168）（P〈0．01）；海水、河涌水、养殖水的深层水阳性检出率分别为51．67％、25．56％、16．18％，而浅表水分别为34．17％、14．44％、12．00％，海水、河涌水的深层水与浅表水阳性检出率比较差异均有统计学意义（均P〈0．01）；海水退潮时阳性检出率（60．00％）高于涨潮时（24．17％），河涌水涨潮时阳性检出率（39．44％）高于退潮时（29．44％）（均P〈0．01）；阳性检出率表现为6—8月最高（52．16％）；海水的副溶血弧菌阳性检出率及平均密度分别与水体pH和盐度呈正相关关系（r=0．23～0．65，P〈0．01或P〈0．05）；河涌水的副溶血弧菌阳性检出率与水体盐度呈正相关关系（r=0．27．P〈0．05）。检测其中120株菌株均未检出tdh和￡旃基因。结论广州珠江河口地区水体中副溶血弧菌污染严重，海水中阳性检出率高于其他环境水体，水体的阳性检出率与水体深度、潮汐、盐度、pH等因素有关。     

霍乱弧菌O1和O139血清型I类整合子的扩增与分布研究

目的扩增霍乱弧菌不同血清型I类整合子基因片段,并分析I类整合子在霍乱弧菌O1和O139血清型中的分布. 方法收集霍乱弧菌O1和O139血清型40株,根据GenBank资料设计PCR引物,扩增霍乱弧菌I类整合子基因片段,并用限制性酶切分析法进行鉴定,分析I类整合子在不同血清型的分布情况. 结果从霍乱弧菌O1和O139血清型中均能扩增约800 bp的基因片段,扩增片段经Pst I酶切后可获得671和127 bp的片段,经HindIII酶切后可获得580、160和58 bp的片段,经HindIII 和Pst I酶切后可获得453、160、127和58 bp的片段,I类整合子在O139血清型霍乱弧菌中分布多于O1血清型. 结论 I类整合子与霍乱散发菌株耐药性的传递、血清型的分布有密切的联系.