EV71TaqMan PCR检测方法的建立及初步应用

[目的]建立肠道病毒71型(enterovirus71)核酸的特异、快速、敏感的TaqMan探针PCR检测方法. [方法]根据GeneBank发表的EV71全基因组序列,在其VP1基因区段设计特异的引物与探针;以构建的重组质粒为模板,优化探针和引物浓度、最佳反应条件,建立最优化的实时定量PCR方法,评价其灵敏性、特异性和稳定性. [结果]引物和探针有良好的特异性,使用浓度为为0.8μM和0.4μM,可检测到100个RNA拷贝数,较传统的RT-PCR检测方法敏感性提高了100倍;同一样品Ct值重复检测3次,变异系数小于5%,表明该体系具有较好的稳定性. [结论]本研究建立的肠道病毒EV71-TaqMan荧光定量PCR方法,具有特异、灵敏、快速的特点,适用于由EV71感染引起的手足口病等的实验室早期诊断.     

新型细菌耐药基因NDM-1实时PCR检测方法的建立

目的 建立灵敏、特异、快速的TaqMan荧光定量PCR方法用于快速检测新型细菌耐药基因NDM-1.方法 根据NCBI数据库中β-内酰胺酶类相关耐药基因的序列,详细进行比对,选择特异性最高的片段设计引物和TaqMan探针,建立基于TaqMan探针的实时荧光PCR方法.对所建立的实时荧光PCR检测方法进行灵敏度和特异度评价.结果 本方法对各种细菌病原体的新型细菌耐药基因NDM-1的检测具有高度特异性和灵敏度.优化后的引物浓度为200 nmol/L,探针浓度为100 nmol/L,灵敏度和特异度均为100％.该方法的检测下限能达到1.0×102拷贝/μl,远远高于普通PCR1.0×105拷贝/μl的检测下限.结论 所建立的方法能够特异和敏感地检测携带NDM-1基因的超级细菌,能够作为携带有该基因细菌的灵敏快速的检测方法.     

食品中沙门菌实时荧光PCR快速检测方法的研究

目的利用荧光定量PCR技术，建立食品中沙门菌污染的快速敏感特异的检测方法。方法以沙门菌的fimY基因作为靶序列，设计一对引物和探针，以沙门菌菌株提取核酸DNA作为模板，优化引物和探针的浓度比和Mg^2＋浓度，以沙门菌和10种相关细菌考核检测体系的灵敏性、稳定性和特异性，并初步应用于样品的检测。结果本研究建立的反应体系在引物和探针的浓度为0．8μmol／L，1．0μmol／L，Mg^2＋浓度为3mmol／L时，具有良好的特异性和敏感性。在10株相关菌株的检测中，除沙门菌出现很好的阳性外，其余菌株均为阴性。在纯菌条件下，定量检测低限33cfu／ml。稳定性分析表明：同一样品重复检测3次Ct值的变异系数均小于5％。检测样品结果显示实时PCR方法较传统方法敏感、快捷、简便。结论该方法特异性强，稳定性高，操作简便快捷，适应食品微生物检验发展需要，具有较大的推广及应用价值。     

A型肉毒梭菌atx基因TaqMan探针荧光定量PCR检测

目的采用TaqMan探针荧光定量PCR方法对A型肉毒梭菌atx基因进行检测。方法以atx基因为靶基因,设计引物和TaqMan探针,优化反应条件,制作定量标准曲线,进行灵敏度、特异性和重复性验证,建立A型肉毒梭菌TaqMan荧光定量PCR检测方法。结果构建质粒pUC57-△atx,标准曲线在103～107拷贝数之间有较好的线性关系,相关系数为0.997,灵敏度达到22个拷贝数,比普通PCR提高约100倍;能选择性检测A型肉毒梭菌,与其他5种食源性病原菌无交叉反应,结果与普通PCR一致;重复性试验表明,同一浓度的15个平行样品的变异系数为1.0%。结论 A型肉毒梭菌TaqMan探针荧光定量PCR方法具有灵敏度高、特异性强、重复性好等特点,可以快速、准确、定量地检测A型肉毒梭菌。     

甲肝病毒TaqMan PCR检测方法的建立

目的建立以特异性荧光探针为特点的TaqMan荧光定量RT-PCR方法,对甲肝病毒核酸进行检测。方法根据GenBank发表的HAV全基因组序列资料分析结果,在其保守区段设计HAV特异性引物和探针,优化引物、探针浓度,与最佳退火温度,并考察检测体系的特异性、敏感性与重复性。结果本研究体系的引物和探针浓度为0.8μmol/L和0.6μmol/L,退火温度为52℃时,具有良好的特异性与敏感性,检测灵敏度可达0.1TCID50。同一样品重复检测3次,Ct值的变异系数均小于5%。结论本研究建立的HAV TaqMan RT-PCR方法特异、敏感、快速且有效减少交叉污染的概率,为临床及水产品中的甲肝病毒的早期快速检测提供了一种新方法。     

溶藻弧菌TaqMan实时PCR快速检测体系的建立

目的:建立溶藻弧菌TaqMan实时PCR快速检测体系。方法:根据溶藻弧菌胶原酶基因colH的保守序列设计一对引物和一条TaqMan探针,优化反应体系中的引物浓度和探针浓度,评价此反应体系的特异度,并确定其检测下限。结果:优化的反应体系中,引物浓度为200 nmol/L,探针浓度为200 nmol/L,检测下限为1.0×102拷贝/μl,较普通PCR提高了100倍。特异度为100%。结论:本研究所建立的检测体系能够灵敏和特异地检测溶藻弧菌,可以作为溶藻弧菌的快速检测方法。     

霍乱毒素基因(ctx)和耐热直接溶血素基因(tdh)双重TaqMan实时PCR检测方法的建立

[目的]建立霍乱毒素和耐热直接溶血素基因双重TaqMan实时-PCR实验室检测方法。[方法]根据霍乱毒素基因(Cholera toxin gene,ctx)和耐热直接溶血素基因(thermostable direct hemolysin,tdh)的保守序列设计引物和TaqMan探针,建立检测霍乱毒素和耐热直接溶血素两种毒力基因的双重TaqMan实时PCR方法。对所建立的霍乱毒素基因和耐热直接溶血素基因双重TaqMan实时PCR检测方法进行灵敏度和特异度评价。[结果]建立了霍乱毒素基因和耐热直接溶血素基因双重TaqMan实时PCR的实验室检测方法。优化的tdh和ct双重TaqMan实时PCR反应体系中,ct引物和探针的浓度分别为200nmol/L和100nmol/L;tdh引物和探针的浓度分别为200nmol/L和100nmol/L。反应体系的灵敏度和特异度均为100%。优化的反应体系对两种质粒模板的检测下限均为1.0×102拷贝/μl,扩增效率分别为94%和97.7%。[结论]本研究建立了基于TaqMan探针的tdh和ct双重实时PCR检测方法,具有令人满意的灵敏度和特异度。检测下限能达到1.0×102拷贝/μl,高于普通PCR100倍。并且双重实时PCR能够在一个反应体系中同时检测两种毒力基因,这为费时又繁琐的传统检测方法提供了一种可靠又快速的替代选择。     

泰泽氏菌TaqManMGB探针荧光定量PCR方法的—立及应用

目的 建立泰泽氏菌的TaqMan小沟结合物(MGB)探针荧光定量PCR检测方法.方法 针对泰泽氏菌16S rRNA基因的保守区设计特异性引物和探针,建立MGB探针荧光定量PCR方法,并验证该方法的特异性、敏感性和稳定性.对2008-2011年采集的1156份临床样本进行检测,同时进行普通PCR检测作为对照.结果 泰泽氏菌TaqMan MGB探针荧光定量PCR方法具有高度特异性,与肝螺杆菌、幽门螺杆菌、空肠弯曲菌、侵肺巴斯德氏菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌之间无交叉反应,检测灵敏度达2.2 copy/μl.标准曲线显示各浓度范围内具有良好线性关系,相关系数为0.999,斜率为-3.204,PCR效率为100％.对1156份临床样本进行检测,荧光定量PCR检出101份泰泽氏菌阳性样本,而普通PCR则仅检出44份.荧光定量PCR方法从临床样本中检出泰泽氏菌DNA仅需2h.结论 TaqMan MGB探针荧光定量PCR方法具有特异、灵敏和稳定性,适于泰泽氏菌的快速检测.     

饮用水大肠菌群Taqman-MGB荧光定量PCR检测方法研究

[目的]建立快速、灵敏、特异的饮用水大肠菌群荧光定量PCR定量检测方法.[方法]以大肠菌群的lacZ基因为检测靶基因,设计荧光定量PER引物和Taqman-MGB探针,建立荧光定量PER定量反应体系,并评价荧光定量PER方法的灵敏度、特异性、重复性.[结果]建立大肠菌群的荧光定量PER检测方法.25μl荧光定量PER反应体系主要成分浓度分别为Mg2+5.0 mmol/L,dNTPs 0.2 mmol/L,引物0.2μmol/L,探针0.5μmol/L,4xROX参比荧光染料0.5μl,Taq DNA聚合酶2.0 U,模板5μl.方法可检出每微升单个拷贝大肠菌群模板,方法的特异性、重复性良好.[结论]荧光定量PER方法可快速、灵敏、特异地检出水质中大肠菌群,可为饮用水大肠菌群快速检测标准方法的建立提供参考.     

诺如病毒遗传组Ⅱ型TaqMan—MGB探针实时荧光PCR的检测研究

目的建立特异、灵敏的诺如病毒遗传组Ⅱ型TaqMan—MGB探针实时荧光PCR快速检测方法。方法根据GenBank诺如病毒遗传组Ⅱ型代表株保守序列设计特异引物对和TaqMan～MGB探针，调整引物、探针浓度，优化最佳反应条件，建立一步法实时荧光PCR快速检测反应体系，进行灵敏度、特异性、稳定性试验，以评价反应体系，并与引物P289／P290常规RT—PCR进行灵敏度比较。结果诺如病毒遗传组Ⅱ型TaqMan—MGB探针实时荧光PCR检测时限短，仅1h就出结果；最低检出下限为100拷贝/mL，比引物P289／P290常规RT—PCR灵敏度高100倍；与轮状病毒、腺病毒、星状病毒、甲肝病毒无交叉反应；4份核酸含量不同的标本重复检测5次，平均G值变异系数范围0．96％-2．27％。结论诺如病毒遗传组Ⅱ型TaqMan—MGB探针实时荧光PCR快速、特异、灵敏、稳定性好。可应用于突发公共卫生应急检测，提高快速检测能力。     

一步法流行性乙型脑炎病毒TaqMan荧光定量反转录聚合酶链反应方法的建立及应用

目的 建立一种特异、灵敏、快速检测流行性乙型脑炎(乙脑)病毒的荧光定鼍RT-PCR方法.方法 根据GenBank登录的乙脑病毒毒株序列,应用生物软件在乙脑病毒基因的保守区设计与筛选引物和探针,对荧光定量RT-PCR反应体系与条件进行优化,验证方法的特异性、敏感性和重复性.并通过对蚊虫样本的检测,以评价该方法的实际应用价值.结果 优化结果表明荧光定量RT-PCR的最佳反应体系为0.1 μmol/L探针浓度,0.2μmol/L引物浓度,5 mmol/L Mg2+浓度.结果 表明该方法对乙脑病毒的检测有高度的特异性、通用性,对1～4型登革热病毒、狂犬病毒、汉坦病毒(SEO型与HTN型)均无交叉反应,检测的灵敏度达0.1 TCID50,重复性分析表明同一样品Gt值的重复检测4次,其标准差均在合理范围内,分别为0.033、0.079、0.149和0.411.对110批蚊虫标本进行荧光定量RT-PCR检测和病毒分离榆测,结果荧光定量RT-PCR检测出7份阳性,而病毒分离则只检测出3份阳性,表明建立的荧光定量RT-PCR方法更敏感,可直接从蚊虫样本中检测乙脑病毒核酸,从病毒核酸提取至完成检测仅需3 h左右,且操作简便、敏感性高.结论 研究建立的TaqMan荧光定量RT-PCR的方法具有特异、敏感、快速的特点,适用于乙脑病原学的快速检测.     

表面等离子体共振传感器技术在检测甲型流感病毒中的应用研究

目的 建立一种基于表面等离子体共振传感器技术检测人类甲型流感病毒的方法,并进行初步诊断应用.方法 分别设计基于甲型流感M基因的引物和探针,制备RT-PCR扩增产物,优化并确定基于传感技术的实验条件,建立高灵敏度和高特异度的表面等离子体共振传感器方法.结果 缓冲液的盐离子强度和pH值是影响杂交效果的关键因素,对其优化后标...     

肠道病毒TaqMan荧光定量RT-PCR法快速检测

目的建立一种特异、灵敏、快速的荧光定量RT-PCR方法检测肠道病毒核酸,应用于暴发疫情的实验室应急检测。方法根据GenBank登录的肠道病毒基因序列,应用生物学软件进行序列比对,在肠道病毒基因的保守区设计特异性引物和TaqMan探针;对荧光RT-PCR反应条件进行优化,验证方法的特异性和灵敏度。同时对疑似肠道病毒感染者的临床样本进行检测。结果该方法对肠道病毒的检测有高度的特异性,可检出脊髓灰质炎、柯萨奇和埃可等肠道病毒,与腮腺炎、麻疹、风疹、乙型脑炎等病毒均无交叉反应。检测的灵敏度达0.1病毒效价滴定（TCID50）;可直接从疑似肠道病毒感染者的脑脊液、疱疹液和粪便等标本中检测肠道病毒核酸,从病毒核酸提取至完成检测仅需3 h左右。结论所建立的TaqMan荧光定量RT-PCR是一种快速检测肠道病毒特异、敏感的方法,适用于由肠道病毒感染引起的应急疫情的实验室早期诊断。     

TaqMan实时荧光定量PCR检测肠道细菌Akkermansia Muciniphila

目的 建立Akkermansia muciniphila(A.muciniphila)TaqMan实时荧光定量PCR检测方法,实现粪便中A.muciniphila的定量检测。方法 根据GenBank公布的A.muciniphila 16S rRNA基因高保守序列,设计合成特异引物和TaqMan探针,构建重组质粒作为标准品,通过反应体系和反应条件的优化,绘制标准曲线,同时将建立的方法用于10份成年人粪便标本的检测。结果 TaqMan实时荧光定量PCR检测A.muciniphila,仅需1.5h,该方法线性好,相关系数R²=0.9991,扩增效率E=94.7%;重复性好,组内和组间变异系数均小于3%;灵敏度可达到5×10³拷贝/μl;特异性良好。10份成年人粪便标本共检出9份为阳性,阳性粪便标本中A.muciniphila平均含量为2.70×108cells/g粪便。结论 本研究建立的TaqMan实时荧光定量PCR能够快速、灵敏、特异地定量检测粪便标本中A.muciniphila。     

一种无RNA纯化步骤TaqMan RT-PCR方法用于快速检测登革病毒

目的 建立一种简便、快速的登革病毒核酸检测方法.方法 设计合成LNA探针,替代MGB探针,建立一步法TaqMan RT-PCR方法,并用已知的登革病毒标准毒株进行方法的优化;用商品化的纯化试剂盒和简单的热释放法获取登革病毒细胞培养液和模拟含登革病毒血清中RNA,以优化的TaqMan RT-PCR方法进行检测,比较有或无RNA纯化步骤检测的敏感性和重复性.结果 LNA探针TaqMan RT-PCR有较好的PCR扩增效率(104%)、较广的线性范围(10 0～10-7样品稀释度)、较高的敏感性(0.003TCID50/反应)和较好的重复性(CV值小于4.53%),新方法检测经简单热释放RNA的细胞培养液和模拟含登革病毒血清中登革病毒也有较高的敏感性(0.03TCID50/反应)和较好的重复性(CV值小于6.36%).结论 新型LNA探针可替代MGB探针用于TaqMan RT-PCR反应,简便的热释放RNA方法结合高敏感性的TaqMan RT-PCR可满足登革病毒快速检测的需要.     

基孔肯雅病毒荧光定量PCR检测方法的建立

目的建立一种快速、敏感、特异的实时荧光定量PCR方法,检测基孔肯雅病毒。方法通过序列比对挑选出基孔肯雅病毒基因组中高度保守的序列,在此序列上设计引物及TaqMan探针,建立实时荧光定量PCR反应体系。结果经优化的荧光定量PCR方法有较好的灵敏度和特异性,对阳性对照质粒标准品的灵敏度可达21拷贝/μl,通过检测与传播媒介相似的流行性乙型脑炎病毒、黄热病毒、登革热病毒无交叉反应。结论该方法的建立在基孔肯雅热的疾病防控方面有较好的应用前景。     

扎伊尔型埃博拉病毒实时荧光定量PCR方法的建立

目的 建立扎伊尔型埃博拉病毒实时荧光定量PCR快速检测技术。方法 人工合成扎伊尔型埃博拉病毒包膜糖蛋白GP基因上1 969～2 113 bp的保守特异片段,克隆到pUC57重组质粒中,构建阳性模板;以103～109拷贝数的重组质粒样品共7组作为标准品,制作标准曲线;设计上游引物5' - GAACCACATGATTGGACCAAGA - 3'、下游引物5' - TAACTCCAATACCTGCCGGTATC - 3'及TaqMan探针FAM 5' - TTGTTGATAAAACCCTTCCGGACCAGG - 3' BHQ1,采用普通PCR和实时荧光定量PCR,检测其特异性和灵敏度。结果 克隆出含GP 1 969～2 113 bp片段的阳性重组质粒pUC57 - GP,其浓度为97.75 ng/μl;以pUC57 - GP为标准品,制备标准曲线,拷贝数为103～109 copies/μL有较好线性关系,相关系数R2 = 0.999;能特异性检测扎伊尔型埃博拉病毒,而与I型登革病毒、寨卡病毒无交叉反应,其检测最低拷贝数达3.10×101copies/μl。 结论 建立了扎伊尔型埃博拉病毒荧光定量PCR快速检测技术,具有快速、灵敏、特异、定量检测等特点,可为埃博拉疫情的综合防控提供技术支撑。     

登革病毒实时荧光PCR快速检测技术研究

目的建立Taqman MGB实时荧光PCR技术快速检测登革病毒。方法利用Taqman MGB技术,根据登革病毒3′端非编码区的一段高度保守序列,设计登革1~4型荧光PCR通用引物和TaqmanMGB探针,以登革热毒株作为标准,以乙脑毒株作对照,建立实时荧光PCR检测登革病毒的快速方法。并对8份ELISA法检测阳性的临床血清标本进行RT-PCR及荧光PCR扩增。结果RT-PCR检测8份临床血清标本,2份阳性,阳性率为25%。实时荧光PCR检测登革病毒cDNA灵敏度为0.17pg/μl,病毒液灵敏度为10-5TCID50,与乙脑病毒无交叉反应,检测8份临床血清标本,5份阳性,阳性率为62.5%。从RNA提取到检测结果仅需4h。结论Taqman MGB实时PCR检测方法快速、敏感性高、特异性强,可作为登革病毒的快速检测方法,应用于登革热的临床早期诊断。