隐丹参酮通过抑制帽子依赖的翻译促进人肺癌细胞A549的凋亡

目的 探索隐丹参酮对人肺癌细胞A549中帽子依赖翻译的影响及帽子依赖翻译在隐丹参酮促A549细胞凋亡中的作用。方法 免疫印迹实验检测隐丹参酮对A549细胞中mTOR及4EBP1磷酸化的影响,随后通过m7GTP pull down实验检测隐丹参酮对A549细胞中eIF4F蛋白复合物形成的影响,最终通过免疫印迹实验、Annexin V和CCK8法检测敲低4EBP1表达前后隐丹参酮对A549细胞中抗凋亡蛋白Bcl-2表达、细胞凋亡和存活的影响。结果 隐丹参酮以剂量依赖的方式抑制A549细胞中mTOR及4EBP1的磷酸化、eIF4F蛋白复合物的形成和Bcl-2蛋白的表达。细胞凋亡分析发现,对照组中,隐丹参酮显著地诱导了A549细胞的凋亡[（4.68±0.77）% vs. （31.1±4.1）%, P<0.05],但敲低4EBP1的表达显著抑制了隐丹参酮的促凋亡作用[（31.1±4.1）% vs.（8.85±1.2）%, P<0.05]。CCK8法检测结果发现,隐丹参酮显著抑制了A549细胞的存活[（1±0.09）% vs.（0.43±0.05）%, P<0.05],但敲低4EBP1的表达拮抗了EMD638683的抑存活作用[（0.43±0.05）vs.（0.87±0.06）, P<0.05]。结论 隐丹参酮通过抑制mTOR激酶的活性抑制4EBP1磷酸化,从而抑制A549细胞中帽子依赖的翻译,进而抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表达诱发人肺癌细胞A549的凋亡。     

皂角刺总黄酮诱导结肠癌HCT116细胞凋亡的作用

目的研究皂角刺总黄酮对结肠癌HCT116细胞凋亡的诱导作用。方法应用CCK-8试剂盒检测皂角刺总黄酮对细胞增殖的影响,Hoechst33258荧光染色、透射电镜观察细胞凋亡的形态学变化,流式细胞仪Annexin V/PI双染法检测细胞的凋亡率。结果皂角刺总黄酮能够显著抑制HCT116细胞的增殖,随着药物浓度的增加,抑制作用明显增强,IC50为(104.72±0.96) mg/L。皂角刺总黄酮作用48h后,形态学观察可见HCT116细胞核固缩、碎裂和凋亡小体等凋亡特征。流式AnnexinV/PI双染法检测显示:不同浓度的皂角刺总黄酮均可诱导HCT116细胞凋亡,在100 mg/L时细胞凋亡率为（35.61±3.76）%。结论皂角刺总黄酮能明显诱导结肠癌HCT116细胞凋亡,抑制其增殖。     

蟾毒灵抑制人结肠癌HCT116细胞侵袭机制探讨

目的 肿瘤侵袭转移的发生是影响结肠癌治疗的重要原因,结肠癌细胞黏附能力的下降以及迁移能力的增强是促进结肠癌细胞侵袭转移的重要原因.有研究发现,蟾毒灵具有抑制结肠癌细胞侵袭能力的作用,但其作用机制尚不明确.本研究探讨蟾毒灵对人结肠癌HCT116细胞侵袭的影响,并探索其可能的作用机制.方法 用蟾毒灵溶液干预结肠癌HCT116细胞,采用细胞划痕实验与细胞黏附实验检测蟾毒灵溶液对结肠癌HCT116细胞侵袭能力的影响;ELISA法检测蟾毒灵溶液干预结肠癌HCT116细胞培养基中细胞外泌TGFβ1蛋白的含量;蛋白质印迹法检测蟾毒灵干预后结肠癌HCT116细胞中P-smad3、smad4和钙黏链蛋白(E-cadherin)表达的变化;免疫荧光实验检测蟾毒灵干预后各组HCT116细胞中P-smad3与smad4蛋白表达的变化.结果 细胞划痕实验结果显示,低、中、高剂量蟾毒灵均可降低HCT116细胞迁移能力;细胞黏附实验显示,对照组、低剂量组、中剂量组和高剂量组黏附细胞平均值分别为833.33±7.80、877.00±17.75、1 304.00±15.82和1 406.00±20.53,相对黏附率分别为100％、105.24％、156.48％和168.73％,差异有统计学意义,x2 =297.597,P＜0.001.ELISA检测结果显示,对照组、低、中和高剂量细胞培养液中转化生长因子β(transforming growth factor-β,TGFβ1)蛋白含量分别为(1 198.78±38.96)、(1 106.58±35.76)、(1 040.80±47.47)和(987.74±37.52) pg/mL,F=16.357,P=0.005.蛋白质印迹法检测结果显示,与对照组相比,中、高剂量蟾毒灵处理后HCT116细胞中P-smad3表达呈现明显下降;而smad4蛋白表达明显上调,组间差异有统计学意义,F=56.993,P＜0.001;低剂量蟾毒灵也可上调smad4蛋白的表达,t=5.342,P=0.006.各用药组HCT116细胞中E-cadherin蛋白的表达水平也随着蟾毒灵剂量的增加而增加,分别为对照组的2.514±0.385(t=4.833,P=0.008)、3.524±0.397(t=9.200,P=0.001)和3.937±0.318(t=10.675,P＜0.001)倍;免疫荧光法检测发现,蟾毒灵处理后结肠癌HCT116细胞中P-smad3与smad4蛋白的表达呈现出与蛋白质印迹法检测相似的趋势.结论 蟾毒灵可通过抑制TGFβ1/smad信号通路的信号传导抑制结肠癌HCT116细胞的侵袭.     

MTA1通过上调CK19促进结肠癌细胞HCT116的侵袭

目的探讨肿瘤转移相关因子1(MTA1)与细胞角蛋白19(CK19)在结肠癌中的表达及意义。方法选取80例结肠癌患者的结肠癌组织及癌旁组织标本,采用免疫组织化学法检测组织中MTA1及CK19的表达,分析两者在结肠癌组织中表达的相关性。采用慢病毒感染法、crispr基因编辑技术分别建立MTA1过表达及敲除MTA1的结肠癌HCT116细胞系及对应的对照细胞系(分别命名为HCT116MTA1、HCT116crMTA1、HCT116control 1、HCT116crMTA1control 2),利用RNA干扰技术、质粒转染法分别在HCT116MTA1、HCT116crMTA1细胞中敲降、过表达CK19,并构建对照细胞系(分别命名为HCT116MTA1siCK19、HCT116crMTA1CK19、HCT116MTA1control、HCT116crMTA1control)。通过Transwell侵袭实验检测MTA1、CK19表达的改变对细胞侵袭能力的影响。利用c BioPortal数据分析平台筛选与MTA1和CK19表达均相关的基因,对所获得的基因集进行功能富集分析。结果结肠癌组织中MTA1、CK19评分均明显高于癌旁组织,差异均有统计学意义(P<0.01)。MTA1与CK19在结肠癌组织中表达呈显著正相关(r=0.490,P<0.01);在MTA1过表达的HCT116MTA1细胞中CK19表达上调,而在敲除MTA1的HCT116crMTA1细胞中CK19表达下调。与MTA1和CK19表达均相关的基因富集在细胞黏附、m RNA剪接、细胞代谢、蛋白质合成等过程。结论MTA1与CK19在结肠癌组织中表达呈正相关,MTA1可通过上调CK19表达促进结肠癌细胞HCT116的侵袭。     

miR-637抑制结肠癌HCT116细胞生长和迁移的机制研究

目的:分析miR-637对结肠癌HCT116细胞生长和迁移的影响。方法:分别构建miR-637过表达或者低表达的结肠癌HCT116细胞系。通过MTT方法检测miR-637对细胞增殖的作用,PI（propidium iodide）染色检测miR-637对细胞周期的影响,Annexin V-FITC/PI染色检测miR-637对细胞凋亡的作用。Western blot检测miR-637对细胞中CDK4和Bcl-2的影响。Transwell实验检测miR-637对细胞迁移的作用,进一步通过Western blot检测miR-637对细胞中MMP2的影响。结果:miR-637抑制HCT116细胞的增殖,抑制G1/S期进程,促进细胞凋亡,Western blot结果显示,miR-637抑制CDK4和Bcl-2在HCT116细胞中的表达。Transwell实验指出,miR-637抑制细胞的迁移,Western blot结果指出miR-637抑制MMP2在HCT116细胞中的表达。结论:miR-637可以通过抑制CDK4、Bcl-2和MMP2的表达抑制HCT116细胞的生长和迁移。     

新藤黄酸诱导人结肠癌HCT116细胞凋亡的作用机制研究

目的:探讨新藤黄酸诱导人结肠癌HCT116细胞凋亡的作用及其可能的分子机制。方法:采用MTT法检测新藤黄酸对人结肠癌HCT116细胞增殖的抑制作用;DAPI染色及荧光显微镜观察细胞凋亡情况;FCM法检测细胞周期分布;蛋白质印迹法检测新藤黄酸对cyclin D1、cyclin E、P21、P27和多聚ADP核糖聚合酶[poly(ADP-ribose)polymerase,PARP]蛋白表达的影响。结果:新藤黄酸对HCT116细胞增殖有明显的抑制作用,并呈浓度和时间依赖性。DAPI染色后荧光显微镜观察发现,新藤黄酸能明显诱导HCT116细胞凋亡。FCM法检测发现,新藤黄酸可以使HCT116细胞G0/G1期比例显著升高,S期比例相应降低,表明细胞周期阻滞于G0/G1期。蛋白质印迹法检测结果表明,新藤黄酸下调了细胞周期蛋白cyclin D1和cyclin E的表达,上调了P21和P27的蛋白表达,诱导了PARP蛋白的剪切。结论:新藤黄酸通过下调细胞周期蛋白cyclin D1、cyclin E的表达和上调P21、P27的表达,使HCT116细胞阻滞在G0/G1期,进而显著抑制HCT116细胞的增殖,并诱导其凋亡。     

斑蝥酸钠对结肠癌HCT116细胞凋亡及PUMA表达的影响

目的 探讨斑蝥酸钠对结肠癌细胞凋亡及p53上调凋亡控制因子（PUMA）表达的影响。方法 采用不同浓度斑蝥酸钠（0.1、0.25、0.5、1、2 μg／ml）处理结肠癌细胞HCT116 24 h,并设不加药对照组。测量其单层细胞跨膜电阻值（TER）以评价斑蝥酸钠对HCT116细胞凋亡的影响,同时采用实时荧光定量PCR和Western blotting分别检测HCT116细胞的PUMA mRNA和蛋白水平变化;HCT116细胞经0.05、0.1、0.2、0.4、0.8 μg／ml 抑制性κB激酶β（IKKβ）质粒转染或10、20、40、80 nmol／L 核因子（NF）-κB抑制剂（BAY 11-7082）处理后,采用Western blotting检测其PUMA蛋白水平。结果 与对照组比较,各浓度斑蝥酸钠处理后HCT116细胞的TER降低,PUMA mRNA和蛋白水平升高,且以上效应呈浓度依赖性,差异有统计学意义（P＜0.05）;与未处理的HCT116细胞相比,IKKβ质粒转染后,PUMA蛋白表达增加,而BAY 11-7082可降低斑蝥酸钠对PUMA的上调作用,差异有统计学意义（P＜0.05）。结论 斑蝥酸钠可通过NF-κB通路上调PUMA的表达,进一步诱导结肠癌细胞HCT116的凋亡。     

地塞米松诱导结肠癌细胞凋亡的机制研究

目的：探讨地塞米松（Ｄｅｘ）体外抑制结肠癌细胞株的增殖并诱导其凋亡的作用机制。方法：采用ＭＴＴ及流式细胞仪检测细胞增殖抑制及凋亡,ＲＴ-ＰＣＲ检测ＧＲ、ＩκＢ及Ｂcl-２的表达改变,凝胶迁移或电泳迁移率实验（ＥＭＳＡ）检测Ｄｅｘ作用过程中的ＮＦ-κＢ活性改变。结果：Ｄｅｘ体外作用后,对４种结肠癌细胞株ＬｏＶｏ、ＨＣＴ-１１６、ＨＴ-２９及ＳＷ-４８０均有抑制作用,ＬｏＶｏ和ＨＣＴ-１１６细胞作用最显著。流式细胞仪检测显示,Ｄｅｘ（１×１０^-4mol/L）诱导７２ｈ后,在ＬｏＶｏ和ＨＣＴ-１１６细胞检测到细胞凋亡和坏死峰,明显高于未加Ｄｅｘ的对照组,具有显著性差异。ＲＴ ＰＣＲ检测显示Ｄｅｘ作用后ＧＲα、ＩκＢ表达升高,Ｂｃｌ-２无明显改变,ＥＭＳＡ结果也显示ＮＦ-κＢ活性明显降低。结论：地塞米松可能通过上调ＧＲα、ＩκＢ表达,抑制ＮＦ-κＢ活性来抑制ＬｏＶｏ细胞的增殖,并诱导其凋亡。     

Musashi1基因调控结肠癌HCT116细胞恶性生物学行为的机制研究

背景与目的：Musashi1（Msi1）属于RNA结合蛋白家族中的一员,是RNA转录后表达的关键调控者,其是否参与肿瘤的发生、发展,以及具体分子机制仍不十分清楚。探讨沉默Msi1基因对结肠癌HCT116细胞恶性生物学行为的影响及可能的机制。方法：采用慢病毒载体构建稳定低表达Msi1的细胞株,细胞计数试剂盒（cell counting kit-8,CCK-8）实验检测细胞增殖能力,克隆形成实验检测细胞克隆形成能力,流式细胞术（flow cytometry,FCM）检测细胞周期的变化,裸鼠移植瘤模型观察沉默Msi1对裸鼠成瘤的影响。实时荧光定量聚合酶链反应（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,RTFQ-PCR）和蛋白质印记法（Western blot）检测沉默Msi1基因后p27基因的mRNA表达和蛋白水平,双荧光素酶实验验证Msi1基因与目的基因p27 3’-非编码区（3’-untranslated region,3’-UTR）的相互作用。结果：沉默Msi1基因后,HCT116细胞的增殖能力显著下降,克隆集落数明显减少,G ₀ /G ₁ 期细胞增多,S期细胞明显减少,裸鼠移植瘤生长明显受到抑制。沉默Msi1基因后p27 mRNA表达未见明显变化,而p27蛋白水平明显上调,双荧光素酶实验证实Msi1基因能与p27 3’-UTR区域直接结合,抑制其翻译。结论：沉默Msi1基因通过靶向上调p27,导致结肠癌HCT116细胞G ₀ /G ₁ 期阻滞,从而抑制肿瘤细胞体内及体外增殖能力。     

番茄红素诱导人结肠癌SW480细胞凋亡的作用机制

目的探讨番茄红素诱导人结肠癌SW480细胞凋亡的分子机制。方法体外培养SW480细胞,采用MTT比色实验、流式细胞术、RT-PCR和Westernblot方法,分析番茄红素对SW480细胞的生长增殖作用、对细胞凋亡率的影响及对细胞凋亡相关分子Bcl-2、Bax、Caspase-9和Caspase-3表达的影响。结果MTT法显示,番茄红素能显著抑制SW480细胞的生长增殖能力,且呈一定的量效与时效关系,24 h的半数抑制浓度(IC50)为1.0 μmol/L;流式细胞仪分析表明,番茄红素呈浓度依赖性诱导SW480细胞凋亡;RT-PCR或Western blot分析表明,SW480细胞经不同浓度番茄红素诱导后,与溶媒组相比,Bcl-2表达逐渐减弱,而Bax,Caspase-9和Caspase-3表达逐渐增强,Bcl-2/Bax比值降低。结论番茄红素对SW480细胞的抑制增殖作用,可能与降低Bcl-2/Bax比值、增加Caspase-9和Caspase-3蛋白表达、诱导细胞凋亡有关。     

Deregulation of cap-dependent mRNA translation increases tumour radiosensitivity through reduction of the hypoxic fraction

Background and purpose

Tumour hypoxia is an important limiting factor in the successful treatment of cancer. Adaptation to hypoxia includes inhibition of mTOR, causing scavenging of eukaryotic initiation factor 4E (eIF4E), the rate-limiting factor for cap-dependent translation. The aim of this study was to determine the effect of preventing mTOR-dependent translation inhibition on hypoxic cell survival and tumour sensitivity towards irradiation.

Material and methods

The effect of eIF4E-overexpression on cell proliferation, hypoxia-tolerance, and radiation sensitivity was assessed using isogenic, inducible U373 and HCT116 cells.

Results

We found that eIF4E-overexpression significantly enhanced proliferation of cells under normal conditions, but not during hypoxia, caused by increased cell death during hypoxia. Furthermore, eIF4E-overexpression stimulated overall rates of tumour growth, but resulted in selective loss of hypoxic cells in established tumours and increased levels of necrosis. This markedly increased overall tumour sensitivity to irradiation.

Conclusions

Our results demonstrate that hypoxia induced inhibition of translational control through regulation of eIF4E is an important mediator of hypoxia tolerance and radioresistance of tumours. These data also demonstrate that deregulation of metabolic pathways such as mTOR can influence the proliferation and survival of tumour cells experiencing metabolic stress in opposite ways of nutrient replete cells.     

下调PRPS2基因表达对HCT116细胞增殖和凋亡的影响

目的:探讨下调磷酸核糖焦磷酸合成酶亚基II(PRPS2)基因表达对人结肠癌HCT116细胞增殖和凋亡的影响。方法:构建PRPS2基因干扰载体sh-PRPS2,正常对照组不转染载体,阴性对照组转染阴性对照载体sh-PRPS2-0,3个实验组分别转染干扰载体sh-PRPS2-1、sh-PRPS2-2和sh-PRPS2-3,经DNA测序鉴定后转染人结肠癌HCT116细胞,分别采用RT-PCR和Western blot法检测各载体转染后细胞PRPS2 mRNA和蛋白水平的表达变化,CCK8试剂盒检测细胞增殖能力,流式细胞术检测细胞周期及凋亡的变化。结果:经DNA测序证实成功构建sh-PRPS2干扰载体3个,分别为sh-PRPS2-1、sh-PRPS2-2和sh-PRPS2-3。将上述3个干扰载体分别转染HCT116细胞72 h后,RT-PCR结果显示,PRPS2 mRNA相对表达量依次为0.61±0.03、0.89±0.02、0.27±0.05,与对照组比较,均显著下降(P<0.05)。Western blot结果显示,PRPS2蛋白相对表达量依次为0.37±0.06、0.84±0.05、0.30±0.04,与对照组比较均显著下降(P<0.05)。转染sh-PRPS2-3载体72 h后细胞增殖抑制率达19.8%±2.4%,凋亡率上升至68.4%±4.6%,G0/G1期细胞比例上升为12.9%±3.8%。结论:PRPS2的低表达可以有效抑制细胞增殖,促进细胞凋亡,细胞阻滞于G0/G1期,本研究为肿瘤的靶向治疗提供了研究基础。     

硫氧还蛋白相互作用蛋白通过抑制自噬途径促进结肠腺癌细胞的凋亡

目的:探究过表达硫氧还蛋白相互作用蛋白（thioredoxin interacting protein,TXNIP）对结肠腺癌细胞凋亡的影响及其机制。方法:收集我院30例结肠腺癌患者的结肠腺癌组织及癌旁组织,实时荧光定量PCR检测组织中TXNIP mRNA表达,免疫组织化学染色检测组织中自噬标志蛋白LC3-Ⅱ与凋亡标志蛋白Cleaved Caspase-3表达;将人结肠腺癌 LoVo细胞随机分为对照组、阴性空载体组（LV-GFP）和 TXNIP 过表达组（LV-GFP-TXNIP）,倒置荧光显微镜下观察细胞转染效率,收集转染72 h后的LoVo细胞,通过流式细胞术检测细胞凋亡,透射电子显微镜观察细胞自噬情况,免疫荧光染色检测细胞中LC3表达,Western blot 检测细胞中自噬相关蛋白与凋亡相关蛋白表达变化。结果:与癌旁组织比较,结肠腺癌组织中TXNIP mRNA相对表达量显著降低（P＜0.01）,LC3-Ⅱ阳性表达率显著升高（P＜0.05）,Cleaved Caspase-3阳性表达率显著降低（P＜0.05）;慢病毒转染72 h后转染效率较高（P＜0.05）;与对照组比较,LV-GFP-TXNIP组LoVo细胞的凋亡率显著增加（P＜0.05）,细胞质较为致密,自噬体数目明显减少,LC3荧光染色减弱,Beclin-1、LC3-Ⅱ蛋白表达显著下降（P＜0.05）,而LC3-I、p62蛋白表达显著增加（P＜0.05）,同时,Bax、Cleaved Caspase-3蛋白表达显著增加（P＜0.05）,Bcl-2蛋白表达显著下降（P＜0.05）。结论:在结肠腺癌细胞中过表达TXNIP可通过抑制自噬来促进细胞凋亡。     

辛二酰苯胺异羟肟酸对结肠癌HCT116和SW480细胞增殖、周期和凋亡的影响

目的:研究辛二酰苯胺异羟肟酸(suberoylanilide hydroxamic acid,SAHA)对结肠癌细胞系HCT116和SW480增殖、周期和凋亡的影响,并对其分子作用机制进行初步探讨.方法:将不同浓度SAHA分别处理结肠癌HCT116和SW480细胞后,MTT法检测SAHA对HCT116和SW480细胞增殖的影响,流式细胞仪检测HCT116和SW480细胞周期和细胞凋亡率,罗丹明(rhodamine) 123和二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)法检测HCT116和SW480细胞线粒体跨膜电位(Aψm)和活性氧(ROS)水平,Real-time PCR和Western blotting法检测乙酰化组蛋白3(Ac-H3)、p21、CyclinD1、Bax和Bcl-2的mRNA和蛋白的表达水平.结果:SAHA作用于HCT116和SW480细胞48 h后,细胞增殖被抑制、细胞周期G1期比率升高、凋亡率升高(均P＜0.05),线粒体跨膜电位显著下降、细胞内ROS产生增多(均P＜0.05).与对照组比较,SAHA处理组p21和Bax mRNA增多、Cyclin D1和Bcl-2 mRNA表达量减少(均P＜0.05),相关蛋白Ac-H3、p21和Bax增多,CyclinD1和Bcl-2减少(均P＜0.05).结论:SAHA抑制结肠癌HCT116和SW480细胞增殖、阻滞细胞周期并诱导细胞凋亡,其机可能与调节p21、CyclinD1和Bcl-2家族基因的表达、促进组蛋白乙酰化有关.