CRISPR/Cas9技术应用的研究进展

成簇的规律间隔的短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)是存在于细菌和古细菌中的获得性免疫系统,通过其转录产物crRNA(CRISPR RNA)及CRISPR相关蛋(CRISPR-associated,Cas),尤其是Cas9蛋白特异性抑制入侵的DNA.该系统由于其快捷靶向以及其作为一种特定位点核酸酶的高效性和多重修饰的可能性,被广泛应用于基因编辑领域.本文主要从CRISPR/Cas9系统的相关概念及原理、技术研究进展、应用研究进以及CRISPR/Cas9技术应用的未来发展进行阐述.     

利用GoPubMed对CRISPR相关文献的计量学分析

为了解CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)相关研究现状,笔者采用GoPubMed数据库的在线分析软件,对CRISPR相关文献进行计量分析.共检索到文献758篇.CRISPR相关研究文献呈逐年上升趋势,其中美国在CRISPR的文献数量和影响力均居首位,中国以北京地区发表文献最多(30篇).PLoS One刊登相关文献47篇,占发表总量的6.20%,居首位.CRISPR研究主题词涉及基因、基因组学、免疫等.高产作者为Horvath,共发表CRISPR相关文章11篇.利用GoPubMed可较好反映CRISPR研究的现状和发展趋势.中国CRISPR研究文献在整体质量和数量上均有待进一步提高.     

佛山学龄前儿童肺炎链球菌的传播风险和耐药特征

  目的  了解健康学龄前儿童肺炎链球菌的同源性和耐药特征, 为阻断疾病传播和指导合理使用抗生素提供依据。  方法  采用分层整群随机抽样方法, 抽取佛山市顺德区6所幼儿园中1 829名健康儿童, 进行鼻拭子采样并分离鉴定肺炎链球菌; 采用多位点序列分型进行同源性分析; 采用χ2检验、随机森林算法进行耐药特征分析。  结果  儿童鼻腔肺炎链球菌携带率为22.5%(412名), 多重耐药肺炎链球菌(MDRSP)的携带率为21.3%(390名)。菌株序列型别的同源性分析显示, 6所幼儿园菌株的同源率分别为93.5%(87/93)、91.1%(72/79)、89.2%(58/65)、88.9%(64/72)、86.2%(50/58)、77.8%(35/45);班级内同源率最高达82.8%(48/58), 班级间同源率最高为93.1%(81/87)。肺炎链球菌主要对阿奇霉素(97.1%, 400/412)、红霉素(92.0%, 379/412)、四环素(91.5%, 377/412)耐药; MDRSP主要耐药谱为同时对阿奇霉素、红霉素、复方新诺明、四环素及克林霉素不敏感。随机森林分析提示, MDRSP相关的重要耐药表型变量为阿奇霉素耐药、复方新诺明耐药、四环素耐药、克林霉素耐药、红霉素耐药(平均不纯度减少值分别为8.94, 6.92, 5.80, 4.84, 2.58)。  结论  幼儿园儿童间肺炎链球菌的交叉传播风险较高, 且直接接触传播是最主要传播途径。幼儿园和相关卫生部门应采取有效措施, 有效预防和阻断肺炎链球菌的传播。     

应用MALDI-TOF MS快速鉴定blaKPC-2基因型肺炎克雷伯菌

 目的 探讨基质辅助激光解析/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)对携带bla_KPC-2基因型肺炎克雷伯菌的快速鉴定能力。方法 收集2018年9月-2020年11月蚌埠医学院第一附属医院临床住院患者分离的肺炎克雷伯菌,采用纸片扩散法进行药敏试验。应用聚合酶链反应(PCR)方法筛选携带bla_KPC-2基因型肺炎克雷伯菌。MALDI-TOF MS鉴定菌株并收集携带bla_KPC-2基因型和碳青霉烯类敏感肺炎克雷伯菌(CSKP)的质谱图,各自选取其中70株菌株图谱,建立携带bla_KPC-2基因型和CSKP的超级图库(Super-Spectra)。采用超级图库鉴定除建库以外的肺炎克雷伯菌,根据耐药表型和PCR结果,判断鉴定结果是否准确。结果 共收集295株肺炎克雷伯菌,经耐药表型筛选耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌(CRKP)143株和CSKP 152株。CRKP中鉴定出140株携带碳青霉烯酶基因(134株检出bla_KPC-2基因,3株检出bla_KPC-18基因,2株检出bla_NDM-1基因,1株检出bla_IMP基因),3株不携带碳青霉烯酶基因;其中2株同时检出bla_KPC-2基因和bla_NDM-1基因。根据建库要求,建立携带bla_KPC-2基因型和CSKP的超级图库(Super-Spectra);设置error值<0.5,二者重合率达80%;对比图发现,4 154.4、8 310.7、10 880.8、3 579、10 079.3 m/z五个峰可作为区分携带bla_KPC-2基因肺炎克雷伯菌和CSKP的特征峰。选取除建库以外的155株肺炎克雷伯菌进行验证,准确率为92.90%(144/155);其中携带bla_KPC-2基因肺炎克雷伯菌准确率为94.52%(69/73),CSKP准确率为91.46%(75/82)。结论 通过MALDI-TOF MS建立Super-Spectra,可快速预测bla_KPC-2基因型肺炎克雷伯菌,为临床CRKP感染的诊疗及医院感染防控提供可靠的实验室依据。     

尿路感染产KPC-2酶肺炎克雷伯菌对磷霉素耐药机制研究

目的探讨尿路感染产KPC-2酶肺炎克雷伯菌对磷霉素的耐药情况及机制。方法收集2017年1月-12月浙江省人民医院分离的产KPC-2酶肺炎克雷伯菌16株,采用琼脂稀释法测定磷霉素敏感性;对磷霉素耐药基因fosA、fosB、fosC、fosX进行PCR扩增及测序分析;对磷霉素耐药肺炎克雷伯菌株进行多克隆位点序列测定及质粒接合试验。结果收集的16株尿路感染产KPC-2酶肺炎克雷伯菌对磷霉素的耐药率为43.8%(7/16),7株磷霉素耐药株均携带fosA3耐药基因,未检到fosB、fosC、fosX耐药基因;携带fosA3基因的产KPC-2酶肺炎克雷伯菌均为ST11型别,并通过接合实验将fosA3转移至受体菌E.coli J53中。结论基因fosA3是介导本院尿路感染产KPC-2酶肺炎克雷伯菌磷霉素耐药的主要机制。此外,以ST11克隆型别为主的产KPC-2酶肺炎克雷伯菌对磷霉素耐药具有较高水平,临床应谨慎选择磷霉素作为治疗尿路感染产KPC酶肺炎克雷伯菌感染的辅助药物。     

全基因测序法分析肺炎克雷伯菌JM45株对喹诺酮类药物耐药基因

目的分析泛耐药肺炎克雷伯菌JM45株携带的喹诺酮类药物耐药基因,研究其对喹诺酮类药物的耐药机制。方法采用Roche454高通量测序技术对肺炎克雷伯菌JM45株做全基因组测序(完成图),分析喹诺酮类耐药基因携带状况,再将gyrA与parC全长基因与其他6株肺炎克雷伯菌做分子进化分析。结果最终得到JM45株一条完整的基因组(染色体)序列及两条质粒序列;基因组(染色体)序列大小为5 273 812bp(GC含量65.8%),质粒1序列大小为317 156bp(GC含量53.0%),质粒2序列大小为12 209bp(GC含量55.3%);在基因组(染色体)序列中携带了gyrA基因(全基因组Feature ID:KPN_1614),parC基因(Feature ID:KPN_0743);与肺炎克雷伯菌喹诺酮类药物敏感株相比较,gyrA基因第83位密码子由TCC→ATC,翻译成氨基酸序列后丝氨酸(Ser)→异亮氨酸(Ile),parC基因第80位密码子由AGC→ATC,翻译成氨基酸序列后丝氨酸(Ser)→异亮氨酸(Ile)。结论肺炎克雷伯菌JM45株喹诺酮类药物耐药是gyrA基因和parC基因喹诺酮耐药决定区(QRDR)突变所致;gyrA与parC全长基因的分子进化分析提示JM45株与肺炎克雷伯菌HS11286关系最为接近(序列相同),与肺炎克雷伯菌342关系最远。     

2019年安徽省皖北、皖中和皖南地区细菌耐药差异性分析

  目的  分析2019年安徽省皖北、皖中和皖南地区细菌临床分布和耐药差异性，为不同地区临床医生选择抗菌药物提供合理参考。  方法  收集2019年安徽省细菌耐药监测网38家成员单位临床分离菌株按地区分成皖北、皖中和皖南地区，采用WHONET 5.6软件和SPSS 17.0软件进行统计分析。  结果  皖北地区耐甲氧西林金黄色葡萄球菌检出率高于皖中和皖南地区，铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌对头孢哌酮/舒巴坦耐药率分别为20.8%和60.4%；皖中地区耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌高于皖北和皖南地区，肺炎克雷伯菌对头孢菌素类耐药率＞40.0%，对亚胺培南和美洛培南耐药率＞20.0%；皖南地区耐甲氧西林葡萄球菌对氨基糖苷类和喹诺酮类耐药率高于皖北地区。  结论  安徽省不同地区之间细菌耐药差异明显，需根据本地区细菌耐药情况合理选用抗菌药物。     

产超广谱β-内酰胺酶菌的耐药性与基因型分析

目的 分析医院急诊科3年内产超广谱β内酰胺酶(ESBLs)大肠埃希菌与肺炎克雷伯菌的耐药性及基因型,以指导临床用药.方法 采用ESBLs表型确证试验筛选产ESBLs大肠埃希菌与肺炎克雷伯菌,提取产ESBLs菌的质粒DNA,应用聚合酶链反应(PCR)扩增产ESBLs株质粒TEM、SHV、CTX-M1、CTX-M9和OXA5种基因,并对其扩增物进行DNA序列分析,测定大肠埃希菌与肺炎克雷伯菌对17种抗菌药物的耐药性.结果 共检出143株大肠埃希菌与77株肺炎克雷伯菌,其中84株为产ESBLs菌,占38.2％;ESBLs研究菌株全部携带TEM型、77.4％携带CTX-M9型基因;同一菌株携带2、3、4个基因的菌株比例分别为44.8％、33.3％和7.1％;产ESBLs大肠埃希菌与肺炎克雷伯菌为多药耐药菌,其中对青霉素类、第一、二、三代头孢菌素类、磺胺类和氟喹诺酮类耐药率高达80.0％～100.0％;碳青霉烯类对产ESBLs细菌仍保持较高的抗菌效果.结论 产ESBLs大肠埃希菌与肺炎克雷伯菌耐药基因,以TEM型和CTX-M9型为主,携带＞2个耐药基因的产ESBLs菌株比例较高;产ESBLs大肠埃希菌与肺炎克雷伯菌对含酶抑制剂的抗菌药物、碳青霉烯类抗菌药物仍保持较高的敏感性,研究中发现美罗培南耐药菌株,应引起临床重视.     

产AmpC肺炎克雷伯菌质粒介导的多药耐药性与基因型研究

目的探讨产AmpC肺炎克雷伯菌耐药质粒介导的多药耐药性、耐药基因类型及转移方式。方法应用VITEK-2型全自动细菌鉴定仪鉴定细菌,头孢西丁纸片扩散法筛选出疑产AmpC酶阳性菌株,采用接合转移试验了解肺炎克雷伯菌耐药基因转移方式,通过K-B法检测受体菌的多药耐药性,并通过酶粗提物头孢西丁三维试验和PCR测序等试验分析其耐药基因。结果 820株临床分离的肺炎克雷伯菌筛选出疑产AmpC酶阳性菌株108株,阳性率为13.17%;108株疑产AmpC菌经接合试验、AmpC酶表型确认试验获53株产AmpC接合子;经基因测序单纯AmpC酶基因阳性菌株34株,阳性率64.15%;同时携带ESBLs和AmpC基因菌株检出19株,阳性率35.85%;其均能通过接合转移方式将其质粒携带的耐药性传递至受体菌。结论质粒介导AmpC酶是肺炎克雷伯菌产生多药耐药的重要原因,产酶株对多种抗菌药物耐药,耐药基因质粒的转移可导致耐药性的传播扩散。     

2型糖尿病合并感染患者的肺炎克雷伯菌分布及耐药特征分析

目的分析2型糖尿病(T2DM)合并感染患者的肺炎克雷伯菌分布及耐药特征。方法从126例T2DM合并感染患者的痰液、尿液等标本分离肺炎克雷伯菌,全自动微生物分析仪鉴定细菌及药敏试验,测定菌株产超广谱β-内酰胺酶(ESBL)情况。结果126株来自T2DM合并感染患者的肺炎克雷伯菌,在痰液、尿液、血液、脓液及其他标本的构成比分别为45.2%、19.1%、12.7%、9.5%和13.5%;痰液的肺炎克雷伯菌对头孢哌酮/舒巴坦耐药率(31.7%)高于非痰液标本(22.2%)(P<0.01),痰液的肺炎克雷伯菌对庆大霉素耐药率(23.0%)高于非痰液标本(15.9%)(P<0.05);双重耐药、3种及以上药物耐药菌株检出率均高于单一耐药菌株检出率(P<0.01);痰液的产ESBL酶肺炎克雷伯菌检出率(17.5%)高于非痰液标本(6.3%)(P<0.01)。结论T2DM合并感染患者的肺炎克雷伯菌主要分布在痰液和尿液中,菌株交叉耐药现象较严重,产ESBL肺炎克雷伯菌趋于增多。     

煤工尘肺合并下呼吸道感染患者支气管肺泡灌洗液培养特点及病原菌分析

  目的  探讨某市煤工尘肺合并下呼吸道感染支气管肺泡灌洗液（BALF）培养特点、病原菌分布及耐药性。
  方法  选择2017年2月—2019年8月在新疆维吾尔自治区职业病医院就诊的煤工尘肺合并下呼吸道感染314例患者,患者均接受支气管肺泡灌洗液检查,根据《全国临床检验操作规程》第3版,细菌菌落数≥ 104 CFU/mL认定为病原菌。药敏试验采用纸片扩散法和E-Test法,药敏结果参照美国临床实验室标准化委员会（CLSI）2015年版指南及FDA标准。
  结果  314份支气管肺泡灌洗液样本中有203份样本分离出病原菌总计261株,检出率为64.65%。其中革兰阴性菌126株,占48.28%;革兰氏阳性菌51株,占19.54%;真菌84株,占32.18%。药敏结果显示,肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、产酸克雷伯菌对头孢类、磺胺类和呋喃类药物耐药较为明显,对碳青霉烯类较为敏感。肺炎链球菌对万古霉素、利福平敏感,对复方新诺明、红霉素、克林霉素、青霉素、四环素耐药严重;粉肠球菌对利奈唑胺、万古霉素敏感,对红霉素、青霉素、庆大霉素、四环素、左氧氟沙星、奎奴普丁/达福普汀耐药严重。
  结论  支气管肺泡灌洗液具有较高的病原菌株检出率。该市煤工尘肺合并下呼吸道感染患者真菌检出率高,革兰氏阳性菌和阴性菌均有严重耐药性,应予以重视。BALF病原菌培养对指导临床选择敏感抗菌药物具有重要临床价值。
     

临床分离革兰阴性菌金属β-内酰胺酶基因检测及其同源性分析

目的了解临床分离革兰阴性菌产IMP及VIM金属β-内酰胺酶(MβLs)基因的检出情况,以及对β-内酰胺类抗生素的耐药状况。方法采用K-B法对临床分离的113株细菌进行药物敏感试验,采用聚合酶链反应(PCR)检测耐药基因IMP和VIM,测序并进行BLAST比对分析。结果1株荧光假单胞菌检出VIM基因;15株菌中检出IMP基因,其中肺炎克雷伯菌6株,鲍曼不动杆菌3株,大肠埃希菌2株,罗尔斯顿菌、铜绿假单胞菌、无丙二酸柠檬酸杆菌、阴沟肠杆菌各1株。BLAST结果显示,VIM基因为VIM-2型,与基因库中序列相似度99%;IMP基因均为IMP-1亚型,相似度在98%~99%,高度同源。IMP阳性菌株对头孢曲松、头孢噻肟、头孢西丁、氨曲南和亚胺培南的耐药率高于阴性菌株,差异均具有统计学意义(均P0.05)。结论不同菌株IMP基因高度同源,均为IMP-1型,表明IMP基因的传播能力很强,可以突破种属的限制在不同细菌中传播。IMP基因与细菌对β-内酰胺类抗生素耐药相关。     

接种13价肺炎球菌结合疫苗对就诊儿童肺炎链球菌血清型和耐药性的影响

  目的  了解就诊儿童肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae, Spn)血清型分布和耐药特征,探索接种13价肺炎球菌结合疫苗(13-valent pneumococcal conjugate vaccine, PCV13)对Spn的影响。  方法  收集2017—2019年苏州大学附属儿童医院疫苗接种信息明确的就诊儿童的Spn菌株,根据疫苗接种情况进行分组,并采用荚膜肿胀法进行血清分型,E-test法检测菌株抗生素的耐药性,比较是否接种PCV13对Spn血清型和耐药性的差别。  结果  共收集692株Spn,其中20株分离自接种PCV13儿童。接种组中常见的血清型为19F、6B、19A、23F,对照组中常见的血清型为19F、6B、23F、19A、14,两组血清型分布差别无统计学意义(P=0.868),PCV13血清型覆盖率分别为70.0% 和72.4%(P=0.491)。所有菌株对红霉素、四环素、克林霉素高度耐药,且多重耐药率达98.5%。接种组和对照组的Spn菌株对青霉素的不敏感率分别为5.0%和9.1%(P=0.804)。  结论  苏州大学附属儿童医院监测就诊儿童Spn血清型以PCV13覆盖的血清型为主,菌株对β-内酰胺类抗生素的耐药性有所下降,但对红霉素等其他常用抗菌药物的耐药性依旧严峻,并存在大量的多重耐药情况。尚未观察到接种PCV13对菌株血清型分布及降低抗生素耐药性的明显效果。     

2013-2017年河南省婴幼儿志贺菌流行特征与耐药分析

  目的  了解河南省2013-2017年婴幼儿志贺菌的病原学特征。  方法  以河南省5岁以下腹泻患儿5 149份粪便分离的606株志贺菌为研究对象,采用血清分型、药物敏感试验及聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)检测毒力基因方法,对其进行病原学检测。  结果  儿童志贺菌总检出率为11.77%(606/5 149),1~岁年龄组幼儿检出率最高,为24.08%;606株志贺菌共分为2群、11种血清型,其中福氏志贺菌占73.43%,宋内志贺菌占26.57℅。176株志贺菌对氨苄西林、萘啶酸的耐药严重(耐药率>90%),对氯霉素、环丙沙星,诺氟沙星、复方新诺明的耐药率>65%,对亚胺培南和头孢类抗生素敏感度较高,且福氏与宋内志贺菌耐药有差异。婴幼儿毒力基因组合模式以shET-1+、shET-2+、ipaH+、ial+为主,并检出5株无毒力株。  结论  河南省婴幼儿细菌性痢疾以福氏志贺菌为主,对常用的抗生素存在严重的耐药问题,不同血清型菌株携带优势基因模式不同。     

山东省2011-2014年志贺氏菌分子分型及耐药性分析

  目的  通过对山东省2011-2014年分离的志贺氏菌（Shigella）进行血清、毒力基因、分子分型和药敏等分析,了解山东省志贺氏菌的特性及流行趋势。  方法  用玻片凝集法进行血清分型,PCR方法扩增相关毒力基因,用脉冲场凝胶电泳技术进行分子分型,采用微量肉汤稀释法测定菌株抗生素敏感性。  结果  44株志贺氏菌主要为福氏志贺氏菌（Shigella flexneri）（54.55%）和宋内志贺氏菌（Shigella sonnei）（43.18%）。ipaH、set1、sen、ial毒力基因携带率分别为100%、43.18%、56.82%、50.00%。经脉冲场凝胶电泳分型（pulsed field gel electrophoresis,PFGE）,福氏志贺氏菌被分为18种带型,且总体相似度偏低;宋内志贺氏菌被分为14种带型,且89.47%的菌株相似度在90%以上。44株志贺氏菌对15种抗生素中的14种均存在不同程度的耐药。93.18%的菌株为多重耐药菌株。  结论  山东省志贺氏菌以福氏和宋内血清群为主,毒力基因携带率高,有聚类分布出现,耐药严重,应加强对志贺氏菌菌型、溯源和耐药性的监测。     

肠杆菌科细菌qnr耐药基因的流行现状及耐药分析

目的了解质粒介导喹诺酮类耐药基因qnrA、qnrB、qnrS在临床分离大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、阴沟肠杆菌、鲍氏不动杆菌中的流行情况及其耐药特征。方法收集临床分离的4种肠杆菌科细菌共148株,用法国生物梅里埃公司VITEK-2全自动细菌鉴定仪进行菌株鉴定和药敏试验,用qnr特异性基因引物进行聚合酶链反应(PCR)扩增和基因型的测序分析,并通过网上GenBank进行比对以确定编码酶基因的类型。结果对喹诺酮类耐药的50株大肠埃希菌检出qnrA1株(2.0%)、qnrB5株(10.0%)、qnrS3株(6.0%),有1株同时携带qnrB、qnrS;30株肺炎克雷伯菌检出qnrA1株(3.3%)、qnrB8株(26.7%)、qnrS10株(33.3%),有3株同时携带qnrB、qnrS;18株阴沟肠杆菌检出qnrA13株(72.2%)、qnrB5株(27.8%)、qnrS4株(22.2%),有3株同时携带qnrA、qnrS,3株同时携带qnrA、qnrB;50株鲍氏不动杆菌未检出qnr基因;携带qnr基因肠杆菌科细菌对氨苄西林/舒巴坦、氨曲南、头孢他啶、头孢曲松、头孢吡肟、磺胺甲噁唑/甲氧苄啶的耐药率均>70.0%,呈现出多药耐药现象。结论医院临床分离4种对喹诺酮类药物耐药的肠杆菌中,除鲍氏不动杆菌未检出qnr基因,其余3种均检出qnrA、qnrB、qnrS基因,以阴沟肠杆菌检出率最高,其次为肺炎克雷伯菌;携带qnr基因肠杆菌科呈现出多药耐药现象;医院在抗菌药物选择压力下,存在质粒介导喹诺酮类耐药基因qnr的流行。     

血流感染肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类抗菌药物耐药机制研究

目的了解临床血流感染肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类抗菌药物的耐药机制,为其治疗提供实验依据。方法收集浙江省人民医院2016年1月-12月门诊及住院患者血流感染肺炎克雷伯菌72株,应用法国梅里埃VITEK 2 Compact检测肺炎克雷伯菌药物敏感性;应用PCR法检测相关碳青霉烯酶耐药基因(blaKPC、blaNDM、blaVIM、blaIMI、blaIMP和blaOXA-48),应用MLST方法检测菌株克隆型别。结果 2016年1月-12月门诊及住院患者血流感染肺炎克雷伯菌72株,其中碳青霉烯敏感肺炎克雷伯菌(CSKP) 48株,占66.7%,碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌(CRKP) 24株,占33.3%;肺炎克雷伯菌对常用抗菌药物敏感性均较低,特别是β-内酰胺类抗菌药物。替加环素体外显示出极高敏感性,仅4.2%菌株耐药;24株菌株全部检出blaKPC-2基因,其他耐药基因未检出。结论本院血流感染肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类抗菌药物的耐药机制主要是产KPC-2酶。碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌在本院呈克隆播散趋势,应引起临床高度重视。